Этот протокол описывает восстановление инфекционного вируса Зики из двух плазмидного инфекционного кДНК-клона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Инфекционные кДНК-клоны позволяют генетически модифицировать вирус, тем самым облегчая работу с вакцинами, патогенезом, репликацией, передачей и развитием вируса. Здесь мы описываем создание инфекционного клона для вируса Зика (ZIKV), который в настоящее время вызывает взрывную вспышку в Северной и Южной Америке. Чтобы предотвратить токсичность бактерий, которые обычно наблюдаются с помощью плазмид, полученных из флавивируса, мы создали двухплазмидную систему, которая разделяет геном у NS1-гена и более стабильна, чем полноразмерные конструкции, которые не могут быть успешно восстановлены без мутаций. После переваривания и лигирования для соединения двух фрагментов полноразмерная вирусная РНК может быть получена транскрипцией in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7. После электропорации транскрибируемой РНК в клетки был выделен вирус, который проявлял сходную кинетику роста in vitro и вирулентность и инфекционные фенотипы in vivo у мышей и москитов соответственно.
Введение
Вирус Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) - это флавивирус вируса комаров, который прибыл в Бразилию в 2013-14 годах и впоследствии был связан с массовой вспышкой фебрильной болезни, которая распространилась по всей Америке 1 . Кроме того, ZIKV был связан с тяжелыми последствиями заболевания, такими как синдром Гийена-Барре у взрослых и микроцефалия у плодов и новорожденных 2 . Мало что известно о ZIKV до его быстрого распространения в западном полушарии. Это включало отсутствие молекулярных инструментов, что препятствовало механистическим исследованиям. Молекулярные инструменты для ви....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Трансформирование и восстановление плазмид инфекционных клонов
- Преобразуйте обе плазмиды (отдельно) с использованием коммерческого протокола преобразования ( например , протокола NEB 5 Minute Transformation Protocol) с некоторыми изменениями. Обе плазмиды содержат ген, кодирующий устойчивость к ампициллину, поэтому для отбора используют ампициллин или карбенициллин. Предпочтительным является карбенициллин, поскольку он более стабилен.
- Удалите ячейки (см. Таблицу материалов) с морозильной камеры -80 ° C и оттепель на льду в течение 5-10 мин. Предварительно нагретый лизогенный бульон (LB) (содержащий 10 г / л NaCl и 25 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, описанный здесь, позволяет восстанавливать вирус Zika, зараженный вирусом. Манипулирование системой двух плазмид-инфекционных клонов является простым, когда выполняется с осторожностью, по сравнению с полноразмерными версиями, которые очень нестабильны (данные не показаны). После переваривания и лигирования двух разных кусочков укороченная РНК продуцируется с использованием in vitro транскрипции с полимеразой Т7, которая затем электропорируется в клетки Vero (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной работе мы описываем метод восстановления двусторонней инфекционной системы клонирования кДНК для вируса ZIKV. Ранее описанные клоны ZIKV страдают либо от ослабления, либо требуют добавления интронов, что делает плазмиды больше и препятствует спасению в клетках насекомых. Инфекционный вирус может быть восстановлен с помощью системы двухплазмидных клонов в клетках млекопитающих или насекомых (данные не показаны). Кроме того, вирус, выделенный из этой системы, ведет себя аналогично вирусу дикого типа в нескольких к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Кристен Буллард-Фейбельман, Милену Веселинович и Клаудию Рюкерт за помощь в описании вируса, полученного клонированием. Эта работа была частично поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных болезней NIH по грантам AI114675 (BJG) и AI067380 (GDE).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Карбенициллин, динатриевая соль | различные | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20 000 единиц/мл |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20 000 шт./мл |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10 000 шт./мл |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20 000 шт./мл |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20 000 шт./мл |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20 000 шт./мл |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Щелочная фосфатаза креветок (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1 000 единиц/мл |
| щелочной фосфатазы, теленковый кишечник (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10 000 единиц/мл |
| T4 ДНК Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400 000 единиц/мл |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Другие машины приемлемы. |
| LB Бульон с агаром (Miller) | Sigma | L3147 | Можно приготовить и домашним. |
| Потрясающий бульон Sigma | T0918 | можно приготовить и в домашних условиях. | |
| Чашка Петри | Celltreat | 229693 | |
| пробирки для культур | VWR International | 60818-576 | |
| T75 колбы | Celltreat | 229340 | |
| T182 колбы | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 с L-глутамином | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM с L-глютамином и 4,5 г/л глюкозы | Corning | 10-017-CV | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Трагакант | Порошок MP | Bio MP 104792 | |
| кристаллической фиалкой | Amresco | 0528-1006 | |
| Этанол денатурированный | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6-луночный планшет | Celltreat | 229106 | |
| 12 луночных планшетов | Celltreat | 229111 | |
| секвенирования Oligos | IDT | см. таблицу 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | методы приемлемы. |
| Допустимы Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | другие методы. |
| Допустимы Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | другие методы. |
| Класс II Шкаф биобезопасности | Варьируется | Н/Д | Это необходимо для работы с живым вирусом. |
Ссылки
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
