Räddning och karaktärisering av rekombinant virus från en ny världsinfektiös klon från Zika Virus
Summary
Detta protokoll beskriver återhämtningen av infektiös Zika-virus från en infektion med två plasmider med cDNA-klon.
Abstract
Infektiösa cDNA-kloner möjliggör genetisk manipulation av ett virus, vilket underlättar arbetet med vacciner, patogenes, replikation, överföring och viral utveckling. Här beskriver vi konstruktionen av en infektiös klon för Zika-virus (ZIKV), som för närvarande orsakar ett explosivt utbrott i Amerika. För att förhindra toxicitet för bakterier som vanligen observeras med flavivirus-härledda plasmider genererade vi ett två-plasmidsystem som separerar genomet hos NS1-genen och är stabila än konstruktioner i full längd som inte lyckades återvinnas utan mutationer. Efter digestion och ligering för att ansluta till de två fragmenten, kan viralt RNA i full längd alstras genom in vitro transkription med T7 RNA-polymeras. Efter elektroporation av transkriberad RNA i celler erhölls virus som uppvisade liknande in vitro- tillväxtkinetik och in vivo virulens- och infektionsfenotyper hos respektive mus och myggor.
Introduction
Zika-virus (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) är ett myggburen flavivirus som anlände till Brasilien 2013-14 och var därefter associerat med ett massivt utbrott av febril sjukdom som spred sig över hela Amerika 1 . Dessutom har ZIKV kopplats till svåra sjukdomsutfall, såsom Guillain-Barré-syndrom hos vuxna och mikrocefali hos foster och nyfödda 2 . Lite var känt om ZIKV före dess snabba spridning på västra halvklotet. Detta innebar en brist på molekylära verktyg, vilket hindrade mekanisk forskning. Molekylära verktyg för virus, såsom infektiösa cDNA-kloner, underlättar vaccin och antiviral terapeutisk utveckling och möjliggör bedömning av virala genetiska faktorer relaterade till differentiell viral patogenes, immunsvar och viral utveckling.
Flavivirus-infektiösa kloner är kända att vara mycket instabila i bakterier på grund av crYptiska prokaryota promotorer närvarande i deras genomer 3 . Flera metoder har använts för att förbättra problemet. Innefattande införande av tandemrepetitioner uppströms virala sekvenser 4 , mutation av förmodade prokaryota promotorsekvenser 5 , splittring av genomet i multipla plasmider 6 , vektorer med låg kopiantal (inklusive bakteriella artificiella kromosomer) 7 , 8 och införande av introner i virusgenomet 9 . Ett heltidssystem utan modifikationer har beskrivits för ZIKV; Emellertid tycks denna klon dämpas i cellodling och hos möss 10 . Andra grupper har konstruerat introner i ZIKV-genomet, vilket möjliggör störning av instabila sekvenser i bakterier som kan spliceras ut i däggdjursceller in vitro för framställning av infektiöst virus 11, 12 . Dessutom har ett PCR-baserat system med titeln Infektiösa-Subgenomic-Amplicons använts framgångsrikt för att rädda prototypen MR766-stammen av ZIKV 13 . Tillvägagångssättet som beskrivs här kräver inga främmande sekvenser, men förvränger snarare genomet i regionen med hög instabilitet genom att använda flera plasmider, som tidigare har använts framgångsrikt med gul feber 6 , dengue 14 , 15 och västnilevirus 16 . Vidare underlättar tillägget av hepatit D-ribozym-sekvensen vid den virala genomiska terminen skapandet av en autentisk 3'-ände utan behovet av tillsats av en linjäriseringsplats. Dessutom konstrueras båda plasmiderna i en vektor med låg kopiantal (pACYC177, ~ 15 kopior per cell) för att mildra eventuell återstående toxicitet 17 . Viruset som återvinns visar en tillväxtprofil som kan jämföras medFöräldravirus i in vitro -tillväxtkurvor i 8 cellinjer innefattande en mångfald celltyper härledda från både däggdjur och insekter och har uppvisat identiska patogena profiler i möss och infektion, spridning och överföringshastigheter i myggor 18 .
Här beskriver vi ett protokoll som beskriver hur man odlar de infektiösa klonplasmiderna, genererar viruslängder med full längd (virusgenomet) in vitro och återställer infektiöst virus i cellodling. Först beskriver vi propagation av plasmider i bakterier eller bakteriefri amplifiering med användning av rullcirkelförstärkning (RCA). Därefter visar vi hur de två plasmiderna smälts och sedan ligeras tillsammans för att generera virus i full längd. Slutligen beskriver vi produktionen av transkriberat RNA och dess efterföljande elektroporation i Vero-celler, följt av titrering av återvunnet virus ( Figur 1 ). Tillvägagångssättet som beskrivs är snabbt, vilket möjliggör foR återhämtning av infektiösa virusbestånd i 1-2 veckor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic och Claudia Rückert för deras hjälp för att karakterisera det klonbaserade viruset. Detta arbete stöddes delvis genom bidrag från National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH under bidrag AI114675 (BJG) och AI067380 (GDE).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
References
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
