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Immunology and Infection

एक नई दुनिया Zika वायरस संक्रमित क्लोन से पुनः संयोजक वायरस के बचाव और विशेषता

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/55857
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Division of Vector-Borne Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Summary

यह प्रोटोकॉल संक्रामक Zika वायरस की दो-प्लाज्मिड संक्रामक सीडीएनए क्लोन से पुनर्प्राप्ति का वर्णन करता है।

Abstract

संक्रामक सीडीएनए क्लोन वायरस के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, इस प्रकार टीके, रोगजनन, प्रतिकृति, संचरण और वायरल विकास पर काम करने में मदद करते हैं। यहां हम ज़िका वायरस (जेडआईकेवी) के लिए संक्रामक क्लोन के निर्माण का वर्णन करते हैं, जो वर्तमान में अमेरिका में एक विस्फोटक प्रकोप पैदा कर रहा है। आमतौर पर फ्लैविवायरस-व्युत्पन्न प्लास्मिड के साथ जीवाणुओं को विषाक्तता को रोकने के लिए, हमने एक दो-प्लाज्मिड प्रणाली उत्पन्न की जो एनएस 1 जीन में जीनोम को अलग करती है और पूर्ण-लंबाई वाले निर्माणों से अधिक स्थिर होती है, जो उत्परिवर्तनों के बिना सफलतापूर्वक पुनर्प्राप्त नहीं की जा सकती। दो टुकड़ों में शामिल होने के लिए पाचन और बंधन के बाद, पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ के साथ उत्पन्न हो सकता है। कोशिकाओं में लिखित आरएनए के इलेक्ट्रोप्लोरेशन के बाद, वायरस को वसूला गया था जो कि इन विट्रो विकास कैनेटीक्स में और विवो विषाक्तता और चूहों और मच्छरों में संक्रमण के phenotypes में क्रमशः प्रदर्शित किया गया था।

Introduction

ज़िका वायरस (जीआईआईकेवी; फ़ैमिली फ्लैविविरिडे : जीनस फ्लैवियरस ) एक मच्छर से पैदा हुआ फ्लैवियर है जो 2013-14 में ब्राजील पहुंचा था और बाद में अमेरिका के 1 में फैल जाने वाली बुखार की बीमारी के बड़े पैमाने पर फैलने से जुड़ा था। इसके अलावा, ZIKV गंभीर रोग परिणामों से जुड़ा हुआ है, जैसे कि वयस्कों में गिलेन-बैर सिंड्रोम और भ्रूणों और नवजात 2 में माइक्रोसेफली। पश्चिमी गोलार्ध में तेज़ी से फैल जाने से पहले ज़िंक के बारे में बहुत कुछ जाना जाता था। इसमें आणविक टूल की कमी शामिल है, इस प्रकार तंत्रिकी अनुसंधान में बाधा है। वायरस के लिए आणविक उपकरण, जैसे संक्रामक सीडीएनए क्लोन, वैक्सीन और एंटीवायरल चिकित्सीय विकास की सुविधा प्रदान करते हैं, और वायरल आनुवांशिक वायरल रोगजनन, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और वायरल विकास से जुड़े वायरल आनुवंशिक कारकों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं।

फ्लैवियरस संक्रामक क्लोन सीआर के कारण बैक्टीरिया में अत्यधिक अस्थिर होने के कारण जाना जाता हैYptic prokaryotic प्रमोटर अपने जीनोम में मौजूद 3 इस समस्या को सुधारने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है; अग्रगण्य अनुक्रमों के ऊपर की तरफ दोहराता सहित 4 , उत्परिवर्तित प्रोकर्यियोटिक प्रमोटर अनुक्रम 5 का उत्परिवर्तन, कई प्लाज्मिड में जीनोम को विभाजित करना 6 , कम प्रतिलिपि संख्या वैक्टर (बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों सहित) 7 , 8 और वायरल जीनोम में इंट्रंस को सम्मिलित करना 9 । संशोधनों के बिना एक पूर्ण लंबाई प्रणाली को ZIKV के लिए वर्णित किया गया है; हालांकि, इस क्लोन को सेल संस्कृति और चूहों 10 में तनु बना दिया गया । अन्य समूहों ने जीआईकेवी जीनोम में प्रवेश किया है, जिससे बैक्टीरिया में अस्थिर अनुक्रमों के विघटन की अनुमति मिलती है, जो इन विट्रो में स्तनधारी कोशिकाओं में संक्रामक वायरस के उत्पादन के लिए बाहर की जा सकती है।, 12 इसके अतिरिक्त, पीसीआईआर-आधारित सिस्टम नामक संक्रमित-उप-आनुवंशिक-एम्प्लिक्सन को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है जो कि ZIKV 13 के प्रोटोटाइप MR766 तनाव को बचाता है। यहां वर्णित दृष्टिकोण के लिए कोई विदेशी अनुक्रम नहीं है, बल्कि कई प्लास्मिड का उपयोग करके उच्च अस्थिरता के क्षेत्र में जीनोम को बाधित करता है, जिसे पहले पीले बुखार 6 , डेंगू 14 , 15 और पश्चिम नाइल वायरस 16 के साथ सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, वायरल जीनोमिक टर्मिनिनी में हेपेटाइटिस डी रिबोयोइम अनुक्रम के अलावा एक रैखिकरण साइट के अलावा बिना किसी प्रामाणिक 3 'अंत के निर्माण की सुविधा है। इसके अतिरिक्त, किसी भी अवशिष्ट विषाक्तता को कम करने के लिए दोनों प्लास्मिड कम प्रतिलिपि संख्या वेक्टर (pACYC177, ~ 15 प्रति प्रति प्रति सेल) में बनाए गए हैं इस वायरस को ठीक से वृद्धि प्रोफाइल प्रदर्शित करता है जो इसके लिए तुलनीय हैइन विट्रो वृद्धि में माता-पिता का वायरस 8 सेल लाइनों में घटता है, जिसमें विभिन्न प्रकार के स्तनधारी और कीड़ों से प्राप्त सेल प्रकार होते हैं, और मच्छरों में संक्रमण, फैलाव और ट्रांसमिशन दरों में समान रोगजनक प्रोफाइल का प्रदर्शन किया है।

इस प्रकार, हम संक्रामक क्लोन प्लास्मिड को विकसित करने के तरीके के बारे में एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं , इन विट्रो में पूर्ण लंबाई वाले वायरल आरएनए (वायरल जीनोम) उत्पन्न करते हैं और सेल संस्कृति में संक्रामक वायरस को पुनर्प्राप्त करते हैं। सबसे पहले, हम रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) का उपयोग कर बैक्टीरिया या जीवाणु-मुक्त प्रवर्धन में प्लास्मिड के प्रसार का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम दिखाते हैं कि कैसे दो प्लास्मिड को पचाने जाते हैं और फिर बाद में पूर्ण लंबाई वाली वायरस उत्पन्न करने के लिए एक साथ ligated। अंत में, हम लिखित आरएनए और इसके बाद के electroporation का उत्पादन वेरो कोशिकाओं में करते हैं, जिसके बाद वसूली के वायरस ( चित्रा 1 ) का अनुकरण किया जाता है। वर्णित दृष्टिकोण तेजी से, के लिए अनुमति है1-2 सप्ताह में संक्रामक वायरस शेयरों की वसूली।

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Protocol

1. संक्रामक क्लोन प्लास्मिड्स का रूपांतरण और पुनर्प्राप्ति

  1. कुछ परिवर्तनों के साथ एक व्यावसायिक परिवर्तन प्रोटोकॉल ( जैसे , एनईबी 5 मिनट ट्रांसप्रोग्राफिक प्रोटोकॉल) का उपयोग करके दोनों प्लास्मिड (अलग से) बदल दें। दोनों प्लास्मिड में एम्पीसिलीन प्रतिरोध के लिए जीन एन्कोडिंग होते हैं, इसलिए चयन के लिए एम्पीसिलीन या कार्बेनसिलीन का उपयोग करें। कार्बेनिसिलिन को पसंद किया जाता है, क्योंकि यह अधिक स्थिर है।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र से कोशिकाओं को निकालें (सामग्री तालिका देखें) और 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलना प्रीवार्म लैज़ोजेनी शोरबा (एलबी) (37 ग्राम / एल नाओल और 25 ग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन; एलबी-कार्ब नामक प्लेट) और पेटी दमन के साथ शोरबा (एसओसी (बिना एंटीबायोटिक) - कोशिकाओं के साथ आने वाली 37 डिग्री सेल्सियस
    2. 1 μL में प्लाज्मिड डीएनए में 100 पीजी -10 एनजी के बीच में सक्षम कोशिकाओं के 50 μL युक्त ट्यूब में जोड़ें; ट्यूब को फ्लिक करने से धीरे से मिश्रण करें
    3. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब सेते हैं
    4. 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर हीट सदमे ट्यूबपानी के स्नान में गर्मी झटका के तुरंत बाद 2 मिनट के लिए बर्फ पर लौटें
    5. पिपेट 950 μL कमरे के तापमान एसओसी प्रत्येक ट्यूब में और pipetting द्वारा मिश्रण। एलबी-कारब प्लेट पर 100 जीवाणु मिश्रण के 100 μL फैलते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस (लगभग 12-14 एच) पर रात भर सेते हैं।
  2. 12-14 एच ऊष्मायन के बाद 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से प्लेट्स निकालें। कमरे के तापमान पर एक काले दराज में प्लेस प्लेस करें जिससे कॉलोनियों को बढ़ने की अनुमति मिलती है (लगभग 8- 9 घंटे)।
  3. जीवाणु प्रकार के बाक़ी (मोटे तौर पर 14-16 एच) में 30 डिग्री सेल्सियस पर हर प्लाज्मिड के लिए 5-10 छोटे कालोनियों को विकसित करने के लिए 5 एमएल की शानदार ब्रोथ (टीबी, टीबी-कार्ब नामक 25 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनीसिलिन युक्त) का उपयोग करना।
    नोट: लघु कालोनियों का संकेत है कि प्लाज्मिड बरकरार है; विलोपन, पुनर्व्यवस्था या उत्परिवर्तन (यहां अस्थिरता घटना कहा जाता है) वाले प्लास्मिड के साथ उपनिवेशों में तेजी से वृद्धि होगी, और इस प्रकार बड़ी होनी चाहिए। इसलिए, किसी को प्लेट पर छोटी कॉलोनियों को लेने का प्रयास करना चाहिए, विशेष रूप से नहींवर्तमान में सबसे बड़ी कॉलोनियों का चयन नहीं कर रहा है। कुछ मध्यम आकार की कालोनियों को भी पूर्णता के लिए चुना जा सकता है। कम तापमान का उपयोग करने की संभावना कम हो जाती है कि कोशिकाएं अधिक हो जाएंगी (OD 600 से अधिक 0.6-0.8)। जैसा कि अधिकांश शोधकर्ता रातोंरात वृद्धि करते हैं, यह अधिक नियंत्रण और अतिवृद्धि का कम मौका देता है।
  4. अशांति के लिए तरल संस्कृतियों की जांच करें (मोटे तौर पर ओडी 600 का 0.6-0.8)। 4 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी टरबाइड ट्यूब्स को रखें और अन्य ट्यूबों को लंबे समय तक बढ़कर टरबाइड बनने दें।
    नोट: प्लाज्मिड अस्थिरता घटनाएं हो सकती हैं, क्योंकि अनुशंसित से अधिक 600 मूल्यों में बैक्टीरिया बढ़ाना न हो।
  5. एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिनिप्रॉप किट (सामग्री तालिका देखें) के साथ जीवाणु से प्लाज्मिड डीएनए निकालें। पूर्व गर्म (15 डिग्री सेल्सियस एक हीटिंग ब्लॉक में) 15 μL Elute बफर में Elute। अल्युशन बफर को सेंट्रीफ्यूगेशन से पहले 5 मिनट के लिए कॉलम पर सेते रहने दें।
    नोट: इस स्टार्टर संस्कृति के कम से कम 1 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस पर सुरक्षित रखेंअगले चरण में आगे का उपयोग करें
  6. रोगग्रस्त अस्थिरता घटनाओं संस्कृति के दौरान हुई है या नहीं यह आकलन करने के लिए बरामद प्लाज्मिड के 10 μL डाइजेस्ट करें।
    नोट: सैली / नाथी और पी 2 के साथ डाईजेस्ट पी 1 बामहि / हिंदुइआई के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 घंटे। जेल वैद्युतकणसंचिकरण द्वारा पाचन ( चित्रा 2 ए ) के बाद सही बैंड की उपस्थिति की पुष्टि करें और चरण 2 पर आगे बढ़ें। रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) द्वारा प्लाज्मिड डीएनए की तैयारी करते हुए, कुछ टेम्पलेट के रूप में काम करने के लिए मिलिप्रेप एल्यूट में से कुछ आरक्षित करें।

Ligation के लिए पर्याप्त प्लाज्मिड डीएनए की तैयारी

नोट: लगीकरण और बाद में इलेक्ट्रोपार्जन को पर्याप्त मात्रा में प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता होती है, जो कि अधिकतमप्रॉप या आरसीए के माध्यम से उत्पन्न होनी चाहिए। जबकि मैक्सिप्रैप पारंपरिक तौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला दृष्टिकोण है, आरसीए बैक्टीरिया की आवश्यकता नहीं होने का लाभ प्रदान करता है, इस प्रकार बैक्टीरिया में प्लाज्मिड-प्रेरित विषाक्तता की संभावना को दूर करता है जिससे अस्थिरता की घटनाएं हो सकती हैं।

  2. प्रत्येक प्लाज्मिड के लिए जो पिछले खंड में सही प्रतिबंध एंजाइम पाचन पैटर्न का प्रदर्शन करता है, 1 लीटर टीबी-कार्ब (25 माइक्रोग्राम / एमएल कार्बेनिसिलिन) शोरबा में 500 μL स्टार्टर संस्कृति जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस (लगभग 14-16 एच , 0.6-0.8 के लगभग ओडी 600 )।
    नोट: संस्कृति को इस आयुध 600 के मूल्य से बढ़ने की अनुमति न दें। यह संभावित रूप से प्लास्मिड के भीतर अस्थिरता की घटनाओं में परिणाम देगा।
  3. बैक्टीरिया काटा और निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री तालिका देखें) के अनुसार अधिकतमप्राप्ति करें।
  • चरण 1.6 से सहेजे गए मिलिपरेप का उपयोग करते हुए, आरसीए प्रक्रिया के लिए निम्नलिखित का पालन करें।
    1. नमूना बफर के 50 μL युक्त ट्यूब में प्लाज्मिड डीएनए के 1 μL को स्थानांतरित करें।
    2. 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर नमूना गरम करें, और तब उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेवन करें।
    3. वाणिज्यिक प्रवर्धन तैयार करेंप्रीमिक्स ( सामग्री तालिका देखें) बर्फ पर सेट ट्यूब में एंजाइम मिश्रण के 2 μL के साथ प्रतिक्रिया बफर के 50 μL का मिश्रण करें।
      नोट: उपयोग के लिए तैयार होने तक प्रवर्धन प्रीिक्स को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की अपेक्षित संख्या के लिए पर्याप्त अभिकर्मकों के संयोजन के द्वारा मास्टर मिक्स तैयार करना सुविधाजनक है। कोई अप्रयुक्त प्रीमिक्स छोड़ा जाना चाहिए।
    4. विकृत नमूने के लिए तैयार प्रवर्धन प्रीमिक्स के 50 μL स्थानांतरित करें।
    5. 18 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूब सेते हैं।
    6. ट्यूबों को 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ø29 डीएनए पोलीमरेज़ निष्क्रिय करने के लिए।
    7. उपयोग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूबों को स्टोर करें।
      नोट: इस बिंदु पर, दोनों तरीकों के माध्यम से तैयार प्लाज्मिड डीएनए (260 एनएम पर शोषक का उपयोग करके) मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए और ZIKV जीनोम को सेंजर क्रमबद्ध होना चाहिए ताकि पूरी तरह से अस्थिरता की घटनाओं की पुष्टि हो सके (तैनाती और पुनर्व्यवस्था) तैयारी के दौरान हुई।
    • प्राइमर का नाम अनुक्रम (5 '- 3')
    ZIKV PRVABC59 1For AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
    ZIKV संरक्षित 632 के लिए GCCCTATGCTGGATGAGG
    ZIKV संरक्षित 692Rev GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
    ZIKV संरक्षित 1313Rev CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
    ज़ीकेवी 1201 के लिए संरक्षित CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
    ZIKV संरक्षित 1663 GCAGACACCGGAACTCCACACT
    ज़ीकवी संरक्षित 2008 के लिए CAGATGGCGGTGGACATGC
    ZIKV संरक्षित 2350Rev GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
    ज़ीकेवी संरक्षित 2605 TACAAGTACCATCCTGACTCCC
    ZIKV संरक्षित 3499Rev GCCTTATCTCCATTCCATACCA
    ZIKV संरक्षित 3961Rev TTGCCAACCAGGCCAAAG
    जेआईकेवी 4132 के लिए संरक्षित CATTTGTCATGGCCCTGG
    ZIKV संरक्षित 4561Rev CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
    जेआईकेवी 4665 के लिए संरक्षित GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
    ZIKV संरक्षित 5189Rev AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
    ज़ीकेवी संरक्षित 521 9 के लिए GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
    ZIKV संरक्षित 6086Rev CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
    ज़ीकेवी संरक्षित 611 9 GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
    ZIKV संरक्षित 6721Rev CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
    ज़ीकेवी संरक्षित 6769 CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
    ZIKV संरक्षित 720 9Rev ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
    ZIKवी संरक्षित 7343 GTTGTGGATGGAATAGTGGT
    ज़ीकेवी संरक्षित 8243 TGCCCATACACCAGCACTATGA
    ZIKV PRVABC59 8893Rev TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
    जेआईकेवी 9133 के लिए संरक्षित AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
    ज़ीकेवी पीआरवीएबीसी 6 9 6 9 673 रेव AACGCAATCATCTCCACTGACT
    ज़ीकेवी संरक्षित 9686 के लिए GATGATAGGTTTGCACATGCC
    ZIKV संरक्षित 10321Rev GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
    ज़ीकेवी संरक्षित 10455 CAGGAGAAGCTGGGAAACC
    ZIKV संरक्षित 10621Rev CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

    तालिका 1: सीडीएनए क्लोन के अनुक्रमण के लिए प्राइमर्स प्लास्मिड को लिखे गए प्राइमरों के साथ पूरी तरह अनुक्रमित किया जा सकता है। प्राइमर्स को "संरक्षित" इंडी के रूप में चिह्नित किया गयावह कैट जो कि वे ZIKV के सभी जीनोटाइपों को अनुक्रम / बढ़ाना चाहते हैं। प्राइमरों को "पीआरवीएबीसी 5 9 5 9" के रूप में चिह्नित किया गया है जो इस तनाव के लिए विशिष्ट है लेकिन यह अन्य एशियाई जीनोटाइप उपभेदों और संभवतः अन्य जीनोटाइप के लिए भी काम कर सकता है।

    3. विट्रो लिखित आरएनए में तैयारी

    1. अधिकतमप्रतिप या आरसीए तैयार डीएनए की पाचन प्रतिक्रिया सेट करें।
      1. पी 1 पाचन के लिए, 10 μL 10x प्रतिक्रिया बफर, 3 μL ऑफ एपीएलआई, 3 μL बामिया-एचएफ, 3 μL आरएसएपी या सीआईपी, और 3.3 μg पी 1 डीएनए मिलाएं। डीडीएच 2 ओ से 100 μL जोड़ें।
      2. पी 2 पाचन के लिए, 10 μL 10x रिएक्शन बफर, 3 μL ऑफ एपीएलआई, 3 μL इकोरी-एचएफ, और 13.3 माइक्रोग्राम पी 2 डीएनए मिलाएं। डीडीएच 2 ओ से 100 μL जोड़ें।
      3. 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं
      4. एक वाणिज्यिक जेल और पीसीआर क्लीन अप किट का उपयोग करके शुद्ध करें (सामग्री तालिका देखें)। एल्यूएशन बफर के 30 μL में गरम करना, हीटिंग ब्लॉक में 70 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व गरमकताई से पहले 5 मिनट के लिए कॉलम)
        नोट: एक जीएल को बाद में चलने के लिए 1 μL रखें।
    2. लगी प्रतिक्रिया तैयार करें
      1. 10 μL 10x टी 4 डीएनए ligation प्रतिक्रिया बफर, 3 μL टी -4 डीएनए लीगेज (400 यू / μL), 29 μL शुद्ध पी 1, और 29 μL शुद्ध पी 2 को मिलाएं। डीडीएच 2 ओ से 100 μL जोड़ें।
      2. रात के 2 घंटे या 16 डिग्री सेल्सियस के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
      3. एक वाणिज्यिक जेल और पीसीआर क्लीन अप किट का उपयोग करके शुद्ध करें (सामग्री तालिका देखें)। एल्यूएशन बफर के 10 μL में गरम करना, हीटिंग ब्लॉक (कताई से पहले 5 मिनट के लिए कॉलम सेते हैं) में पूर्व 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होता है।
        नोट: एक जीएल को बाद में चलने के लिए 1 μL रखें।
    3. अंडरजेस्टेड प्लास्मिड, पका हुआ प्लास्मिड, और एक agarose जेल पर ligation चलाएं। Ligation उत्पाद में अकेले पचाने वाले प्लाज्मिड की तुलना में अधिक आणविक वजन बैंड (लगभग 11 kb) होना चाहिए, यह दर्शाता है कि ligation सफल था ( चित्रा 2 बी )।
    4. इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में T7 सेट करें
      1. 20 μL के अंतिम मात्रा के लिए 10 μL 2x एआरसीए / एनटीपी मिक्स, टीडीएन आरएनए पोलीमरेज़ मिश्रण के 2 μL, और 8 μL शुध्द बंधाव प्रतिक्रिया का मिश्रण करें।
        नोट: मिश्रण में शामिल एआरसीए एक कैप एनालॉग है जो विशेष रूप से सही अभिविन्यास में शामिल है। मानक कैप एनालॉग का परिणाम केवल उन्मुखीकरण में एक कैप वाले टेप के ~ 50% हो सकता है।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए सेते हैं
      3. यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के माध्यम से आरएनए एकाग्रता को मापें। वैकल्पिक रूप से, आरएनए प्रतिलिपि की लंबाई की पुष्टि करने के लिए एगरोज जेल को डालें।

    4. इलेक्ट्राप्लोरेशन द्वारा संक्रमित वायरस का बचाव

    1. इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले दिन, 1 टी 182 फ्लास्क ऑफ व्हइरो कॉल्स (टी 1 50 और टी 182 के बीच स्वीकार्य है; डीएमईएम में उगाया जाता है + 10% फेटालो गोजातीय सीरम (एफबीएस) एक नकली अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में 1 T182 शामिल करें Ce70-80% सामंजस्य पर एलएलएस का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    2. जब कोशिका तैयार होती है, तो डीएमईएम + 15% एफबीएस + 10 एमएम HEPES की 12 एमएल / प्रतिक्रिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म पानी स्नान में रखें।
    3. एक मानक प्रोटोकॉल के साथ ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं को अलग करें, और ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करने के लिए 10% FBS के साथ मीडिया में कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 xg पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं
    4. 1x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में कोशिकाओं को धो लें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 150 xg पर कोशिकाओं को छिद्रण करें। कुल तीन विधियों के लिए इस कदम को दो बार दोहराएं।
    5. प्रति एसपीएमआई 1640 + 10 मिमी एचईपीईएस (बाँझ) के प्रति नमूने # प्रति 200 μL में कोशिकाओं को रिसेट करें। एक बाँझ ट्यूब के लिए सेल निलंबन के 200 μL स्थानांतरण। कोशिकाओं ~ 0.5 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए।
    6. कोशिकाओं के प्रत्येक सेट के चरण 3.4 में 20 μL पानी (नकली नकारात्मक नियंत्रण) या आरएनए (अधिमानतः 5-10 माइक्रोग्राम) के 20 μL जोड़ें। ट्यूब को फ्लिकिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं और ट्यूब की सामग्री को 2 मिमी की अंतराल इलेक्ट्रोप्रोलेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    7. एक इलेक्ट्रिक सेट करेंऑपॉटरेटर को 170 वी एलवी, ओमेगा (प्रतिरोध) 0 और 950 μF (मोटे तौर पर 625 वी / सेमी और अन्य मशीनों के लिए 20 एमएस समय स्थिर) पर। सबसे कम उपलब्ध सेटिंग में प्रतिरोध सेट करें, या तो 0 या ∞ यदि उपलब्ध हो।
    8. पल्स एक बार और तुरंत डीएमईएम +15% एफबीएस +10 एमएम HEPES के 600 μL जोड़ते हैं जो चरण 4.2 में गर्म था। सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए क्यूवेट के अंदर अच्छी तरह से कुल्ला। टी -75 टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को जोड़ें, जिसमें 10 एमएल प्री-वार्मिंग मीडिया शामिल हैं। क्युवेट के साथ शामिल ड्रॉपर का उपयोग करके क्यूवेट से अतिरिक्त मीडिया निकालें बाँझपन बनाए रखने के लिए सावधान रहें
    9. मीडिया और कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए भंवर फ्लास्क और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह।
    10. सेल व्यवहार्यता के लिए अगले दिन की जांच करें, और 50-75% कोशिका मृत्यु को मनाया जाने तक हर रोज ऐसा करें। सेल मृत्यु की नकल electroporated नियंत्रण की तुलना करके मनाया जाता है।
      नोट: ज़ीकेके साइोबैथिक असर (सीपीई) को वेरो कोशिकाओं में काफी स्पष्ट किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को गोलाकार किया जाता है जो संस्कृति माध्यम में अलग और फ्लोट करते हैं। हमारे पास हैकटाई के लिए आदर्श के रूप में 8-10 दिनों की एक श्रृंखला मनाई।
    11. एक शंक्वाकार ट्यूब में फसल सतह पर तैरनेवाला और सेलुलर मलबे को 3,000 xg 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए हटाने के लिए अपकेंद्रित्र
    12. एक नई ट्यूब में स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला निकालें और 20% एफबीएस (100% स्टॉक से) की अंतिम एकाग्रता के साथ पूरक। इसके अतिरिक्त, एक बफरिंग एजेंट के रूप में 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता में बाँझ HEPES जोड़ें, जबकि वायरस संक्रमित होने के लिए जमे हुए (एक 1 एम बाँझ स्टॉक से)।
    13. स्क्रू कैप शीशियों में भंवर और विभाज्य से वायरस मिलाएं भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

    5. पुनर्प्राप्त वायरस के ट्यूटेटेशन

    1. उत्परिवर्तन से पहले एक दिन में वेरो कोशिकाओं की उपयुक्त संख्या 6 या 12 अच्छी तरह प्लेटें।
    2. फ्रीजर से वायरस निकालें और डीएमईएम + 2% एफबीएस या 9 6-अच्छी तरह प्लेट्स में धारावाहिक 10-गुना dilutions करें।
      नोट: पुनर्प्राप्त क्लोनों से अपेक्षित टिटर 1 x 10 6 और 5 x 10 7 पीएफयू / एमएल के बीच है।
    3. 200 ओ जोड़ेंप्रत्येक कमजोर पड़ने के 400 μL क्रमशः एक 12- या 6-अच्छी तरह से थाली के एक कुएं के डुप्लिकेट में।
    4. ~ 1-1.5 एच सोखना अवधि की कुल के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें रखें और प्रत्येक 15 मिनट रॉक करें।
    5. वायरल इनोकुल्म को निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एमएल (12-अच्छी तरह) या 2 एमएल (6-अच्छी तरह) डीएमईएम-ट्रैगैंटल ओवरले जोड़ें।
      नोट: यहां agarose, agar, methylcellulose या अन्य ओवरले मीडिया का उपयोग करना संभव है।
    6. 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं। उचित पट्टिका के निर्माण का समय इस्तेमाल किए जाने वाले ओवरले के आधार पर भिन्न होगा।
    7. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, इनक्यूबेटर से प्लेटें हटाएं और धीरे से निस्संक्रामक में छिद्रण करें।
    8. मिश्रण करने के लिए कवर करने के लिए प्रत्येक कुएं को पर्याप्त 20% इथेनॉल / 0.1% क्रिस्टल वायलेट (सीवी) जोड़ें
      नोट: कई अन्य स्थिरता मौजूद हैं और इसका इस्तेमाल यहां किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यदि agarose या agar overlay का उपयोग करते हैं, तो एक दूसरे ओवरले का उपयोग फिक्स्डेशन के बिना प्लेक्स की कल्पना करने के लिए तटस्थ लाल के साथ में किया जा सकता है। 20% इथेनॉल दिखाया गया हैपिछले अध्ययनों में छापा वायरस को निष्क्रिय करने में प्रभावी; गैर-छापा वायरस के लिए इस राशि का उपयोग न करें क्योंकि वे निष्क्रिय नहीं किए जाएंगे।
    9. कमरे के तापमान पर 30 से 60 मिनट के लिए प्लेट्स सेते (एक कक्षा द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में); सीवी (प्रति स्थानीय नियमों) को त्यागें और नल के पानी के साथ प्लेटों को धो लें।
    10. प्लेटें सूखने की अनुमति दें, और मैन्युअल रूप से प्लेक्स को गिनाएं।
      नोट: संदर्भ 20 का उपयोग पट्टिका के प्रदर्शन के लिए एक अतिरिक्त संदर्भ के रूप में किया जा सकता है।

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    Representative Results

    यहां वर्णित प्रोटोकॉल संक्रामक क्लोन-व्युत्पन्न Zika वायरस की वसूली के लिए अनुमति देता है। दो-प्लाज्मिड संक्रामक क्लोन सिस्टम को जोड़-तोड़ना सरल है जब सावधानी से किया जाता है, पूर्ण लंबाई वाले संस्करणों की तुलना में जो अत्यधिक अस्थिर (डेटा नहीं दिखाया गया है)। दो विशिष्ट टुकड़ों के पाचन और बंधन के बाद, टीएनएन पोलीमरेज़ के साथ विट्रो प्रतिलेखन में उपयोग किए गए आरएनए का उत्पादन किया जाता है, जो तब वोरो कोशिकाओं ( चित्रा 1 ) में चुना गया है। सही प्लाज्मिड अनुक्रम पर नजर रखी जा सकती है कि प्रतिबंध पाचन का उपयोग मिन्पिप ( चित्रा 2 ए ) के बाद एक प्रॉक्सी और आरसीए या मैक्सिप्रैप के साथ बड़े पैमाने पर डीएनए उत्पादन के बाद सेंगर अनुक्रमण के जरिए किया जा सकता है। संकलन द्वारा क्लोन की पुष्टि के बाद, संक्रामक वायरस की वसूली केवल पाचन, लघाई, इन विट्रो प्रतिलेखन और अंत में इलेक्ट्रोपायरेशन की आवश्यकता होती है। इन चरणों को एक दिन में किया जा सकता है। सही डिएग करेंअगर आवश्यक हो, तो समस्या निवारण के लिए अनुमति देकर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन ( चित्रा 2 बी ) द्वारा निगरानी और बंधन का निरीक्षण किया जा सकता है।

    जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, संक्रामक क्लोन-व्युत्पन्न वायरस कई सेल लाइनों में इन विट्रो में माता-पिता के अलग होने के समान स्तरों की प्रतिकृति करता है, यह सुझाव देता है कि सीडीएनए से पुनर्प्राप्त वायरस प्राथमिक अलगाव के समान नकल करता है। इसके अतिरिक्त, संक्रामक क्लोन-व्युत्पन्न वायरस और चूहों या एडीज एजेपिटी मच्छरों ( चित्रा 4 ) में संक्रमण, प्रसार और संचरण की दर में अस्तित्व की दर में पैतृक अलग-अलग के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।

    आकृति 1
    चित्रा 1: दो-प्लाज्मिड सीडीएनए क्लोन से ZIKV बचाव का कार्यप्रवाहजीआईकेवी तनाव पीआरवीएबीसी 5 9 के जीनोम को दो अलग-अलग टुकड़ों में पीएसीआईसीए 177 प्लाज्मिड रीढ़ में क्लोन किया गया था। दो प्लास्मिड तब तब्दील हो गए थे और टी -4 डीएनए लीगेज के साथ लगी थी। कैप्चर-संक्रामक आरएनए तब इन विट्रो प्रतिलेखन के माध्यम से निर्मित किया गया था, जिसके बाद वेरो कोशिकाओं में इलेक्ट्रोप्लोरेशन किया गया था। (संदर्भ से अनुकूलित चित्रा 21 )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    चित्र 2
    चित्रा 2: सीडीएनए क्लोन की पाचन और बंधन की निगरानी के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन। ( ए ) आनुवंशिक स्थिरता का आकलन करने के लिए मिलिप्रेप व्युत्पन्न प्लास्मिड के प्रारंभिक प्रतिबंध पाचन। ( बी ) दो-प्लाज्मिड क्लोन सिस्टम से संक्रामक वायरस की वसूली के दौरान पाचन और बाध्यकारी उत्पादों के उदाहरण Href = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55857/55857fig2large.jpg" target = "_ blank"> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: क्लोन व्युत्पन्न वायरस के इन विट्रो वृद्धि कैनेटीक्स में। जंगली प्रकार की पीआरवीएबीसी 5 9 के विकास की गतिज और मानव (एसएच-एसआईइइइ, जार और एनटीईआरए 2 सीआईडी ​​1), और मच्छर (सी 6/36, आगा 2) और संक्रामक क्लोन व्युत्पन्न वायरस को पट्टिका परख द्वारा मूल्यांकन किया गया। N = 3 त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (संदर्भ से अनुकूलित चित्रा 21 )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    55857fig4.jpg "/>
    चित्रा 4: चूहों और मच्छरों में क्लोन-व्युत्पन्न वायरस के vivo लक्षण वर्णन में। ( ए ) 4-हफ्ते का पुरुष और महिला इंटरफेरॉन अल्फा, बीटा और गामा रिसेप्टर नॉकआउट, एजी 12 9, चूहों को पीआरवीएबीसी 5 9 5 9 के पीएफयू या संक्रामक क्लोन-व्युत्पन्न वायरस के साथ इंट्राप्टरिटोनियल इनोक्यूलेट किया गया था और जीवित रहने के लिए समय पर निगरानी रखी गई थी (एन = 11)। एडीज इजिप्ती मच्छरों को एक संक्रामक खूनी खुराक दिया गया था जिसमें ZIKV शामिल था और 14 दिन बाद विच्छेदित किया गया था। ( बी ) संक्रामक वायरस के लिए मच्छर निकायों (संक्रमण), पैरों (प्रसार) या लार स्राव (ट्रांसमिशन) का आकलन करने के लिए प्लैक एलेज़ का इस्तेमाल किया गया था। दरें कुल मच्छरों के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत की गई हैं जिनका परीक्षण किया गया (संदर्भ 21 से अनुकूलित चित्रा) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    क्लोन व्युत्पन्न वायरस को दर्शाने में उनकी सहायता के लिए लेखक क्रिस्टन बलार्ड-फेबेलमेन, मिलिना वेसेलिनोविक और क्लाउडिया रुक्कर्ट का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। एनआईएच अनुदान के तहत AI114675 (बीजीजी) और एआईटी 67380 (जीडीई) के राष्ट्रीय अनुदान संस्थान, एलआईजी और संक्रामक रोगों से अनुदान के द्वारा इस काम का समर्थन किया गया था।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
    Carbenicillin, Disodium Salt various
    Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
    ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
    SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
    NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
    ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
    EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
    BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
    HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
    illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
    NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
    Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
    Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
    T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
    HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
    Vero cells ATCC CCL-81
    ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
    LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
    Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
    Petri Dish Celltreat 229693
    Culture Tubes VWR International 60818-576
    T75 flasks Celltreat 229340
    T182 flasks Celltreat 229350
    1x PBS Corning 21-040-CV
    RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
    DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
    Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
    Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
    Crystal Violet Amresco 0528-1006
    Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
    6 well plate Celltreat 229106
    12 well plate Celltreat 229111
    Sequencing Oligos IDT see table 1
    Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
    Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
    Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
    Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    इम्यूनोलॉजी अंक 124 ज़िका वायरस ज़ीकेवी सीडीएनए क्लोन संक्रामक क्लोन अरबोवायरस आणविक क्लोन फ्लैविवायरस
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