Summary

Le sauvetage et la caractérisation du virus recombinant à partir d'un nouveau clone infectieux du virus Zika du monde

Published: June 07, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit la récupération du virus Zika infectieux à partir d'un clone d'ADNc infectieux à deux plasmides.

Abstract

Les clones d'ADNc infectieux permettent une manipulation génétique d'un virus, facilitant ainsi le travail sur les vaccins, la pathogenèse, la replication, la transmission et l'évolution virale. Nous décrivons ici la construction d'un clone infectieux pour le virus Zika (ZIKV), qui provoque actuellement une épidémie explosive dans les Amériques. Pour éviter toute toxicité pour les bactéries qui sont communément observées avec les plasmides dérivés du flavivirus, nous avons généré un système à deux plasmides qui sépare le génome du gène NS1 et est plus stable que les constructions complètes qui ne peuvent pas être récupérées avec succès sans mutations. Après la digestion et la ligature pour rejoindre les deux fragments, l'ARN viral complet peut être généré par une transcription in vitro avec de l'ARN polymérase T7. Après l'électroporation de l'ARN transcrit dans les cellules, le virus a été récupéré qui a montré une cinétique de croissance in vitro similaire et des phénotypes de virulence et d'infection in vivo chez les souris et les moustiques, respectivement.

Introduction

Le virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genre Flavivirus ) est un flavivirus transmis par des moustiques qui est arrivé au Brésil en 2013-14 et a ensuite été associé à une épidémie massive de maladie fébrile qui s'est répandue dans les Amériques 1 . En outre, le ZIKV a été lié à des résultats sévères liés à la maladie, tels que le syndrome de Guillain-Barré chez les adultes et la microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés 2 . On savait peu à propos de ZIKV avant sa propagation rapide dans l'hémisphère occidental. Cela comprenait un manque d'outils moléculaires, entravant ainsi la recherche mécanique. Les outils moléculaires pour les virus, tels que les clones d'ADNc infectieux, facilitent le développement thérapeutique des vaccins et des antiviraux et permettent l'évaluation des facteurs génétiques viraux liés à la pathogenèse virale différentielle, à la réponse immunitaire et à l'évolution virale.

Les clones infectieux de Flavivirus sont connus pour être très instables dans les bactéries en raison de crLes promoteurs procaryotes yptiques présents dans leurs génomes 3 . Plusieurs approches ont été utilisées pour améliorer ce problème; Y compris l'insertion de répétitions en tandem en amont des séquences virales 4 , la mutation des séquences promoteurs procaryotes putatives 5 , le fractionnement du génome dans de multiples plasmides 6 , des vecteurs numériques à faible copie (y compris les chromosomes artificiels bactériens) 7 , 8 et l'insertion d'introns dans le génome viral 9 . Un système complet sans modifications a été décrit pour ZIKV; Cependant, ce clone semble être atténué dans la culture cellulaire et chez la souris 10 . D'autres groupes ont incorporé des introns dans le génome de ZIKV, permettant une perturbation de séquences instables dans des bactéries qui peuvent être épissées dans des cellules de mammifères in vitro pour la production de virus infectieux 11, 12 . En outre, un système basé sur la PCR intitulé Infectious-Subgenomic-Amplicons a été utilisé avec succès pour sauver le prototype de souche MR766 de ZIKV 13 . L'approche décrite ici ne nécessite pas de séquences étrangères, mais perturbe le génome dans la région d'une forte instabilité en utilisant de multiples plasmides, qui ont déjà été utilisés avec succès avec la fièvre jaune 6 , la dengue 14 , 15 et le virus du Nil occidental 16 . En outre, l'addition de la séquence de ribozyme de l'hépatite D au niveau de la terminaison génomique virale facilite la création d'une fin authentique 3 'sans avoir besoin d'ajouter un site de linéarisation. En outre, les deux plasmides sont construits dans un vecteur à nombre de copies faible (pACYC177, ~ 15 copies par cellule) pour atténuer toute toxicité résiduelle 17 . Le virus récupéré affiche un profil de croissance comparable àVirus parental dans les courbes de croissance in vitro dans 8 lignées cellulaires comprenant une variété de types de cellules dérivées à la fois de mammifères et d'insectes et a présenté des profils pathogènes identiques chez la souris et les taux d'infection, de diffusion et de transmission chez les moustiques 18 .

Dans ce document, nous détaillons un protocole décrivant comment développer les plasmides de clones infectieux, générer de l'ARN viral complet (le génome viral) in vitro et récupérer le virus infectieux dans la culture cellulaire. Tout d'abord, nous décrivons la propagation de plasmides dans des bactéries ou une amplification sans bactéries à l'aide de l'amplification du cercle circulant (RCA). Ensuite, nous montrons comment les deux plasmides sont digérés puis ensuite ligaturés ensemble pour générer des virus complets. Enfin, nous décrivons la production de l'ARN transcrit et son électroporation subséquente dans les cellules Vero, suivi du titrage du virus récupéré ( Figure 1 ). L'approche décrite est rapide, ce qui permetR récupération des stocks de virus infectieux en 1-2 semaines.

Protocol

1. Transformer et récupérer des plasmides de clones infectieux Transformez les deux plasmides (séparément) en utilisant un protocole de transformation commercial ( p. Ex . NEB 5 Minute Transformation Protocol) avec quelques modifications. Les deux plasmides contiennent un gène codant pour la résistance à l'ampicilline, utilisent donc l'ampicilline ou la carbénicilline pour la sélection. La carbénicilline est préférée, car elle est plus stable. Enlevez le…

Representative Results

Le protocole décrit ici permet la récupération du virus infectieux dérivé du clone Zika. La manipulation du système de clones infectieux à deux plasmides est simple lorsqu'ils sont exécutés avec précaution, par rapport aux versions intégrales très instables (données non représentées). Après la digestion et la ligature des deux pièces distinctes, l'ARN coiffé est produit en utilisant une transcription in vitro avec une polymerase T7 qui est ensu…

Discussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic et Claudia Rückert pour leur aide dans la caractérisation du virus dérivé du clone. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l'Institut national d'allergie et de maladies infectieuses, NIH sous les subventions AI114675 (BJG) et AI067380 (GDE).

Materials

NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
Vero cells ATCC CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
Petri Dish Celltreat 229693
Culture Tubes VWR International 60818-576
T75 flasks Celltreat 229340
T182 flasks Celltreat 229350
1x PBS Corning 21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
Crystal Violet Amresco 0528-1006
Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
6 well plate Celltreat 229106
12 well plate Celltreat 229111
Sequencing Oligos IDT see table 1
Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

References

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Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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