Summary
Dit protocol beschrijft het herstel van infectief Zika-virus uit een infectieuze cDNA-kloon met twee plasmiden.
Abstract
Infectieuze cDNA-klonen zorgen voor genetische manipulatie van een virus, waardoor werk wordt vergemakkelijkt bij vaccins, pathogenese, replicatie, transmissie en virale evolutie. Hier beschrijven we de constructie van een besmettelijke kloon voor Zika virus (ZIKV), die momenteel een explosief uitbraak in Amerika veroorzaakt. Om toxiciteit te voorkomen voor bacteriën die gewoonlijk worden waargenomen met flavivirus-afgeleide plasmiden, gaven we een tweedimplantsysteem op dat het genoom bij het NS1-gen scheidt en stabieler is dan volledige constructies die niet succesvol zouden kunnen worden hersteld zonder mutaties. Na spijsvertering en ligatie om de twee fragmenten aan te sluiten kan full-length virale RNA gegenereerd worden door in vitro transcriptie met T7 RNA polymerase. Na elektroporatie van getranscribeerde RNA in cellen werd virus hersteld die respectievelijk dezelfde in vitro groei kinetiek en in vivo virulentie en infectie fenotypen vertoonde in respectievelijk muizen en muggen.
Introduction
Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) is een muskietgedragen flavivirus die in 2013-14 in Brazilië is aangekomen en vervolgens geassocieerd werd met een massale uitbraak van febriele ziekte die zich verspreidde over heel Amerika 1 . Daarnaast is ZIKV verbonden met ernstige ziekte-uitkomsten, zoals Guillain-Barré syndroom bij volwassenen en microcefalie bij foetussen en neonaten 2 . Weinig was bekend over ZIKV voor zijn snelle verspreiding in het westelijk halfrond. Dit omvatte een gebrek aan moleculaire hulpmiddelen, waardoor mechanistisch onderzoek werd belemmerd. Moleculaire hulpmiddelen voor virussen, zoals infectieuze cDNA-klonen, vergemakkelijken vaccin- en antivirale therapeutische ontwikkeling, en staan voor de beoordeling van virale genetische factoren die verband houden met differentiële virale pathogenese, immuunrespons en virale evolutie.
Flavivirus-infectieuze klonen zijn bekend als zeer instabiele bacteriën door crYptische prokaryotische promotors aanwezig in hun genen 3 . Verschillende benaderingen zijn gebruikt om dit probleem te verbeteren; Inclusief het inbrengen van tandemherhalen stroomopwaarts van virale sequenties 4 , mutatie van vermoedelijke prokaryotische promotorsekvensen 5 , het splitsen van het genoom in meerdere plasmiden 6 , vectoren met lage kopieën (inclusief bacteriële kunstmatige chromosomen) 7 , 8 en het inbrengen van intromen in het virale genoom 9 . Een volledige lengte systeem zonder wijzigingen is beschreven voor ZIKV; Deze kloon bleek echter te worden verzwakt in celkweek en in muizen 10 . Andere groepen hebben introns in het ZIKV genoom ingezet, waardoor verstoringen van onstabiele sequenties in bacteriën kunnen worden uitgesplitst die in vitro kunnen worden uitgesplitst in zoogdiercellen voor het produceren van infectieus virus 11, 12 . Bovendien is een PCR-based systeem getiteld Infectious-Subgenomic-Amplicons succesvol gebruikt om de prototype MR766-stam van ZIKV 13 te redden. De hier beschreven werkwijze vereist geen vreemde sequenties, maar versteur het genoom in het gebied van hoge instabiliteit door gebruik te maken van meerdere plasmiden, die eerder succesvol is gebruikt met gele koorts 6 , dengue 14 , 15 en West-Nile virussen 16 . Bovendien vergemakkelijkt de toevoeging van de hepatitis D-ribozymsequentie bij de virale genomische termini de creatie van een authentiek 3'-einde zonder de noodzaak van de toevoeging van een linearisatieplaats. Bovendien worden beide plasmiden geconstrueerd in een vector met lage kopieën (pACYC177, ~ 15 kopieën per cel) om eventuele resterende toxiciteit 17 te verzachten. Het herstelde virus toont een groeiprofiel dat vergelijkbaar is metOuderlijk virus in in vitro groeikrommen in 8 cellijnen die een verscheidenheid van celletypes afkomstig zijn van zowel zoogdieren als insecten, en heeft identieke pathogene profielen in muizen en infectie-, verspreiding- en overdrachtssnelheden in muggen 18 tentoongesteld.
Hierin beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe de infectieuze kloonplasmiden worden ontwikkeld, in vitro volledige virale RNA (het virale genoom) genereren en infectieus virus in celcultuur herstellen. Ten eerste beschrijven we de voortplanting van plasmiden in bacteriën of bacteriënvrije amplificatie met behulp van rollende cirkel amplificatie (RCA). Vervolgens laten we zien hoe de twee plasmiden worden verteerd en daarna gelijktijdig geligeerd worden om full-length virus te genereren. Tenslotte beschrijven we de productie van getranscribeerde RNA en de daaropvolgende elektroporatie in Vero-cellen, gevolgd door titratie van hersteld virus ( Figuur 1 ). De beschreven benadering is snel, waardoor foHet herstel van besmettelijke virusvoorraad in 1-2 weken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transformatie en herstel van infectieuze klonenplasmiden
- Transformeer beide plasmiden (afzonderlijk) met behulp van een commercieel transformatie protocol ( bijv . NEB 5 Minute Transformation Protocol) met enkele wijzigingen. Beide plasmiden bevatten een gen dat codeert voor ampicilline resistentie. Gebruik daarom ampicilline of carbenicilline voor selectie. Carbenicilline heeft de voorkeur, aangezien het stabieler is.
- Verwijder cellen (zie Materialetafel) van -80 ° C vriezer en doei op ijs gedurende 5-10 minuten. Prewarm lysogeny bouillon (LB) (bevattende 10 g / L NaCl en 25 μg / ml carbenicilline, genaamd LB-carb) platen en de bouillon met cataboliet-repressie (SOC (zonder antibiotica) - bij de cellen komen) bij 37 ° C.
- Voeg tussen 100 pg-10 ng in 1 μl plasmide-DNA toe aan een buis die 50 μl bevoegde cellen bevat; Meng zachtjes door de buis te vlotten.
- Incubeer buizen op ijs gedurende 5 minuten.
- Warmte schokbuizen bij 42 ° C gedurende 30 sIn een waterbad. Ga 2 uren terug naar ijs onmiddellijk na warmteschok.
- Pipet 950 μL kamertemperatuur SOC in elke buis en meng door pipettering. Spreid 100 μl van het bacteriemengsel op een LB-carboplaat en incubeer overnacht bij 37 ° C (ongeveer 12-14 uur).
- Verwijder platen uit 37 ° C incubator na 12-14 uur incubatie. Plaats platen in een donkere lade bij kamertemperatuur om de kolonies te laten groeien (ongeveer 8-9 uur).
- Met 5 ml geweldige bouillon (TB, die 25 μg / ml carbenicilline, genaamd TB-carb) bevat, groeien 5-10 kleine kolonies voor elk plasmide 's nachts bij 30 ° C in een bacteriële shaker (ongeveer 14-16 uur).
OPMERKING: Kleine kolonies zijn een indicator dat het plasmide intact is; Kolonies met plasmiden die deleties, herrangschikkingen of mutaties bevatten (hierin genaamd instabiliteitsgebeurtenissen) zullen sneller groeien en dus groter zijn. Daarom moet men proberen om de kleinste kolonies op het bord te kiezen, specifiek neeT selecteren van de grootste kolonies die aanwezig zijn. Sommige middelgrote kolonies kunnen ook worden geselecteerd voor volledigheid. De lagere temperatuur gebruikt vermindert de kans dat de cellen zullen overwegen (OD 600 van meer dan 0,6-0,8). Aangezien de meeste onderzoekers overnacht groeien, zorgt het voor meer controle en verminderde kans op overgroei. - Controleer vloeibare culturen voor turbiditeit (ongeveer OD 600 van 0,6-0,8). Plaats een onbeweeglijke buis bij 4 ° C en laat andere buizen doorbroken worden door langer te groeien.
OPMERKING: Bacteriën niet groeien op OD 600 waarden die groter zijn dan aanbevolen, aangezien de instabiliteitsgebeurtenissen van het plasmide kunnen optreden. - Extract plasmide DNA uit bacteriën met een commerciële plasmide miniprep kit (zie Material Table). Vervolgens in 15 μl voorverwarmde (tot 70 ° C in een verwarmingsblok) elutiebuffer. Laat de elutiebuffer 5 minuten voor de centrifugering op de kolom inkuberen.
OPMERKING: Bewaar tenminste 1 ml van deze starterkweek bij 4 ° C voorVerder gebruik in de volgende stap. - Digest 10 μL van de herstelde plasmiden om te beoordelen of plasmid instabiliteitsgebeurtenissen tijdens de cultuur plaatsvonden.
OPMERKING: Digest p1 met SalI / NheI en p2 met BamHI / HindIII bij 37 ° C gedurende 1 uur. Bevestig de aanwezigheid van de juiste banden na de spijsvertering ( Figuur 2a ) door gelelektroforese en ga verder met stap 2. Als u plasmide-DNA bereidt door middel van rollende cirkel amplificatie (RCA), reserveer een deel van het miniprep eluaat om als sjabloon te dienen.
2. Bereiding van Voldoende Plasmide DNA voor Ligation
OPMERKING: Ligation en daaropvolgende elektroporatie vereisen een voldoende hoeveelheid plasmide-DNA dat gegenereerd moet worden via either maxiprep of RCA. Terwijl maxiprep de traditioneel gebruikte benadering is, biedt RCA het voordeel dat er geen bacteriën nodig zijn, waardoor het potentieel voor plasmide-geïnduceerde toxiciteit in bacteriën wordt verwijderd, die tot instabiliteitsgebeurtenissen kan leiden.
- Voor elk plasmide dat het juiste restrictie-enzymverwerkingspatroon in het vorige gedeelte heeft aangetoond, voeg 500 μL starterkweek toe aan 1 liter TB-Carb (25 μg / ml carbenicilline) bouillon en schud overnacht bij 30 ° C (ongeveer 14-16 uur , Ongeveer OD 600 van 0,6-0,8).
OPMERKING: laat de cultuur niet groeien over deze OD 600 waarde. Dit kan mogelijk leiden tot instabiliteitsgebeurtenissen binnen de plasmiden.- Oog de bacteriën op en voer maxiprepen per protocol van de fabrikant uit (zie materiaal tabel).
- Voor elk plasmide dat het juiste restrictie-enzymverwerkingspatroon in het vorige gedeelte heeft aangetoond, voeg 500 μL starterkweek toe aan 1 liter TB-Carb (25 μg / ml carbenicilline) bouillon en schud overnacht bij 30 ° C (ongeveer 14-16 uur , Ongeveer OD 600 van 0,6-0,8).
- Plaats 1 μl plasmide-DNA over op een buis die 50 μl monsterbuffer bevat.
- Verhit het monster bij 95 ° C gedurende 3 minuten en incubeer vervolgens bij 4 ° C tot het klaar is voor gebruik.
- Bereid de commerciële versterking voorPremix (zie materiaal tabel ). Combineer 50 μl reactiebuffer met 2 μl enzymmix in een buis op ijs.
OPMERKING: De versterkingspremix moet op ijs worden gehouden tot het klaar is voor gebruik. Het is handig om een master mix te bereiden door voldoende reagentia te combineren voor het vereiste aantal amplificatie reacties. Eventuele ongebruikte premix moet weggegooid worden. - Vervolgens 50 μl bereide amplificatie premix aan het gedenatureerde monster.
- Incubeer de reactiebuizen bij 30 ° C gedurende 18 uur.
- Incubeer de buizen bij 65 ° C gedurende 10 minuten om de ø29 DNA polymerase te inactiveren.
- Bewaar de reactiebuisjes bij 4 ° C of -20 ° C tot het klaar is voor gebruik.
OPMERKING: op dit moment moet plasmide DNA bereid via beide methoden worden gekwantificeerd (met behulp van absorptie bij 260 nm) en het ZIKV genoom moet Sanger sequenced volledig zijn om te bevestigen dat er geen instabiliteitsgebeurtenissen (deleties en herrangschikkingen) zijn ontstaan tijdens de voorbereiding.
| Primer Naam | Sequentie (5 '- 3') |
| ZIKV PRVABC59 1Voor. | AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC |
| ZIKV Conserveerde 632For. | GCCCTATGCTGGATGAGG |
| ZIKV Conserveerde 692Rev. | GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG |
| ZIKV Conserveerde 1313Rev. | CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA |
| ZIKV Conserveerde 1201 Voor. | CCAACACAAGGTGAAGCCTAC |
| ZIKV Conserveerde 1663 Voor. | GCAGACACCGGAACTCCACACT |
| ZIKV Conserveerde 2008For. | CAGATGGCGGTGGACATGC |
| ZIKV Conserveerde 2350Rev. | GTGAGAACCAGGACATTCCTCC |
| ZIKV Geconserveerd 2605 Voor. | TACAAGTACCATCCTGACTCCC |
| ZIKV Geconserveerd 3499Rev. | GCCTTATCTCCATTCCATACCA |
| ZIKV Geconserveerd 3961Rev. | TTGCCAACCAGGCCAAAG |
| ZIKV Geconserveerd 4132For. | CATTTGTCATGGCCCTGG |
| ZIKV Conserveerde 4561Rev. | CTATTGGGTTCATGCCACAGAT |
| ZIKV Conserveerde 4665 Voor. | GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT |
| ZIKV Conserveerde 5189Rev. | AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG |
| ZIKV Conserveerde 5219For. | GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA |
| ZIKV Conserved 6086Rev. | CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC |
| ZIKV Conserveerde 6119For. | GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG |
| ZIKV Conserveerde 6721Rev. | CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC |
| ZIKV Conserveerde 6769For. | CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC |
| ZIKV Conserveerde 7209Rev. | ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA |
| ZIKV Geconserveerd 7343For. | GTTGTGGATGGAATAGTGGT |
| ZIKV Conserveerde 8243 Voor. | TGCCCATACACCAGCACTATGA |
| ZIKV PRVABC59 8893Rev. | TGCATTGCTACGAACCTTGTTG |
| ZIKV behield 9133 Voor. | AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA |
| ZIKV PRVABC59 9673Rev. | AACGCAATCATCTCCACTGACT |
| ZIKV Geconserveerd 9686For. | GATGATAGGTTTGCACATGCC |
| ZIKV Conserveerde 10321Rev. | GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT |
| ZIKV Conserveerde 10455For. | CAGGAGAAGCTGGGAAACC |
| ZIKV Geconserveerd 10621Rev. | CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC |
Tabel 1: Primers voor sequentiebepaling van cDNA-klonen. Plasmiden kunnen volledig worden gehersequentieerd met de genoemde primers. Primers gemarkeerd als "geconserveerd" indiCate dat ze waarschijnlijk alle genotypes van ZIKV kunnen sequenteren / versterken. Primers gemerkt als "PRVABC59" zijn specifiek voor deze stam, maar kunnen ook werken voor andere Aziatische genotype stammen en mogelijk ook andere genotypen.
3. Bereiding van in vitro getranscribeerde RNA
- Opzetten van de spijsverteringsreactie van hetzij maxiprep of RCA-bereid DNA.
- Voor p1 digestie meng 10 μL 10x reactiebuffer, 3 μL ApaLI, 3 μl BamHI-HF, 3 μL rSAP of CIP en 3,3 μg p1 DNA. Voeg ddH20 toe aan 100 μl.
- Voor p2 digestie meng 10 μL 10x reactiebuffer, 3 μL ApaLI, 3 μL EcoRI-HF en 13,3 μg p2 DNA. Voeg ddH20 toe aan 100 μl.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 1-2 uur.
- Zuiveren met behulp van een commerciele gel- en PCR-opruimingsset (zie materiaaltabel). Eluten in 30 μl elutiebuffer die vooraf wordt verhit tot 70 ° C in een verwarmingsblok (incubate theKolom gedurende 5 minuten voor het spinnen).
OPMERKING: Houd 1 μL om later op een gel te lopen.
- Bereid ligatie reactie op.
- Combineer 10 μl 10x T4 DNA-ligatie-reactiebuffer, 3 μl T4 DNA-ligase (400 U / μl), 29 μl gezuiverd p1 en 29 μl gezuiverd p2. Voeg ddH20 toe aan 100 μl.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of 16 ° C overnacht.
- Zuiveren met behulp van een commerciele gel- en PCR-opruimingsset (zie materiaaltabel). Vervolgens in 10 μl elutiebuffer vooraf verwarmd tot 70 ° C in een verwarmingsblok (incubate kolom gedurende 5 minuten voor het spinnen).
OPMERKING: Houd 1 μL om later op een gel te lopen.
- Run onontgiste plasmiden, verteerde plasmiden en ligatie op een agarosegel. Het ligatieproduct zou een band met een hoger molecuulgewicht hebben (ongeveer 11 kb) dan alleen gedigereerde plasmide, die aangeeft dat de ligatie succesvol was ( Figuur 2b ).
- Stel T7 in vitro transcriptiereactie op.
- Combineer 10 μL 2x ARCA / NTP Mix, 2 μl T7 RNA polymerase mix en 8 μl gezuiverde ligatie reactie voor een eindvolume van 20 μl.
OPMERKING: De ARCA die in de mix is opgenomen, is een dop analoog dat uitsluitend in de juiste oriëntatie is opgenomen. Standaard cap analogen kunnen resulteren in slechts ~ 50% van de transcripten hebben een pet in de juiste oriëntatie. - Incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C.
- Meet RNA-concentratie via een UV-spectrofotometer. Optioneel, gebruik een denaturerende agarosegel om de lengte van het RNA-transcript te bevestigen.
- Combineer 10 μL 2x ARCA / NTP Mix, 2 μl T7 RNA polymerase mix en 8 μl gezuiverde ligatie reactie voor een eindvolume van 20 μl.
4. Redding van besmettelijk virus door elektroporatie
- Dagen voorafgaand aan elektroporatie, bereiden 1 T182-fles van Vero-cellen (tussen T150 en T182 is aanvaardbaar, gegroeid in DMEM + 10% foetaal bovenserum (FBS)) per construct dat wordt hersteld. Inclusief 1 T182 als een mock transfectie controle. CeLls moet gebruikt worden bij 70-80% samenvloeiing.
- Wanneer cellen klaar zijn, plaats 12 mL / reactie van DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in een waterbad dat verwarmd is tot 37 ° C.
- Verwijder cellen door trypsinisatie met een standaard protocol, en herstel cellen in media met 10% FBS om trypsine te inactiveren; Centrifugeer cellen bij 150 xg gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Wascellen in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pelleteringscellen bij 150 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Herhaal deze stap tweemaal voor een totaal van drie wasingen.
- Resuspendeer cellen in 200 μl RPMI 1640 + 10 mM HEPES (steriel) per # monsters. Breng 200 μL cel suspensie over naar een steriele buis. Cellen moeten ~ 0,5 x 107 cellen / ml zijn.
- Voeg 20 μl water (mock neg. Control) of 20 μL RNA (bij voorkeur 5-10 μg) in stap 3.4 aan elke reeks cellen toe. Meng het voorzichtig door de buis te vlotten en de inhoud van de buis over te brengen naar een 2 mm-gaten electroporation cuvette.
- Stel een elektrOporator tot 170 V LV, omega (weerstand) bij 0 en 950 μF (ongeveer 625 V / cm en 20 ms tijdskonstante voor andere machines). Stel weerstand tegen de laagste beschikbare instelling, of 0 of ∞ indien beschikbaar.
- Pulse voegt onmiddellijk 600 μL DMEM +15% FBS +10 mM HEPES toe die in stap 4.2 werd verwarmd. Spoel de binnenkant van de cuvette grondig door om alle cellen te verwijderen. Voeg cellen toe aan een T75 weefselkweekkolf die 10 ml voorverwarmde media bevat. Verwijder extra media uit cuvette door gebruik te maken van de dropper die bij de cuvette is opgenomen. Wees voorzichtig om steriliteit te behouden.
- Wervelkolf om media en cellen te mengen en in een incubator van 37 ° C te plaatsen.
- Controleer de volgende dag voor cellevendigheid, en doe dit elke dag tot 50-75% celsterfte waargenomen. Celdood wordt waargenomen door te vergelijken met de bespotse elektroporate controle.
OPMERKING: Het cytopathische effect van het ZIKV (CPE) is nogal uitgesproken in Vero-cellen, wat resulteert in afgeronde cellen die losmaken en drijven in het kweekmedium. We hebbenWaargenomen een bereik van 8-10 dagen als ideaal voor oogst. - Harvest supernatant in een conische buis en centrifuge om cellulaire rommel bij> 3000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C te verwijderen.
- Verwijder verduidelijkt supernatant naar een nieuwe buis en aanvul met een uiteindelijke concentratie van 20% FBS (uit 100% voorraad). Voeg ook steriele HEPES toe bij een uiteindelijke concentratie van 10 mM als buffermiddel om virusinfectiviteit te behouden, terwijl bevroren (uit een 1 M steriele voorraad).
- Meng virus door vortexing en aliquot in schroefdopflessen. Bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
5. Titratie van hersteld virus
- Zet het passende aantal 6- of 12-putjes platen van Vero-cellen de dag voor de titratie.
- Verwijder virus uit de vriezer en maak serieuze 10-voudige verdunningen in DMEM + 2% FBS in buizen of 96-putjes platen.
OPMERKING: De verwachte titer uit herstelde klonen ligt tussen 1 x 106 en 5 x 107 PFU / ml. - Voeg 200 oR 400 μl van elke verdunning in tweevoud aan respectievelijk een putje van respectievelijk een 12- of 6-putjesplaat.
- Plaats platen in een 37 ° C incubator en steek elke 15 minuten, gedurende een totale 1-1,5 uur adsorptieperiode.
- Verwijder virale inoculum en voeg 1 ml (12-putjes) of 2 ml (6-putjes) DMEM-Tragacanth overlay aan elke put toe.
OPMERKING: Het is mogelijk om hier agarose, agar, methylcellulose of andere overlay media te gebruiken. - Incubeer cellen in 37 ° C incubator gedurende 5 dagen. De tijd voor de juiste plaatvorming zal variëren afhankelijk van de gebruikte overlay.
- Om cellen op te lossen, verwijder platen van incubator en dek de overlay voorzichtig in desinfectiemiddel.
- Voeg voldoende 20% ethanol / 0,1% kristalviolet (CV) toe aan elke put om te bedekken en wervelen om te mengen.
OPMERKING: Veel andere fixatiemiddelen bestaan en kunnen hier gebruikt worden. Bovendien, als u een agarose- of agaroverlay gebruikt, kan een tweede overlay gebruikt worden in combinatie met neutraal rood om plakken zonder fixatie te visualiseren. 20% ethanol blijkt te zijnEffectief bij het inactiveren van omhulde virussen in eerdere studies; Gebruik dit bedrag niet voor niet-omhulde virussen, aangezien deze niet worden geactiveerd 19 . - Incubeer platen gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur (in een klasse II bioveiligheidskast); Verwijder CV (per plaatselijke regelgeving) en wasplaten met kraanwater.
- Laat de borden drogen en plak plakkers handmatig.
OPMERKING: Referentie 20 kan worden gebruikt als aanvullende referentie voor het uitvoeren van plaque assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hier beschreven protocol zorgt voor het herstel van infectieus kloon afgeleid Zika virus. Het manipuleren van het infectieuze kloonsysteem met twee plasmiden is rechtdoor wanneer het met zorg wordt uitgevoerd, in vergelijking met volledige lengteversies die zeer instabiel zijn (data niet getoond). Na spijsvertering en ligatie van de twee afzonderlijke stukken wordt afgedekt RNA geproduceerd onder toepassing van in vitro transcriptie met T7-polymerase, dat vervolgens in Vero-cellen wordt geëproporeerd ( Figuur 1 ). Correcte plasmide sequentie kan worden gecontroleerd met behulp van restrictie vertering als een proxy volgende miniprep ( Figuur 2a ) en via Sanger sequencing na grootschalige DNA-productie met RCA of maxiprep. Na het bevestigen van de klonen door sequencing, vereist het herstel van infectieus virus alleen spijsvertering, ligatie, in vitro transcriptie en uiteindelijk elektroporatie. Deze stappen kunnen op een dag uitgevoerd worden. Correcte digeStion en ligatie kunnen worden gecontroleerd door agarosegelelektroforese ( figuur 2b ), waar mogelijk probleemoplossing mogelijk maken.
Zoals getoond in Figuur 3 repliceert infectieus kloon afgeleid virus op soortgelijke niveaus als het ouderlijke isolaat in vitro in verscheidene cellijnen, wat suggereert dat het herstelde virus uit het cDNA op soortgelijke wijze repliceert als primair isolaat. Bovendien werden geen significante verschillen waargenomen tussen het infectieuze kloon afgeleide virus en het ouderlijke isolaat in overlevingspercentages bij muizen of infectie, verspreiding en transmissie in Aedes aegypti muggen ( Figuur 4 ).
Figuur 1: Werkstroom van ZIKV-redding uit een cDNA-kloon met twee plasmiden.Het genoom van de ZIKV stam PRVABC59 werd gekloneerd in twee afzonderlijke stukken in een pACYC177 plasmide ruggengraat. De twee plasmiden werden vervolgens verteerd en geligeerd met T4 DNA ligase. Capped-infectious RNA werd vervolgens geproduceerd via in vitro transcriptie gevolgd door elektroporatie in Vero-cellen. (Figuur aangepast uit referentie 21 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gelelektroforese om digestie en ligatie van cDNA-kloon te monitoren. ( A ) Initiële restrictie vertering van miniprep afgeleide plasmiden om genetische stabiliteit te beoordelen. ( B ) Voorbeelden van spijsvertering en ligatieproducten tijdens het herstel van infectieus virus uit het plasmide-kloonsysteem van twee plasmiden.
Figuur 3: In vitro groei kinetiek van kloon afgeleid virus. Groeikinetiek van wild type PRVABC59 en infectieus kloon afgeleid virus op menselijk (SH-SY5Y, Jar en NTERA2 cI.D1), muskiet (C6 / 36, Aag2) en niet-humane primaat (Vero) cellijnen werden beoordeeld door plaque assay. N = 3 Error bars vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde. (Figuur aangepast uit referentie 21 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
55857fig4.jpg "/>
Figuur 4: In vivo karakterisering van kloon afgeleid virus in muizen en muggen. ( A ) 4 weken oude mannelijke en vrouwelijke interferon alpha, bèta en gamma receptor knockout, AG129, muizen werden intraperitoneaal geïnoculeerd met 1.000 PFU PRVABC59 of het besmettelijke kloon afgeleide virus en gedurende de tijd voor overleving (n = 11) gecontroleerd. Aedes aegypti muggen kregen een infectieus bloedmeel dat ZIKV bevatte en 14 dagen later ontleed. ( B ) Plaque assays werden gebruikt om muskietlichamen (infectie), benen (verspreiding) of speekselafscheidingen (transmissie) voor infectievirus te beoordelen. De prijzen worden gepresenteerd als het percentage van de totale muggen die werden getest. (Figuur aangepast aan referentie 21 ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic en Claudia Rückert bedanken voor hun hulp bij het karakteriseren van het kloon afgeleide virus. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, NIH onder subsidies AI114675 (BJG) en AI067380 (GDE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
