Summary
이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.
Abstract
전염성 cDNA 클론은 바이러스의 유전자 조작을 허용하여 백신, 병인 발생, 복제, 전달 및 바이러스 진화에 대한 작업을 용이하게합니다. 여기에서는 Zika 바이러스 (ZIKV)에 대한 전염성 클론의 구축에 대해 설명합니다. ZIKV는 현재 미국에서 폭발적인 발병을 일으키고 있습니다. 플라 비 바이러스 유래 플라스미드에서 흔히 볼 수있는 박테리아에 대한 독성을 막기 위해 우리는 NS1 유전자에서 게놈을 분리하는 2 플라스미드 시스템을 만들었으며 돌연변이없이 성공적으로 복구 할 수 없었던 완전한 길이의 구조물보다 더 안정적이었다. 두 조각을 연결하기위한 소화 및 결합 후, 전장 바이러스 RNA는 T7 RNA 폴리머 라제로 시험 관내 전사에 의해 생성 될 수있다. 전사 된 RNA가 세포 내로 전기 천공 된 후 바이러스와 유사한 생체 내 성장 동역학 및 생체 내 독성 및 감염 표현형이 마우스 및 모기에서 각각 나타났다.
Introduction
Zika 바이러스 (ZIKV, Family Flaviviridae : Flavivirus 속)는 2013-14 년 브라질에 도착한 모기에 의한 플라 비 바이러스로 이후 미주 전역에 퍼져 있던 열병의 대규모 발생과 관련이 있습니다 1 . 또한, ZIKV는 성인의 길랑 발레 증후군 및 태아 및 신생아의 소두증과 같은 심각한 질병 결과와 관련되어 있습니다 2 . 서반구에서 급속하게 확산되기 전에 ZIKV에 대해 알려진 것이 거의 없다. 여기에는 분자 도구가 없어 기계 론적 연구가 어려웠습니다. 감염성 cDNA 클론과 같은 바이러스의 분자 도구는 백신 및 항 바이러스 치료 개발을 촉진하고 차별적 인 바이러스 병인, 면역 반응 및 바이러스 성 진화와 관련된 바이러스 유전 인자의 평가를 허용합니다.
플라 비 바이러스 전염성 클론은 cr 때문에 박테리아에서 매우 불안정한 것으로 알려져있다그들의 게놈에 존재하는 유익한 원핵 생물 프로모터 3 . 이 문제를 개선하기 위해 몇 가지 접근법이 사용되었습니다. 바이러스 서열 4의 상류 중계 반복의 삽입, 추정 원핵 생물 프로모터 서열 5의 돌연변이, 게놈을 다중 플라스미드 6 으로 분할, 저 복사 수 벡터 (박테리아 인공 염색체 포함) 7 및 바이러스 게놈에서의 인트론 삽입 9 . 수정하지 않은 하나의 전장 시스템이 ZIKV에 대해 설명되었습니다. 그러나,이 클론은 세포 배양 및 마우스에서 약화 된 것으로 보였다. 다른 그룹은 인트론을 ZIKV 게놈으로 조작하여 감염성 바이러스 11 의 생산을 위해 포유류 세포 에서 시험관 내 에서 접합 될 수있는 박테리아의 불안정한 서열을 파괴 할 수 있도록했습니다, 12 . 또한, 전염성 - 서브 게놈 - 앰플리 콘이라는 제목의 PCR 기반 시스템이 ZIKV 13 의 원형 MR766을 구제하는데 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 설명 된 접근 방식은 외래 서열을 필요로하지 않고 황열병 6 , 뎅기열 14 , 15 및 웨스트 나일 바이러스 16에서 성공적으로 사용 된 여러 플라스미드를 사용하여 불안정성이 높은 지역의 게놈을 파괴합니다. 또한 바이러스 게놈 말단에 D 형 간염 리보 자임 서열을 추가하면 선형화 부위를 추가 할 필요없이 진정한 3 '말단을 만들 수 있습니다. 또한 두 플라스미드는 잔류 독성을 완화하기 위해 낮은 카피 수 벡터 (pACYC177, 세포 당 ~ 15 카피)로 구성된다. 복구 된 바이러스는포유류와 곤충 둘 다에서 파생 된 다양한 세포 유형을 포함하는 8 개의 세포주 에서 체외 성장 곡선에서 부모 바이러스. 모기에서 마우스와 감염, 보급 및 전염 속도에서 동일한 병원성 프로파일을 나타냈다.
여기서, 우리는 감염성 클론 플라스미드를 성장시키고, 체외에서 전장 바이러스 성 RNA (바이러스 성 게놈) 를 생성하고 , 세포 배양에서 감염성 바이러스를 회수하는 방법을 기술 한 프로토콜을 상세히 설명한다. 첫째, 우리는 박테리아에서 플라스미드의 번식 또는 롤링 서클 증폭 (RCA)을 이용한 박테리아없는 증폭을 기술한다. 다음으로, 우리는 두 플라스미드가 어떻게 소화되는지를 보여 주며,이어서 전체 길이의 바이러스를 생성하기 위해 함께 연결됩니다. 마지막으로, 우리는 전사 RNA의 생산과 Vero 세포로의 전기 천공을 기술하고, 회수 된 바이러스의 적정을 기술한다 ( 그림 1 ). 설명 된 접근법은 빠르며, fo1 ~ 2 주 안에 전염성 바이러스 주식을 회수.
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Protocol
1. 감염성 클론 Plasmid의 형질 전환 및 회수
- 상업적 형질 전환 프로토콜 ( 예 : NEB 5 Minute Transformation Protocol)을 사용하여 두 가지 플라스미드 (일부분)를 변형하여 변형시킨다. 두 플라스미드 모두 암피실린 내성을 나타내는 유전자를 포함하고 있으므로 선택시 암피실린이나 카 베니 실린을 사용하십시오. Carbenicillin은보다 안정적이므로 선호됩니다.
- -80 ° C의 냉동고에서 세포 (물질 표 참조)를 제거하고 5-10 분 동안 얼음 위에서 녹입니다. 37 ℃에서 카파 보이트 억제 (SOC (항생 물질 없음) - 세포와 함께)와 함께 prewarm lysogeny 국물 (LB) (10g / L NaCl 및 25 μg / ML carbenicillin을 포함, LB - carb라는) 접시와 국물.
- 50 μL의 유능한 세포가 들어있는 튜브에 1 μL의 플라스미드 DNA에 100 pg-10 ng을 첨가하십시오. 튜브를 가볍게 흔들어서 가볍게 섞는다.
- 5 분 동안 얼음에 튜브를 품어 라.
- 42 ° C에서 30 초 동안 열 충격 튜브수조에. 열 충격 직후 2 분 동안 얼음으로 되돌아갑니다.
- 각 튜브에 상온 SOC 950 μL를 피펫으로 섞는다. LB - carb 플레이트에 박테리아 혼합물 100 μL를 퍼 뜨리고 37 ° C (대략 12-14 H) 밤새 품어.
- 12-14 시간 배양 후 37 ° C 배양기에서 플레이트를 제거하십시오. 식민지가 (약 8-9 시간) 성장을 계속할 수 있도록 실온에서 어두운 서랍에 판을 놓으십시오.
- Terrific broth (TB, TB-carb라고 불리는 25 μg / mL carbenicillin 함유) 5 mL를 사용하여 박테리아 셰이커 (대략 14-16 h)에서 30 ° C 밤새 각 플라스미드에 대해 5 ~ 10 개의 작은 콜로니를 성장시킵니다.
참고 : 작은 콜로니는 플라스미드가 손상되지 않았다는 표시입니다. 결실, 재배치 또는 돌연변이 (본 명세서에서 불안정성 사건이라 칭함)를 포함하는 플라스미드를 갖는 콜로니는보다 빨리 성장할 것이며 따라서 더 커질 것이다. 따라서 플레이트에서 가장 작은 콜로니를 선택해야합니다.가장 큰 식민지를 선택한다. 일부 중간 크기의 콜로니도 완결을 위해 선택 될 수 있습니다. 사용 된 온도가 낮 으면 세포가 자라날 확률이 줄어 듭니다 (OD 600 이 0.6-0.8 이상). 대부분의 연구자가 하룻밤 사이의 성장을 수행하기 때문에 더 많은 제어와과 성장 기회 감소가 가능합니다. - 탁도 (대략 OD 600 0.6-0.8)에 대한 액체 배양을 점검하십시오. 4 ℃에서 모든 탁한 튜브를 놓고 다른 튜브가 오래 동안 성장하여 탁 해지도록하십시오.
참고 : 플라스미라 불안정성 사건이 발생할 수 있으므로 권장치보다 큰 OD 600 값으로 박테리아를 키우지 마십시오. - 상업용 플라스미드 miniprep 키트 (재료 표 참조)로 박테리아에서 플라스미드 DNA를 추출합니다. 사전 가열 (가열 블록에서 70 ° C까지) 용리 완충액 15 μL로 용리. 원심 분리 전에 용출 완충액을 컬럼에서 5 분 동안 배양합니다.
주의 사항 :이 시동기 배양액 1 mL 이상을 4 ° C다음 단계에서 더 사용하십시오. - 배양 중에 플라스미드 불안정성 사건이 발생했는지 평가하기 위해 회수 된 플라스미드 10 μL를 소화합니다.
참고 : pI를 SalI / NheI로, p2를 BamHI / HindIII로 37 ℃에서 1 시간 분해하십시오. 겔 전기 영동으로 소화 한 후 올바른 밴드가 있는지 확인하고 ( 그림 2a ) 2 단계로 진행합니다. 롤링 서클 증폭 (RCA)으로 플라스미드 DNA를 준비하는 경우 miniprep 용리액의 일부를 주형으로 준비하십시오.
2. 라이 게이션을위한 충분한 플라스미드 DNA의 준비
참고 : 연결 및 후속 electroporation은 maxiprep 또는 RCA를 통해 생성되어야합니다 충분한 양의 플라스미드 DNA가 필요합니다. maxiprep은 전통적으로 사용되는 접근법이지만 RCA는 박테리아를 필요로하지 않는 이점을 제공하므로 박테리아에서 플라스미드 유도 독성의 가능성을 제거하여 불안정성을 유발할 수 있습니다.
- 이전 섹션에서 정확한 제한 효소 소화 패턴을 시연 한 각 플라스미드에 TB-Carb (25 μg / mL carbenicillin) 배지 1 L에 시동기 배양 500 μL를 첨가하고 30 ° C (약 14-16 시간) , 약 0.6-0.8의 OD 600 ).
참고 :이 OD 600 값 이상으로 배양되지 않도록하십시오. 이것은 잠재적으로 플라스미드 내에서 불안정한 결과를 초래할 것이다.- 박테리아를 수확하고 제조사의 프로토콜에 따라 maxipreps를 수행하십시오 (Materials Table 참조).
- 이전 섹션에서 정확한 제한 효소 소화 패턴을 시연 한 각 플라스미드에 TB-Carb (25 μg / mL carbenicillin) 배지 1 L에 시동기 배양 500 μL를 첨가하고 30 ° C (약 14-16 시간) , 약 0.6-0.8의 OD 600 ).
- 샘플 버퍼 50 μL를 포함하는 튜브에 플라스미드 DNA 1 μL를 전송합니다.
- 95 ° C에서 3 분간 열 변성시킨 다음 4 ° C에서 배양하여 사용할 준비가 될 때까지 기다리십시오.
- 상업적 증폭 준비premix ( 재료 표 참조). 얼음에 세트 튜브에 효소 믹스 2 μL와 반응 버퍼 50 μL를 결합하십시오.
참고 : 증폭 프리믹스는 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관해야합니다. 요구되는 수의 증폭 반응을위한 충분한 시약을 조합하여 마스터 믹스를 준비하는 것이 편리합니다. 사용하지 않은 모든 프리믹스는 폐기해야합니다. - 준비된 증폭 premix 50 μL를 변성 된 시료에 옮긴다.
- 반응 튜브를 30 ° C에서 18 시간 동안 품어 낸다.
- 튜브를 65 ° C에서 10 분 동안 배양하여 ø29 DNA 중합 효소를 비활성화한다.
- 사용 준비가 끝날 때까지 반응 튜브를 4 ° C 또는 -20 ° C에 보관하십시오.
참고 :이 시점에서 두 방법을 통해 준비된 플라스미드 DNA는 (260 nm에서의 흡광도를 사용하여) 정량화되어야하며 ZIKV 게놈은 생기지 않은 상태 (삭제 및 재배치)가 발생하지 않았 음을 확인하기 위해 생거 (Sanger) 서열을 완전히 시퀀싱해야합니다.
| 입문서 이름 | 서열 (5 '- 3') |
| ZIKV PRVABC59 1For. | AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC |
| ZIKV 보존 된 632For. | GCCCTATGCTGGATGAGG |
| ZIKV 보존 된 692Rev. | GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG |
| ZIKV 보존 된 1313Rev. | CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA |
| ZIKV 보존 된 1201 용. | CCAACACAAGGTGAAGCCTAC |
| ZIKV 보존 된 1663For. | GCAGACACCGGAACTCCACACT |
| 2008 년 보존 된 ZIKV. | CAGATGGCGGTGGACATGC |
| ZIKV는 2350Rev를 보존합니다. | GTGAGAACCAGGACATTCCTCC |
| ZIKV 보존 된 2605For. | TACAAGTACCATCCTGACTCCC |
| ZIKV 보존 된 3499Rev. | GCCTTATCTCCATTCCATACCA |
| ZIKV 보존 3961Rev. | TTGCCAACCAGGCCAAAG |
| ZIKV 보존 4132For. | CATTTGTCATGGCCCTGG |
| ZIKV 보존 된 4561Rev. | CTATTGGGTTCATGCCACAGAT |
| ZIKV 보존 된 4665For. | GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT |
| ZIKV 보존 5189Rev. | AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG |
| ZIKV 보존 5219For. | GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA |
| ZIKV 보존 된 6086Rev. | CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC |
| ZIKV 보존 된 6119 포. | GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG |
| ZIKV 보존 된 6721Rev. | CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC |
| ZIKV 보존 된 6769For. | CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC |
| ZIKV 보존 된 7209Rev. | ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA |
| ZIKV 보존 된 7343For. | GTTGTGGATGGAATAGTGGT |
| ZIKV 보존 8243 용. | TGCCCATACACCAGCACTATGA |
| ZIKV PRVABC59 8893Rev | TGCATTGCTACGAACCTTGTTG |
| ZIKV는 9133For를 보존했습니다. | AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA |
| ZIKV PRVABC59 9673Rev. | AACGCAATCATCTCCACTGACT |
| ZIKV는 9686을 위해 보존되었습니다. | GATGATAGGTTGCACATGCC |
| ZIKV 보존 된 10321Rev. | GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT |
| ZIKV 보존 된 10455For. | CAGGAGAAGCTGGGAAACC |
| ZIKV 보존 된 10621Rev. | CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC |
표 1 : cDNA 클론을 시퀀싱하기위한 프라이머. 플라스미드는 나열된 프라이머로 완전히 시퀀싱 할 수 있습니다. "conserved"indi로 표시 한 프라이머ZIKV의 모든 유전형을 서열화 / 증폭시킬 가능성이 높다. "PRVABC59"로 표시된 프라이머는이 균주에 특이 적이지만 다른 아시아 유전자형 계통 및 기타 유전자형에도 사용할 수 있습니다.
3. 체외 수정 RNA의 준비
- maxiprep 또는 RCA 준비 DNA의 소화 반응을 설정하십시오.
- p1 소화의 경우, 10x 반응 완충액, 3 μL의 ApaLI, 3 μL의 BamHI-HF, 3 μL의 rSAP 또는 CIP, 및 3.3 μg의 p1 DNA를 혼합한다. 100 μL에 ddH 2 O를 첨가한다.
- p2 소화를 위해서는 10x 반응 완충액 10 μL, ApaLI 3 μL, EcoRI-HF 3 μL 및 p2 DNA 13.3 μg을 섞는다. 100 μL에 ddH 2 O를 첨가한다.
- 1-2 시간 동안 37 ° C에서 배양하십시오.
- 시중에서 판매하는 젤 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 정제하십시오 (재료 표 참조). 가열 블록에서 70 ° C로 예열 된 용리 완충액 30 μL로 용리회전하기 전에 5 분 동안 칼럼).
참고 : 1 μL을 나중에 젤에서 실행하십시오.
- 라이 게이션 반응을 준비하십시오.
- 10x T4 DNA 연결 반응 버퍼 10 μL, T4 DNA 리가 아제 (400 U / μL) 3 μL, 정제 p1 29 μL 및 정제 P2 29 μL를 합칩니다. 100 μL에 ddH 2 O를 첨가한다.
- 상온에서 2 시간 또는 16 ° C 밤새 품어 낸다.
- 시중에서 판매하는 젤 및 PCR 클린업 키트를 사용하여 정제하십시오 (재료 표 참조). 가열 블록 (회전하기 전에 5 분 동안 부화 칼럼)에서 70 ° C로 예열 된 용리 완충액 10 μL로 용출시킨다.
참고 : 1 μL을 나중에 젤에서 실행하십시오.
- 소화되지 않은 플라스미드, 소화 된 플라스미드 및 아가 로스 겔에서의 연결 장치를 작동시킨다. 라이 게이션 제품은 소화 된 플라스미드 단독보다 높은 분자량 밴드 (약 11kb)를 가져야하며, 이는 라이 게이션이 성공적임을 나타냅니다 ( 그림 2b ).
- T7 in vitro 전사 반응을 설정하십시오.
- 10 μL 2x ARCA / NTP 혼합, 2 μL의 T7 RNA 중합 효소 혼합 및 최종 부피 20 μL를위한 8 μL의 정제 된 연결 반응을 합칩니다.
참고 : 믹스에 포함 된 ARCA는 올바른 방향으로 독점적으로 통합 된 캡 아날로그입니다. 표준 캡 아날로그는 올바른 방향으로 뚜껑이있는 전사 물의 ~ 50 % 만 얻을 수 있습니다. - 37 ° C에서 4 시간 동안 품어 낸다.
- UV 분광 광도계를 통해 RNA 농도를 측정하십시오. RNA 전 사체의 길이를 확인하기 위해 denaturing agarose gel을 실행하십시오 (선택 사항).
- 10 μL 2x ARCA / NTP 혼합, 2 μL의 T7 RNA 중합 효소 혼합 및 최종 부피 20 μL를위한 8 μL의 정제 된 연결 반응을 합칩니다.
4. 일렉트로 포 레이션에 의한 감염 바이러스의 구조
- (T150 및 T182 사이의 수용 가능, DMEM + 10 % 태아 소 혈청 (FBS)에서 재배) 1 개의 T182 플라스크를 회수해야한다. mock transfection control으로 1 T182를 포함하십시오. Cells는 70-80 %의 confluency에서 사용해야합니다.
- 세포가 준비되면, 37 ° C로 가열 수 중 욕에서 DMEM + 15 % FBS + 10 MM HEPES의 12 ML / 반응을 놓으십시오.
- 표준 프로토콜과 trypsinization하여 세포를 분리하고 트립신을 비활성화하는 10 % FBS와 미디어에서 세포를 복구, 4 ° C에서 5 분 동안 150 XG에서 세포를 원심 분리하십시오.
- 4 ° C에서 5 분 150 XG에서 세포를 pelleting 1X 인산 버퍼 식염수 (PBS)에서 세포를 씻으십시오. 이 단계를 두 번 반복하여 총 세 번의 세척을하십시오.
- 샘플 당 RPMI 1640 + 10 MM HEPES (멸균) 200 μL에 Resuspend 세포. 멸균 튜브에 세포 현탁액 200 μL를 전송합니다. 세포는 ~ 0.5 x 107 세포 / mL이어야합니다.
- 단계 3.4에서 생성 된 RNA (바람직하게는 5-10 μg) 20 μL를 세포의 각 세트에 첨가한다. 튜브를 가볍게 치고 부드럽게 혼합하고 튜브의 내용물을 2mm 간격의 전기 천공 큐벳으로 옮긴다.
- electr 설정oporator는 170V LV, 오메가 (저항)는 0 및 950μF (약 625V / cm 및 다른 기계의 경우 20ms 시정 수). 사용 가능한 가장 낮은 설정으로 0 또는 ∞로 저항을 설정합니다.
- 1 회 펄스하고 단계 4.2에서 가온 된 DMEM + 15 % FBS + 10 mM HEPES 600 μL를 즉시 첨가한다. 모든 세포를 제거하기 위해 큐벳의 내부를 철저히 씻어 내십시오. 사전 예열 매체 10 ML을 포함 T75 조직 배양 플라스크에 세포를 추가합니다. 큐벳에 포함 된 드로퍼를 사용하여 큐벳에서 추가 미디어를 제거합니다. 불임을 유지하도록주의하십시오.
- 미디어와 세포를 혼합하고 37 ° C 배양기에 넣으십시오.
- 다음날 세포 생존 가능성을 확인하고, 50-75 % 세포 사멸이 관찰 될 때까지 매일 그렇게하십시오. 세포 사멸은 모의 electroporated 컨트롤과 비교하여 관찰됩니다.
참고 : ZIKV 세포 병리학 적 효과 (CPE)는 Vero 세포에서 아주 분명하게 나타나 세포 배양액을 분리하여 부유시킵니다. 우리는 가지고있다.수확에 이상적인 것으로 8-10 일의 범위를 관찰했다. - 원뿔 튜브와 원심 분리기에있는 상층 액을 수확하여 4 ℃에서 10 분 이상> 3000 xg에서 세포 파편을 제거합니다.
- 깨끗한 상청액을 새 튜브에 옮기고 20 % FBS (100 % 주식)의 최종 농도로 보충합니다. 또한, 동결 상태 (1 M 멸균 주식)에서 바이러스 감염성을 보존하기 위해 완충제로 10 mM의 최종 농도에서 무균 HEPES를 첨가하십시오.
- vortexing과 나누어 냄으로써 스크류 캡 바이알에 바이러스를 혼합합니다. 나중에 사용할 수 있도록 -80 ° C에서 보관하십시오.
5. 회복 된 바이러스의 적정
- 적정하기 전날 Vero 세포의 6- 또는 12- 웰 플레이트의 적절한 수를 씨닝하십시오.
- 냉동실에서 바이러스를 제거하고 튜브 또는 96 - 웰 플레이트에있는 DMEM + 2 % FBS에서 연속 10 배 희석합니다.
참고 : 회수 된 클론의 예상 역가는 1 x 106 ~ 5 x 107 PFU / mL입니다. - 200 o 추가400μL 씩 각 희석액을 12 또는 6 웰 플레이트의 웰에 각각 복제한다.
- 37 ° C 배양기 및 암석을 매 15 분마다 놓아서 총 1-1.5 시간의 흡착 기간을 거친다.
- 바이러스 접종원을 제거하고 각 잘 1 ML (12 - 웰) 또는 2 ML (6 - 잘) DMEM - Tragacanth 오버레이를 추가합니다.
참고 : 여기에는 아가로 오스, 한천, 메틸 셀룰로오스 또는 기타 오버레이 미디어를 사용할 수 있습니다. - 5 일 동안 37 ° C 배양기에서 세포를 품어. 적절한 플라크 형성 시간은 사용되는 오버레이에 따라 다릅니다.
- 세포를 고정시키기 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 오버레이를 부드럽게 소독제에 버립니다.
- 커버와 소용돌이가 혼합되도록 각 우물에 충분한 20 % 에탄올 /0.1 % 크리스탈 바이올렛 (CV)을 추가합니다.
참고 : 많은 다른 정착액이 존재하며 여기에서 사용할 수 있습니다. 또한 아가로 오스 또는 한천 오버레이를 사용하는 경우 중성 색과 함께 두 번째 오버레이를 사용하여 고정하지 않고 플라크를 시각화 할 수 있습니다. 20 % 에탄올은이전 연구에서 외피 바이러스를 비활성화시키는 데 효과적입니다. 봉투되지 않은 바이러스는 비활성화되지 않으므로이 금액을 사용하지 마십시오 19 . - 플레이트를 상온에서 30-60 분 동안 배양하십시오 (클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에서). CV (지역 규정에 따라)를 버리고 수돗물로 접시를 씻으십시오.
- 접시를 건조시키고 플라크를 수동으로 계산하십시오.
참고 : 참조 번호 20은 플라크 분석을 수행하기위한 추가 참조 자료로 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 전염성 클론 파생 Zika 바이러스의 복구를 허용합니다. 2 플라스미드 감염 복제 시스템을 조작하는 것은 매우 불안정한 전장 버전 (데이터는 표시되지 않음)과 비교하여 신중하게 수행하면 간단합니다. 두 개의 개별 조각의 소화 및 연결 후, 봉쇄 된 RNA는 Vero 세포 ( 그림 1 )로 electroporated 다음 T7 중합 효소와 시험 관내 전사를 사용하여 생산됩니다. 올바른 플라스미드 서열은 miniprep ( 그림 2a ) 다음에 프록시로 제한 소화를 사용하고 RCA 또는 maxiprep로 대규모 DNA 생산 후 Sanger 시퀀싱을 통해 모니터링 할 수 있습니다. 시퀀싱으로 클론을 확인한 후, 감염성 바이러스의 회복은 소화, 결찰, 시험 관내 전사 및 최종 전기 천공만을 요구한다. 이 단계는 하루 안에 수행 할 수 있습니다. 올바른 digestion 및 ligation은 아가로 오스 겔 전기 영동 ( 그림 2b )으로 모니터링 할 수 있으므로 필요한 경우 문제를 해결할 수 있습니다.
그림 3 에서 볼 수 있듯이, 감염성 클론 유래 바이러스는 여러 세포주 에서 생체 외에서 분리 된 모체와 유사한 수준으로 복제되며, 이는 cDNA로부터 회수 된 바이러스가 1 차 분리 물과 유사하게 복제됨을 암시합니다. 또한 Aedes aegypti 모기의 생존율이나 감염률, 보급율 및 전염 율에서 감염성 클론 유래 바이러스와 모체 검체에서 유의 한 차이는 관찰되지 않았다 ( 그림 4 ).
그림 1 : 두 개의 플라스미드 cDNA 클론으로부터 ZIKV 구조 워크 플로우.ZIKV 균주 PRVABC59의 게놈을 2 개의 분리 된 조각으로 pACYC177 플라스미드 백본에 클로닝 하였다. 2 개의 플라스미드를 소화시키고 T4 DNA 리가 제로 연결시켰다. 캡핑 된 전염성 RNA는 Vero 세포에 전기 영동 한 in vitro transcription을 통해 생성되었다. (도 21 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : cDNA 복제물의 소화 및 결합을 모니터링하기위한 겔 전기 영동. ( A ) 유전 적 안정성을 평가하기 위해 miniprep derived plasmids의 초기 제한 효소 분해. ( B ) 2 플라스미드 클론 시스템으로부터 감염성 바이러스를 회수하는 동안의 소화 및 결합 제품의 예.
그림 3 : 복제 유래 바이러스의 체외 성장 동력 야생형 PRVABC59 및 감염성 클론 유래 바이러스 (SH-SY5Y, Jar 및 NTERA2 cI.D1), 모기 (C6 / 36, Aag2) 및 비인간 영장류 (Vero) 세포주의 플라스 크 분석에 의한 성장 동력을 평가 하였다. n = 3 오차 막대는 평균으로부터의 표준 편차를 나타냅니다. (도 21 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
55857fig4.jpg "/>
그림 4 : 생쥐와 모기에서 클론 유래 바이러스의 생체 내 특성 분석. ( A ) 4 주된 암컷 및 인터페론 알파, 베타 및 감마 수용체 녹아웃 AG129 마우스에 1,000 PFU의 PRVABC59 또는 전염성 클론 유래 바이러스를 복강 내 접종하고 생존을 위해 시간 경과에 따라 모니터링 하였다 (n = 11). Aedes aegypti 모기에는 ZIKV가 포함 된 전염성 혈액을 투여 받았고 14 일 후 해부되었다. ( B ) 플라크 분석은 감염성 바이러스에 대한 모기 (감염), 다리 (보급) 또는 타액 분비 (전염)를 평가하는 데 사용되었습니다. 비율은 시험 된 총 모기의 백분율로 표시한다 (그림 21 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 클론 파생 바이러스의 특성 규명에 도움을 주신 Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic 및 Claudia Rückert에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIH)에서 AI114675 (BJG) 및 AI067380 (GDE) 보조금으로 일부 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
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