פרוטוקול זה מתאר את ההתאוששות של וירוס זיהום זיהומיות משני שיבוט cDNA שני פלסמיד זיהומיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיבוטים cDNA זיהומיות לאפשר מניפולציה גנטית של הנגיף, ובכך להקל על עבודה על חיסונים, פתוגנזה, שכפול, שידור האבולוציה ויראלי. כאן אנו מתארים את הבנייה של שיבוט זיהומיות עבור Zika וירוס (ZIKV), אשר כרגע גורם להתפרצות נפץ באמריקה. כדי למנוע רעילות לחיידקים, כי הוא נצפה בדרך כלל עם פלסמידים הנגזרים flavivirus, יצרנו מערכת שני פלסמיד המפריד בין הגנום בגן NS1 והוא יציב יותר מאשר באורך מלא בונה שלא ניתן לשחזר בהצלחה ללא מוטציות. לאחר עיכול קשירת להצטרף שני קטעים, RNA ויראלי באורך מלא יכול להיווצר על ידי שעתוק במבחנה עם פולימרז T7 RNA. בעקבות electroporation של RNA transcribed לתאים, וירוס היה התאושש כי הציג דומה קינטיקה הצמיחה במבחנה ב vivo ארסיות פנוטיפים זיהום בעכברים ויתושים, בהתאמה.
מבוא
נגיף זיקה (ZIKV: משפחה Flaviviridae : Genus Flavivirus ) הוא flavivirus שנולדו יתוש שהגיע בברזיל ב 2013-14 ו היה קשור לאחר מכן עם התפרצות מסיבית של מחלה חום כי התפשטה ברחבי אמריקה 1 . בנוסף, ZIKV נקשר לתוצאות חמורות של המחלה, כגון תסמונת Guillain-Barré במבוגרים ו מיקרוסקפליה בעוברים ובילודים. מעט ידוע על ZIKV לפני התפשטותה המהירה בחצי הכדור המערבי. זה כלל היעדר כלים מולקולריים, ובכך מעכב מחקר מכניסטי. כלים מולקולריים לווירוסים, כגון שיבוטים cDNA זיהומיות, להקל על החיסון ועל התפתחות טיפולית אנטי ויראלית, ולאפשר הערכה של גורמים גנטיים ויראליים הקשורים פתוגנזה ויראלי דיפרנציאלי, ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. המרה ושחזור של פלסמידים משוכפלים זיהומיות
- להפוך את שני פלסמידים (בנפרד) באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה מסחרית ( למשל , פרוטוקול שינוי 5 דקות NEB) עם כמה שינויים. שני פלסמידים מכילים קידוד גנים עבור עמידות ampicillin, ולכן להשתמש ampicillin או carbenicillin לבחירה. Carbenicillin הוא העדיף, כפי שהוא יציב יותר.
- הסרת תאים (ראה טבלת חומרים) מ -80 ° C מקפיא להפשיר על הקרח במשך 5-10 דקות. מרק ליזוגני מוקדם (LB) (המכיל 10 גרם / L Na....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פרוטוקול המתואר כאן מאפשר התאוששות של זיהום נגוע נגוע זיקה וירוס. מניפולציה של שני מערכת פלסמיד שיבוט זיהומיות היא פשוטה כאשר מבוצעת בזהירות, לעומת גירסאות באורך מלא, שהם מאוד לא יציבים (נתונים לא מוצגים). לאחר עיכול קשירת של שתי חתיכות נפרדות, כתרים CNA מיוצר באמצעות שעתוק במבחנה עם פולימראז T7 אשר לאחר מכן electroporated לתוך תאים Vero ( איור 1 ). רצף פלסמיד נכון ניתן לפקח באמצעות עיכול הגבלה כמו miniprep פר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים שיטה לשחזור מערכת שיבוט cDNA זיהומית דו-חלקית עבור ZIKV. שיבוטים שתוארו בעבר עבור ZIKV סובלים מהנחתה או דורשים תוספת של אינטרונים, מה שהופך את הפלסמידים לגדולים יותר ומונע הצלה בתאי חרקים. ניתן לשחזר וירוס זיהומי באמצעות מערכת שיבוט דו-פלסמידית בתאי יונקים או חרקים (הנתונים אינם מוצגים). בנוסף, הנגיף שהתאושש ממערכת זו מתנהג באופן דומה לנגיף מסוג פרא במספר קווי תאים, במודל של עכברים מדוכאי חיסון וביתושים.
בשל נוכחותם של מקדמי חיידקים קריפטיים בגנום של flavivirus
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות לקריסטן בולרד-פייבלמן, למילנה וסלינוביץ וקלאודיה רוקר על עזרתם באפיון הווירוס הנגזר משבטים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענקים של המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, NIH תחת מענקים AI114675 (BJG) ו AI067380 (GDE).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| NEB יציב CompetentE. קולי | ניו אינגלנד BioLabs | C3040H | |
| קרבניצילין, מלח דיסודיום | |||
| Zymo | Research | D4036 | |
| ZymoPURE פלסמיד Maxiprep ערכת | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | ניו אינגלנד BioLabs | R3138S | 20,000 יחידות/מ"ל |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 יחידות/מ"ל |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 יחידות/מ"ל |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 יחידות/מ"ל |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 יחידות/מ"ל |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 יחידות/מ"ל |
| ערכת הגברה של illustra TempliPhi 100 GE | Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin ג'ל וניקוי PCR | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| שרימפס אלקליין פוספטאז (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 יחידות/מ"ל |
| פוספטאז אלקליין, מעי עגל (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 יחידות/מ"ל |
| T4 DNA Ligase | ניו אינגלנד BioLabs | M0202S | 400,000 יחידות/מ"ל |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | ניו אינגלנד BioLabs | E2065S | |
| תאי Vero | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 מערכת אלקטרופורציה בתפוקה גבוהה | BTX | 45-0423 | מכונות אחרות מקובלות. |
| מרק LB עם אגר (מילר) | Sigma | L3147 | יכול להיות גם תוצרת בית. |
| מרק נהדר | Sigma | T0918 | יכול להיות גם תוצרת בית. |
| פטרי צלחת | Celltreat | 229693 | |
| צינורות תרבות | VWR International | 60818-576 | |
| T75 צלוחיות | Celltreat | 229340 | |
| T182 צלוחיות | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | קורנינג | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 עם L-גלוטמין | קורנינג | 10-040-CV | |
| DMEM עם L-גלוטמין ו-4.5 גרם/ליטר גלוקוז | קורנינג | 10-017-CV | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| אבקת טרגקנת' | MP ביו | MP 104792 | |
| קריסטל סגול | אמרסקו | 0528-1006 | |
| אתנול מפוגל | VWR International | BDH1156-1LP | |
| צלחת | 6 בארותCelltreat | 229106 | |
| 12 צלחת באר | Celltreat | 229111 | |
| רצף אוליגוס | IDT | ראה טבלה 1 | |
| קיוביט 3.0 | ThermoFisher | קיוביט 3.0 | שיטות אחרות מקובלות. |
| ערכת בדיקה של Qubit dsDNA BR | ThermoFisher | Q32850 | שיטות אחרות מקובלות. |
| ערכת בדיקה של Qubit RNA HS | ThermoFisher | Q32852 | שיטות אחרות מקובלות. |
| ארון בטיחות ביולוגית Class II | משתנה | N/A | זה הכרחי לעבודה עם וירוסים חיים. |
מקורות
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
