Summary

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

Published: July 11, 2017
doi:

Summary

この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。

Abstract

我々は、脊髄ニューロンの単離および培養のためのプロトコールを提示する。ニューロンは、新生児C57BL / 6マウスから得られ、生後1〜3日に単離される。通常、1匹の繁殖対から生まれた4〜10匹の仔マウスを1回の実験で集め、イソフルランで安楽死させた後、各マウスから脊髄を個別に採取する。脊柱を切開し、次いで脊髄を柱から解放する。次いで、ニューロンおよび他の細胞が組織から放出されることを可能にする酵素的プロテアーゼの送達の表面積を増加させるために、脊髄を細かく切り刻む。次いで、粉砕を用いて細胞を溶液に放出する。その後、この溶液を密度勾配で分画して、溶液中の様々な細胞を分離し、ニューロンを単離することができるようにする。約1-2.5×10 6個のニューロンを1つの繁殖群から単離することができる。次いで、ニューロンを接着剤でコーティングされたウェル上に播種する適切な成長および成熟を可能にするrs。ニューロンは、成長および培養培地中で成熟に達するまでに約7日を要し、その後、治療および分析のために使用することができる。

Introduction

脊髄の病理を理解するには、巨視的レベルと顕微鏡レベルの両方で、様々なモデルを使用する必要があります。大小の動物モデル1,2,3は 脊髄疾患および傷害のインビボ研究のため使用される。 インビボでこれらの問題を研究することにはメリットがありますが、脊髄の解析は全脊髄ホモジネートまたは組織切片4に限定されます。これは、居住ニューロンおよび周囲グリアの間で脊髄における特定の応答および標的を分離しようとするときに、あいまいさを生じる。遺伝的に操作されたマウスの利用可能性の増加は、細胞レベルおよび分子レベルでの生物学のより詳細な調査を可能にする。したがって、ここでは新生仔マウスモデルが使用され、 インビトロでの脊髄ニューロンの固有の特性および生物学の研究が可能になる。

in vitroでのニューロンの単離と維持は特に簡単ではない大人のげっ歯類の皮質組織からのニューロンの単離のための技術が比較的豊富にあり、それは相当数の単離されたニューロン( すなわち数百万個)これとは対照的に、脊髄組織からのニューロンの収量は、組織の質量がより少ないために、部分的に8,9,10よりも低い。さらに、マウスでは、新生児の単離のための技術が相対的に不足している脊髄ニューロン、および既存の方法は、より低いニューロン収量( すなわち数百)または胚性マウスの単離を必要とする手間と資源重い技術によって制限される10

このプロトコルでは、新生児マウスの脊髄からかなりの数のニューロンをコスト効率的かつリソース効率的に単離できる技術を使用する。以前に発表された技術でよく見られるように、我々は酵素プロテアーゼとしてパパインを使用し、脊髄組織からのニューロンの放出を可能にする。さらに、精製された細胞の分離には濃度勾配を使用していますが、これは以前は効果的であることが示されています6,10。細胞が培養される培地は様々であり得るが、我々の経験およびこれまでに公開された11のように 、新鮮なB27培地補充物はニューロンの寿命にとって重要であることが証明されている。ニューロンは、典型的には10日間まで生存可能であり、治療を行うことを可能にする。

Protocol

この手技における動物のケアおよび治療は、コロラド大学の動物実験および使用委員会のガイドラインに従って行われた。 1.ソリューションの準備 表1に示すように、すべての溶液を適切な温度で調製して保管します。 2.コーティングウェルとスライド注:ニューロンはプラスチックやガラスの表面には?…

Representative Results

この技術を用いて、1匹のリター(4〜10匹の仔)は、培養プレートへの播種に適した1-2.5×10 6個のニューロンの単離を可能にする。典型的には、4〜8ウェルを上記の濃度( すなわち 300,000細胞/ mL)で播種する。 図3は低倍率( a )および高倍率( b )倍率の光学顕微鏡で培養して1週間後のこの濃度でのニュ?…

Discussion

この技術は、脊髄ニューロンの信頼できる培養を可能にする。技能の習熟度が達成されると、完了するまでに約3.5時間かかります。我々は、約4時間で2匹の別個の同腹仔(合計16匹のマウス)からニューロンの単離を行うことができた。実行可能性の重要なステップは、マウスから脊髄を巧みに抽出することができることです。歩留まりは、いくつかのウェルをメッキすること、および様々な…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者には謝辞はありません。

Materials

Hibernate A Medium – 500 mL Thermo-Fisher A1247501 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501
Hibernate A Minus Calcium – 500 mL Brainbits HA-Ca http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/
Glutamax 100X – 100 mL Thermo-Fisher 35050061 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079
B27 Supplement 50X – 10 mL Thermo-Fisher 17504044 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044
Papain, Lyophilized – 100 mg Worthington LS003119 http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html
Neurobasal A Medium – 500 mL Thermo-Fisher 10888022 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg Sigma-Aldrich P6407-5MG http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en&region=US
Mouse Laminin – 1 mg Thermo-Fisher 23017015 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015
Trypan Blue – 20 mL Sigma-Aldrich T8154-20ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en&region=US
OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL Sigma-Aldrich D1556-250ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en&region=US
Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) Sigma-Aldrich 440272-100ML http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en&region=US
Chloroform Sigma-Aldrich 288306-1L http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=US
Glass Pippette – 9" Sigma-Aldrich 13-678-20C http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en&region=US
Pipette bulb – 5 mL Sigma-Aldrich Z186678-3EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en&region=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1
BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm Sigma-Aldrich BR455717-10EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en&region=US
Sterile 24 Well Cell Culture Plate Sigma-Aldrich M8812-100EA http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en&region=US
Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) Fischer Scientific 02-671-6 https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716
Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated Neuvitro GG-12-1.5-Pre http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm
NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL Abcam ab177487 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C
MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL Abcam ab11267 After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C

References

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Cite This Article
Eldeiry, M., Yamanaka, K., Reece, T. B., Aftab, M. Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (125), e55856, doi:10.3791/55856 (2017).

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