Summary

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Published: June 07, 2017
doi:

Summary

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。

Abstract

感染性cDNAクローンは、ウイルスの遺伝子操作を可能にし、したがって、ワクチン、病原性、複製、伝達およびウイルスの進化に関する作業を容易にする。ここでは、アメリカで爆発的な流行を引き起こしているZikaウイルス(ZIKV)の感染クローンの構築について説明します。フラビウイルス由来のプラスミドでよく見られる細菌への毒性を防ぐために、我々はNS1遺伝子のゲノムを分離し、突然変異を伴わずに正常に回収できなかった完全長構築物よりも安定な2プラスミドシステムを作製した。 2つの断片を連結する消化およびライゲーションの後、全長ウイルスRNAを、T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成することができる。転写されたRNAの細胞への電気穿孔の後、同様のインビトロでの増殖速度およびインビボでの病原性および感染表現型をマウスおよび蚊でそれぞれ示したウイルスが回収された。

Introduction

Zikaウイルス(ZIKV; Family FlaviviridaeFlavivirus属)は、2013-14年にブラジルに到着した蚊媒介性フラビウイルスであり、以後、アメリカ全土に広がった熱性疾患の大規模な発生に関連してます1 。さらに、ZIKVは、成人のギラン・バレー症候群や胎児や新生児の小頭症などの重篤な疾患の結果と関連している2 。西半球で急速に普及する前はZIKVについてほとんど知られていなかった。これには分子ツールの欠如が含まれており、したがって機構的研究が妨げられている。感染性cDNAクローンなどのウイルスのための分子ツールは、ワクチンおよび抗ウイルス治療の開発を容易にし、差別的ウイルス病原性、免疫応答およびウイルスの進化に関連するウイルス遺伝因子の評価を可能にする。

フラビウイルスの感染性クローンは、crのため細菌中で非常に不安定であることが知られているそれらのゲノムに存在する恒温性原核生物プロモーター3 。この問題を改善するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。ゲノムを複数のプラスミド6に分割すること、低コピー数のベクター(細菌人工染色体を含む) 7,8およびウイルスゲノム9にイントロンを挿入することを含む、ウイルスゲノム9の上流にタンデムリピートの挿入を含む。 ZIKVについては、変更のない1つの全長システムが記載されている。しかし、このクローンは細胞培養およびマウスにおいて弱毒化されているようであった10 。他のグループは、イントロンをZIKVゲノムに組み込んで、インビトロで感染性ウイルス11の産生のために哺乳類細胞スプライシングされ得る細菌中の不安定な配列の破壊を可能にする 12 。さらに、感染性サブゲノム – アンプリコンと命名されたPCRベースのシステムは、ZIKV 13の原型MR766株を救済するために首尾よく使用されている。ここに記載されているアプローチは外来配列を必要とせず、以前は黄熱病6 、デング14,15および西ナイルウイルス16で成功裡に使用されている複数のプラスミドを使用することによって、不安定性の高い領域でゲノムを破壊する。さらに、ウイルスゲノム末端でのD型肝炎リボザイム配列の付加は、線状化部位の追加を必要とせずに本物の3 '末端の作製を容易にする。さらに、両方のプラスミドは、低コピー数ベクター(pACYC177、1細胞あたり約15コピー)で構築され、残留毒性を軽減する17 。回収されたウイルスは、哺乳動物および昆虫の両方から誘導された様々な細胞型を含む8細胞株におけるインビトロ増殖曲線における親ウイルスであり 、マウスにおいて同一の病原性プロファイルおよび蚊における感染、播種および感染率を示した18

本明細書では、感染性クローンプラスミドを増殖させ、インビトロで全長ウイルスRNA(ウイルスゲノム)を生成 、細胞培養で感染性ウイルスを回収する方法を記載するプロトコルを詳述する。まず、バクテリアにおけるプラスミドの増殖またはローリングサークル増幅(RCA)を用いた無細菌増幅について説明する。次に、2つのプラスミドがどのように消化され、続いて完全な長さのウイルスを生成するために一緒に連結されるかを示す。最後に、転写されたRNAの産生およびその後のVero細胞への電気穿孔、続いて回収されたウイルスの滴定( 図1 )について説明する。説明されたアプローチは迅速であり、fo1〜2週間で感染性ウイルス株を回収する。

Protocol

感染性クローンプラスミドの形質転換および回収 いくつかの改変を加えた市販の形質転換プロトコール( 例えば 、NEB 5分形質転換プロトコル)を用いて両方のプラスミド(別々に)を形質転換する。どちらのプラスミドもアンピシリン耐性をコードする遺伝子を含んでいるため、選択のためにアンピシリンまたはカルベニシリンを使用する。より安定であるので、カル?…

Representative Results

ここに記載されたプロトコルは、感染性クローン由来Zikaウイルスの回収を可能にする。非常に不安定な全長バージョン(データは示されていない)と比較して、2プラスミドの感染性クローンシステムを操作することは、慎重に行う場合には容易である。 2つの別個の断片の消化およびライゲーションの後、T7ポリメラーゼによるインビトロ転写を用いてキャッ?…

Discussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、クローン由来ウイルスの特徴づけを支援してくれたKristen Bullard-Feibelman、Milena Veselinovic、ClaudiaRückertに感謝したいと思います。この研究は、NIHのAI114675(BJG)およびAI067380(GDE)の下での国立アレルギーおよび感染症研究所の助成によって部分的に支持された。

Materials

NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
Vero cells ATCC CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
Petri Dish Celltreat 229693
Culture Tubes VWR International 60818-576
T75 flasks Celltreat 229340
T182 flasks Celltreat 229350
1x PBS Corning 21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
Crystal Violet Amresco 0528-1006
Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
6 well plate Celltreat 229106
12 well plate Celltreat 229111
Sequencing Oligos IDT see table 1
Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

References

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Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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