Summary
Этот протокол описывает восстановление инфекционного вируса Зики из двух плазмидного инфекционного кДНК-клона.
Abstract
Инфекционные кДНК-клоны позволяют генетически модифицировать вирус, тем самым облегчая работу с вакцинами, патогенезом, репликацией, передачей и развитием вируса. Здесь мы описываем создание инфекционного клона для вируса Зика (ZIKV), который в настоящее время вызывает взрывную вспышку в Северной и Южной Америке. Чтобы предотвратить токсичность бактерий, которые обычно наблюдаются с помощью плазмид, полученных из флавивируса, мы создали двухплазмидную систему, которая разделяет геном у NS1-гена и более стабильна, чем полноразмерные конструкции, которые не могут быть успешно восстановлены без мутаций. После переваривания и лигирования для соединения двух фрагментов полноразмерная вирусная РНК может быть получена транскрипцией in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7. После электропорации транскрибируемой РНК в клетки был выделен вирус, который проявлял сходную кинетику роста in vitro и вирулентность и инфекционные фенотипы in vivo у мышей и москитов соответственно.
Introduction
Вирус Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) - это флавивирус вируса комаров, который прибыл в Бразилию в 2013-14 годах и впоследствии был связан с массовой вспышкой фебрильной болезни, которая распространилась по всей Америке 1 . Кроме того, ZIKV был связан с тяжелыми последствиями заболевания, такими как синдром Гийена-Барре у взрослых и микроцефалия у плодов и новорожденных 2 . Мало что известно о ZIKV до его быстрого распространения в западном полушарии. Это включало отсутствие молекулярных инструментов, что препятствовало механистическим исследованиям. Молекулярные инструменты для вирусов, такие как клоны кДНК, способствуют развитию вакцины и антивирусных препаратов, а также позволяют оценить вирусные генетические факторы, связанные с дифференциальным вирусным патогенезом, иммунным ответом и эволюцией вируса.
Известно, что инфекционные клоны флавивируса очень нестабильны у бактерий из-за crВ их геномах присутствуют промотирующие проариотические промоторы 3 . Для облегчения этой проблемы были использованы несколько подходов; Включая введение тандемных повторов перед вирусными последовательностями 4 , мутацию предполагаемых прокариотических промоторных последовательностей 5 , расщепление генома на множественные плазмиды 6 , векторы с небольшим числом копий (включая бактериальные искусственные хромосомы) 7,8 и введение интронов в вирусном геноме 9 , Для ZIKV была описана одна полноразмерная система без модификаций; Однако этот клон, по-видимому, ослабляется в клеточной культуре и у мышей 10 . Другие группы сконструировали интроны в геноме ZIKV, что позволило нарушить неустойчивые последовательности в бактериях, которые могут быть сплавлены в клетках млекопитающих in vitro для производства инфекционного вируса 11, 12 . Кроме того, была успешно использована система на основе ПЦР, озаглавленная «Инфекционно-субгеномные ампликонны», для спасения штампа MR776 прототипа ZIKV 13 . Описанный здесь подход не требует никаких посторонних последовательностей, а скорее разрушает геном в области высокой нестабильности с использованием множества плазмид, которые ранее успешно использовались с желтой лихорадкой 6 , вирусами лихорадки денге 14 , 15 и западного Нила 16 . Кроме того, добавление последовательности рибозима гепатита D на вирусных геномных концах облегчает создание аутентичного 3'-конца без необходимости добавления сайта линеаризации. Кроме того, обе плазмиды сконструированы в низкокопированном числовом векторе (pACYC177, ~ 15 копий на ячейку) для уменьшения любой остаточной токсичности 17 . Выбранный вирус отображает профиль роста, сопоставимый сРодительского вируса в кривых роста in vitro в 8 клеточных линиях, содержащих множество клеточных типов, полученных как от млекопитающих, так и от насекомых, и выявил идентичные патогенные профили у мышей и инфекции, скорости распространения и передачи у комаров 18 .
Здесь подробно описан протокол, описывающий, как выращивать инфекционные клоновые плазмиды, генерировать полноразмерную вирусную РНК (вирусный геном) in vitro и восстанавливать инфекционный вирус в культуре клеток. Во-первых, мы описываем распространение плазмид в бактериях или без бактерий амплификации с использованием усиления кругового круга (RCA). Затем мы покажем, как две плазмиды расщепляются, а затем лигируются вместе для генерации полноразмерного вируса. Наконец, мы описываем производство транскрибируемой РНК и ее последующей электропорации в клетки Vero с последующим титрованием восстановленного вируса ( рис. 1 ). Описанный подход является быстрым, что позволяетR восстановление запасов инфекционных вирусов через 1-2 недели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Трансформирование и восстановление плазмид инфекционных клонов
- Преобразуйте обе плазмиды (отдельно) с использованием коммерческого протокола преобразования ( например , протокола NEB 5 Minute Transformation Protocol) с некоторыми изменениями. Обе плазмиды содержат ген, кодирующий устойчивость к ампициллину, поэтому для отбора используют ампициллин или карбенициллин. Предпочтительным является карбенициллин, поскольку он более стабилен.
- Удалите ячейки (см. Таблицу материалов) с морозильной камеры -80 ° C и оттепель на льду в течение 5-10 мин. Предварительно нагретый лизогенный бульон (LB) (содержащий 10 г / л NaCl и 25 мкг / мл карбенициллина, называемый LB-карб), и бульон с подавлением катаболита (SOC (без антибиотиков) - при приближении к клеткам) при 37 ° C.
- Добавьте от 100 мкг-10 нг в 1 мкл плазмидной ДНК к пробирке, содержащей 50 мкл компетентных клеток; Осторожно перемешайте трубку.
- Инкубируйте пробирки на льду в течение 5 мин.
- Трубы с тепловым шоком при 42 ° C в течение 30 сВ водяной бане. Вернитесь на лед в течение 2 минут сразу после теплового шока.
- Пипетируют 950 мкл комнатной температуры SOC в каждую пробирку и перемешивают пипетированием. Распределите 100 мкл бактериальной смеси на пластине LB-карбюратора и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C (примерно 12-14 часов).
- Удалите пластины из инкубатора с температурой 37 ° C после 12-14 ч инкубации. Поместите пластины в темный ящик при комнатной температуре, чтобы колонии продолжали расти (примерно 8-9 часов).
- Используя 5 мл Terrific бульона (TB, содержащего 25 мкг / мл карбенициллина, называемого TB-carb), выращивают 5-10 небольших колоний для каждой плазмиды в течение ночи при 30 ° C в бактериальном шейкере (примерно 14-16 часов).
ПРИМЕЧАНИЕ. Маленькие колонии являются индикатором того, что плазмида не повреждена; Колонии с плазмидами, содержащие делеции, перегруппировки или мутации (здесь называемые событиями нестабильности), будут расти быстрее и, следовательно, быть больше. Поэтому следует попытаться выбрать самые маленькие колонии на тарелке, в частности, нетT выбрать самые большие колонии. Некоторые полноразмерные колонии также могут быть выбраны для полноты. При использовании более низкой температуры вероятность того, что клетки перерастут (OD 600 больше 0,6-0,8). Поскольку большинство исследователей выполняют ночной рост, это позволяет больше контролировать и уменьшать вероятность разрастания. - Проверьте жидкие культуры на мутность (примерно OD 600 0,6-0,8). Поместите любые мутные трубы при температуре 4 ° C и дайте другим трубам стать мутными, увеличиваясь дольше.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не увеличивайте количество бактерий до значений OD 600 больше, чем рекомендуется, поскольку могут произойти события нестабильности плазмиды. - Экстрагируют плазмидную ДНК из бактерий с помощью коммерческого набора минипрепаратов плазмиды (см. Таблицу материалов). Элюировать в 15 мкл предварительно нагретого (до 70 ° C в нагревательном блоке) элюирующего буфера. Разрешить элюирующий буфер инкубировать на колонке в течение 5 мин перед центрифугированием.
ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте не менее 1 мл этой стартовой культуры при 4 ° C дляДальнейшее использование на следующем этапе. - Дайджест 10 мкл восстановленных плазмид для оценки того, произошли ли события культивирования плазмиды во время культивирования.
ПРИМЕЧАНИЕ. Дайджест p1 с SalI / NheI и p2 с BamHI / HindIII при 37 ° C в течение 1 часа. Подтвердите наличие правильных полос после пищеварения ( рис. 2a ) с помощью гель-электрофореза и перейдите к шагу 2. При приготовлении плазмидной ДНК путем амплификации скользящего круга (RCA) зарезервируйте некоторый элюат miniprep, чтобы служить в качестве шаблона.
2. Получение достаточной плазмидной ДНК для лигирования
ПРИМЕЧАНИЕ. Лигирование и последующая электропорация требуют достаточного количества ДНК плазмиды, которая должна генерироваться либо с помощью maxiprep, либо с помощью RCA. В то время как maxiprep является традиционно используемым подходом, RCA предлагает преимущество, не требующее бактерий, таким образом устраняя потенциал для индуцированной плазмидой токсичности в бактериях, которая может привести к событиям нестабильности.
- Для каждой плазмиды, которая продемонстрировала правильную схему расщепления рестрикционным ферментом в предыдущем разделе, добавьте 500 мкл исходной культуры к 1 л бульона TB-Carb (25 мкг / мл карбенициллина) и встряхните в течение ночи при 30 ° C (примерно 14-16 часов) , Примерно OD 600 0,6-0,8).
ПРИМЕЧАНИЕ. Не позволяйте культуре расти над этим значением OD 600 . Это потенциально может привести к событиям нестабильности внутри плазмид.- Убирайте бактерии и выполняйте maxipreps по протоколу производителя (см. Таблицу материалов).
- Для каждой плазмиды, которая продемонстрировала правильную схему расщепления рестрикционным ферментом в предыдущем разделе, добавьте 500 мкл исходной культуры к 1 л бульона TB-Carb (25 мкг / мл карбенициллина) и встряхните в течение ночи при 30 ° C (примерно 14-16 часов) , Примерно OD 600 0,6-0,8).
- Перенесите 1 мкл плазмидной ДНК в пробирку, содержащую 50 мкл буфера для образцов.
- Денатурируют образец при 95 ° С в течение 3 мин, а затем инкубируют при 4 ° С до готовности к использованию.
- Подготовьте коммерческое усилениеПремикс (см. Таблицу материалов ). Объединить 50 мкл реакционного буфера с 2 мкл ферментной смеси в пробирке, установленной на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ. Премикс амплификации следует хранить на льду до готовности к использованию. Удобно приготовить основную смесь путем объединения достаточных реагентов для необходимого количества реакций амплификации. Любые неиспользованные премиксы должны быть отброшены. - Перенесите 50 мкл готовой амплификации премикса к денатурированному образцу.
- Инкубируйте реакционные трубки при 30 ° C в течение 18 часов.
- Инкубируйте пробирки при 65 ° C в течение 10 минут, чтобы инактивировать ДНК-полимеразу ø29.
- Хранить реакционные трубки при температуре 4 ° C или -20 ° C до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент плазмидную ДНК, полученную с помощью обоих методов, следует количественно оценить (используя абсорбцию при 260 нм), а геном ZIKV должен быть полностью секвенсером, чтобы подтвердить отсутствие событий нестабильности (делеции и перегруппировки) во время подготовки.
| Имя праймера | Последовательность (5 '- 3') |
| ZIKV PRVABC59 1For. | AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC |
| ZIKV Сохранено 632For. | GCCCTATGCTGGATGAGG |
| ZIKV Сохранено 692Rev. | GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG |
| ZIKV Conserved 1313Rev. | CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA |
| ZIKV Conserved 1201For. | CCAACACAAGGTGAAGCCTAC |
| ZIKV Conserved 1663For. | GCAGACACCGGAACTCCACACT |
| ZIKV Conserved 2008For. | CAGATGGCGGTGGACATGC |
| ЗИКВ Сохранено 2350Рев. | GTGAGAACCAGGACATTCCTCC |
| ZIKV Сохранено 2605For. | TACAAGTACCATCCTGACTCCC |
| ЗИКВ Сохранено 3499Rev. | GCCTTATCTCCATTCCATACCA |
| ZIKV Сохранено 3961Rev. | TTGCCAACCAGGCCAAAG |
| ZIKV Сохранено 4132For. | CATTTGTCATGGCCCTGG |
| ZIKV Завершено 4561Rev. | CTATTGGGTTCATGCCACAGAT |
| ZIKV Сохраняется 4665For. | GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT |
| ЗИКВ Сохранено 5189Реев. | AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG |
| ZIKV Задержанный 5219For. | GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA |
| ЗИКВ Сохранено 6086Реев. | CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC |
| ZIKV Conserved 6119For. | GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG |
| ZIKV Conserved 6721Rev. | CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC |
| ZIKV Сохранено 6769For. | CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC |
| ZIKV Conserved 7209Rev. | ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA |
| ZIKV Сохранено 7343For. | GTTGTGGATGGAATAGTGGT |
| ZIKV Conserved 8243For. | TGCCCATACACCAGCACTATGA |
| ZIKV PRVABC59 8893Rev. | TGCATTGCTACGAACCTTGTTG |
| ZIKV сохранен 9133For. | AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA |
| ZIKV PRVABC59 9673Rev. | AACGCAATCATCTCCACTGACT |
| ZIKV Сохранено 9686For. | GATGATAGGTTTGCACATGCC |
| ZIKV Conserved 10321Rev. | GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT |
| ZIKV Conserved 10455For. | CAGGAGAAGCTGGGAAACC |
| ZIKV Сохранено 10621Rev. | CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC |
Таблица 1: Грунты для секвенирования клонов кДНК. Плазмиды можно полностью секвенировать с перечисленными праймерами. Грунты, обозначенные как «консервативные» индиЧто они, вероятно, способны последовательно / амплифицировать все генотипы ZIKV. Грунты, обозначенные как «PRVABC59», специфичны для этого штамма, но могут также работать для других штаммов генотипа Азии и, возможно, других генотипов.
3. Получение транскрибируемой РНК in vitro
- Настройте реакцию пищеварения либо с помощью препарата максипрепа, либо с помощью RCA.
- Для расщепления p1 смешать 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 3 мкл ApaLI, 3 мкл BamHI-HF, 3 мкл rSAP или CIP и 3,3 мкг ДНК p1. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
- Для переваривания p2 смешать 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 3 мкл ApaLI, 3 мкл EcoRI-HF и 13,3 мкг ДНК p2. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
- Инкубируйте при 37 ° C в течение 1-2 часов.
- Очистите, используя коммерческий гель и набор для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов). Элюат в 30 мкл буфера для элюирования, предварительно нагретого до 70 ° C в нагревательном блоке (инкубируйтеКолонку в течение 5 мин перед вращением).
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните 1 мкл для последующего использования на геле.
- Подготовьте реакцию лигирования.
- Объединить 10 мкл 10x T4-ДНК-лигирующего реакционного буфера, 3 мкл ДНК-лигазы T4 (400 U / мкл), 29 мкл очищенного p1 и 29 мкл очищенного p2. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч или 16 ° С в течение ночи.
- Очистите, используя коммерческий гель и набор для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов). Элюировать в 10 мкл буфера для элюирования, предварительно нагретого до 70 ° C в нагревательном блоке (инкубируйте колонку в течение 5 минут перед вращением).
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните 1 мкл для последующего использования на геле.
- Проводят непереваренные плазмиды, расщепленные плазмиды и лигирование на агарозном геле. Продукт лигирования должен иметь более высокую молекулярную массу (около 11 т.п.н.), чем сама переваренная плазмида, что указывает на успешность лигирования ( рисунок 2b ).
- Настроить реакцию транскрипции in vitro T7.
- Объединить 10 мкл 2x ARCA / NTP Mix, 2 мкл смеси РНК-полимеразы T7 и 8 мкл очищенной реакции лигирования для конечного объема 20 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ. ARCA, входящая в состав смеси, представляет собой аналог крышки, который включен исключительно в правильную ориентацию. Стандартные колпачные аналоги могут привести только к ~ 50% транскриптов, имеющих колпачок в правильной ориентации. - Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° C.
- Измерьте концентрацию РНК через УФ-спектрофотометр. По желанию, запустите денатурирующий агарозный гель, чтобы подтвердить длину транскрипта РНК.
- Объединить 10 мкл 2x ARCA / NTP Mix, 2 мкл смеси РНК-полимеразы T7 и 8 мкл очищенной реакции лигирования для конечного объема 20 мкл.
4. Спасение инфекционного вируса электропорацией
- Дней до электропорации, готовят 1 колбу T182 клеток Vero (между T150 и T182 приемлемо, выращивают в DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS)) на каждую подлежащую восстановлению конструкцию. Включите 1 T182 в качестве контроля над трансфекцией. CeLls следует использовать при слиянии 70-80%.
- Когда клетки готовы, поместите 12 мл / реакцию DMEM + 15% FBS + 10 мМ HEPES на водяной бане, нагретой до 37 ° C.
- Отсоединяйте клетки путем трипсинизации со стандартным протоколом и восстанавливайте клетки в средах с 10% FBS для инактивации трипсина; Центрифужных клеток при 150 × g в течение 5 мин при 4 ° С.
- Промывают клетки в 1х фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), гранулируют клетки при 150 × g в течение 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг дважды, в общей сложности три промывки.
- Ресуспендируют клетки в 200 мкл RPMI 1640 + 10 мМ HEPES (стерильные) на 1 образец. Передайте 200 мкл клеточной суспензии в стерильную пробирку. Клетки должны составлять ~ 0,5 × 10 7 клеток / мл.
- Добавьте 20 мкл воды (mock neg. Control) или 20 мкл РНК (предпочтительно 5-10 мкг), полученных на этапе 3.4, в каждый набор клеток. Смешайте осторожно, щелкнув трубку и перенесите содержимое трубки в кювету для электропорации с зазором 2 мм.
- Установите электр.Oporator до 170 V LV, омега (сопротивление) при 0 и 950 мкФ (примерно до 625 В / см и постоянная времени 20 мс для других машин). Установите сопротивление на самую низкую доступную настройку, либо 0, либо ∞, если она доступна.
- Импульс один раз и сразу добавляют 600 мкл DMEM + 15% FBS + 10 мМ HEPES, который нагревается на шаге 4.2. Тщательно промойте внутри кюветы, чтобы удалить все клетки. Добавить клетки в колбу для тканевой культуры T75, содержащую 10 мл предварительно нагретой среды. Удалите дополнительный носитель из кюветы с помощью капельницы, которая входит в кювету. Будьте осторожны, чтобы поддерживать бесплодие.
- Вихревую колбу для смешивания среды и клеток и помещения в инкубатор 37 ° C.
- Проверьте на следующий день жизнеспособность клеток и делайте это каждый день до тех пор, пока не будет наблюдаться клеточная смерть 50-75%. Смертность клеток наблюдается по сравнению с макетным электропористым контролем.
ПРИМЕЧАНИЕ. Цитопатический эффект ZIKV (CPE) довольно выражен в клетках Vero, что приводит к округлению клеток, которые отделяются и плавают в культуральной среде. У нас естьНаблюдал диапазон 8-10 дней как идеальный для сбора урожая. - Убирают супернатант в конической трубке и центрифугируют для удаления клеточного мусора при> 3000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Удалите осветленный супернатант в новую пробирку и добавьте конечную концентрацию 20% FBS (из 100% запаса). Кроме того, добавьте стерильный HEPES при конечной концентрации 10 мМ в качестве буферного агента для сохранения вирусной инфекционности при замораживании (из 1 М стерильного фонда).
- Смешать вирус путем встряхивания и аликвоты в флаконы с крышкой. Хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
5. Титрование восстановленного вируса
- Выделите соответствующее количество 6- или 12-луночных планшетов клеток Vero за день до титрования.
- Удалите вирус из морозильника и сделайте серийные 10-кратные разведения в DMEM + 2% FBS в пробирках или 96-луночных планшетах.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидаемый титр из восстановленных клонов составляет от 1 × 10 6 до 5 × 10 7 ПФУ / мл. - Добавить 200 oR 400 мкл каждого разведения в дубликате до лунки 12- или 6-луночного планшета, соответственно.
- Поместите пластины в 37 ° C инкубатор и скалу каждые 15 минут, в течение всего 1-1,5 часа адсорбции.
- Удалите вирусный инокулят и добавьте 1 мл (12-луночных) или 2 мл (6-луночный) DMEM-трагакантовая накладка в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь можно использовать агарозу, агар, метилцеллюлозу или другие оверлейные среды. - Инкубируйте клетки в инкубаторе 37 ° C в течение 5 дней. Время для правильного формирования бляшек будет зависеть от используемого наложения.
- Чтобы исправить клетки, удалите пластины из инкубатора и осторожно наложите на дезинфицирующее средство.
- Добавьте достаточное количество 20% этанола / 0,1% кристаллического фиолетового (CV) в каждую лунку для покрытия и завихрения для смешивания.
ПРИМЕЧАНИЕ. Многие другие фиксаторы существуют и могут быть использованы здесь. Кроме того, при использовании наложения агарозы или агара можно использовать второй наложение в сочетании с нейтральным красным для визуализации бляшек без фиксации. Показано, что 20% этанолаЭффективные при инактивации окутанных вирусов в предыдущих исследованиях; Не используйте эту сумму для незараженных вирусов, так как они не будут инактивированы 19 . - Инкубируйте планшеты в течение 30-60 мин при комнатной температуре (в шкафу биобезопасности класса II); Отказаться от CV (в соответствии с местными правилами) и вымыть плиты водопроводной водой.
- Позвольте плитам высохнуть и вручную посчитайте бляшки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ссылка 20 может использоваться в качестве дополнительной справки для проведения анализов на бляшек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный здесь, позволяет восстанавливать вирус Zika, зараженный вирусом. Манипулирование системой двух плазмид-инфекционных клонов является простым, когда выполняется с осторожностью, по сравнению с полноразмерными версиями, которые очень нестабильны (данные не показаны). После переваривания и лигирования двух разных кусочков укороченная РНК продуцируется с использованием in vitro транскрипции с полимеразой Т7, которая затем электропорируется в клетки Vero ( рисунок 1 ). Корректную плазмидную последовательность можно контролировать с использованием рестрикционного расщепления в качестве прокси после минипрепа ( рис. 2а ) и секвенирования Сэнгера после крупномасштабной продуцирования ДНК с помощью RCA или maxiprep. После подтверждения клонов путем секвенирования восстановление инфекционного вируса требует только переваривания, лигирования, транскрипции in vitro и, наконец, электропорации. Эти шаги могут быть выполнены за один день. Правильный выборСтента и лигирования можно контролировать с помощью электрофореза в агарозном геле ( рисунок 2b ), что позволяет устранить неисправность, если это необходимо.
Как показано на фиг. 3 , вирус инфицированного клона реплицируется до аналогичных уровней, таких как родительский изолят in vitro, в нескольких клеточных линиях, что указывает на то, что выделенный вирус из кДНК реплицируется аналогично первичному изоляту. Кроме того, между вирусом, зараженным вирусом клонирования, и родительским изолятом не наблюдалось существенных различий в показателях выживаемости у мышей или темпах инфицирования, распространения и передачи у комаров Aedes aegypti ( рис. 4 ).
Рисунок 1: Рабочий процесс спасения ZIKV из двух плазмидного кДНК-клона.Геном штамма ZIKV PRVABC59 клонировали в две отдельные части в плазмидную основу pACYC177. Две плазмиды затем расщепляли и лигировали с ДНК-лигазой T4. Зараженную инфекционную РНК затем продуцировали через транскрипцию in vitro с последующей электропорацией в клетки Vero. (Рисунок адаптирован из ссылки 21 ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Электрофорез геля для контроля пищеварения и лигирования клона кДНК. ( A ) Первоначальное рестрикционное переваривание индуцированных miniprep плазмид для оценки генетической стабильности. ( B ) Примеры продуктов переваривания и лигирования во время восстановления инфекционного вируса из системы двух плазмидных клонов.
Рисунок 3: Кинетика роста in vitro вируса, полученного клоном. Кинетику роста вируса PRVABC59 дикого типа и вируса инфекционного клона на клеточных линиях человека (SH-SY5Y, Jar и NTERA2 cI.D1), комаров (C6 / 36, Aag2) и нечеловеческих (Vero) оценивали с помощью анализа бляшек. N = 3 Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение от среднего значения. (Рисунок адаптирован из ссылки 21 ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
55857fig4.jpg "/>
Рисунок 4: Характеристика in vivo вируса, полученного клоном, у мышей и комаров. ( A ) 4-недельный мужской и женский интерферон альфа, бета-и гамма-рецепторный нокаут, AG129, мышам внутрибрюшинно инокулировали 1000 PFU PRVABC59 или вирус инфекционного клона и контролировали с течением времени для выживания (n = 11). Aedes aegypti москитам была дана инфекционная кровь, содержащая ZIKV, и расселась 14 дней спустя. ( B ) Анализы бляшек использовались для оценки москитных тел (инфекции), ног (распространения) или секреции слюны (передачи) для инфекционного вируса. Тарифы представлены как процент от общего количества комаров, которые были протестированы (рисунок адаптирован из ссылки 21 ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Кристен Буллард-Фейбельман, Милену Веселинович и Клаудию Рюкерт за помощь в описании вируса, полученного клонированием. Эта работа была частично поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных болезней NIH по грантам AI114675 (BJG) и AI067380 (GDE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
