Summary

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Published: June 07, 2017
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Wiederherstellung des infektiösen Zika-Virus aus einem zwei-Plasmid-infektiösen cDNA-Klon.

Abstract

Infektiöse cDNA-Klone erlauben die genetische Manipulation eines Virus und erleichtern so die Arbeit an Impfstoffen, Pathogenese, Replikation, Übertragung und Virusentwicklung. Hier beschreiben wir den Aufbau eines infektiösen Klons für Zika Virus (ZIKV), der derzeit einen explosiven Ausbruch in Nord- und Südamerika verursacht. Um Toxizität gegenüber Bakterien zu verhindern, die häufig mit Flavivirus-abgeleiteten Plasmiden beobachtet wird, erzeugten wir ein Zwei-Plasmid-System, das das Genom am NS1-Gen trennt und stabiler ist als Volllängen-Konstrukte, die ohne Mutationen nicht erfolgreich gewonnen werden konnten. Nach der Verdauung und Ligation, um die beiden Fragmente zu verbinden, kann eine Volllängen-Virus-RNA durch in vitro- Transkription mit T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Nach der Elektroporation von transkribierter RNA in Zellen wurde das Virus gewonnen, das ähnliche In-vitro- Wachstumskinetiken und In-vivo- Virulenz- und Infektions-Phänotypen in Mäusen und Mücken zeigte.

Introduction

Zika-Virus (ZIKV, Familie Flaviviridae : Gattung Flavivirus ) ist ein Moskito-getragenes Flavivirus, das in Brasilien in den Jahren 2013-14 angekommen ist und anschließend mit einem massiven Ausbruch der fiebrigen Krankheit verbunden war, die sich in ganz Amerika verbreitete 1 . Darüber hinaus wurde ZIKV mit schwerwiegenden Erkrankungen wie dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen und Mikrozephalie bei Föten und Neugeborenen verknüpft 2 . Wenig war über ZIKV vor seiner schnellen Verbreitung in der westlichen Hemisphäre bekannt. Dazu gehört ein Mangel an molekularen Werkzeugen, was die mechanistische Forschung behindert. Molekulare Werkzeuge für Viren, wie infektiöse cDNA-Klone, erleichtern die Impfung und die antivirale therapeutische Entwicklung und ermöglichen die Bewertung von viralen genetischen Faktoren, die mit der differentiellen viralen Pathogenese, der Immunantwort und der viralen Evolution zusammenhängen.

Flavivirus-infektiöse Klone sind bekannt, dass sie in Bakterien aufgrund von cr stark instabil sindYptische prokaryotische Promotoren, die in ihren Genomen vorhanden sind 3 . Es wurden mehrere Ansätze verwendet, um dieses Problem zu lindern; Einschließlich der Insertion von Tandemwiederholungen stromaufwärts von viralen Sequenzen 4 , Mutation von mutmaßlichen prokaryotischen Promotorsequenzen 5 , Aufteilen des Genoms in mehrere Plasmide 6 , Vektoren mit niedriger Kopienzahl (einschließlich bakterieller künstlicher Chromosomen) 7 , 8 und Insertion von Introns im viralen Genom 9 . Ein einseitiges System ohne Modifikationen wurde für ZIKV beschrieben; Dieser Klon schien jedoch in der Zellkultur und bei den Mäusen 10 zu dämpfen. Andere Gruppen haben Introns in das ZIKV-Genom konstruiert, was eine Störung von instabilen Sequenzen in Bakterien ermöglicht, die in Säugetierzellen in vitro zur Herstellung von infektiösem Virus 11 gespleißt werden können, 12 Zusätzlich wurde ein PCR-basiertes System mit dem Titel Infectious-Subgenomic-Amplicons erfolgreich eingesetzt, um den Prototyp MR766-Stamm von ZIKV 13 zu retten. Der hier beschriebene Ansatz erfordert keine Fremdsequenzen, sondern stört das Genom im Bereich hoher Instabilität durch die Verwendung mehrerer Plasmide, die bisher erfolgreich mit Gelbfieber 6 , Dengue 14 , 15 und West-Nil-Viren 16 verwendet wurden. Darüber hinaus erleichtert die Zugabe der Hepatitis-D-Ribozym-Sequenz an den viralen genomischen Termini die Schaffung eines authentischen 3'-Endes ohne die Notwendigkeit der Addition einer Linearisierungsstelle. Zusätzlich werden beide Plasmide in einem Vektor mit niedriger Kopienzahl (pACYC177, ~ 15 Kopien pro Zelle) konstruiert, um jegliche Resttoxizität 17 zu mildern. Das gewonnene Virus zeigt ein vergleichbares Wachstumsprofil anElterliches Virus in in vitro Wachstumskurven in 8 Zelllinien, die eine Vielzahl von Zelltypen umfassen, die von Säugetieren und Insekten abgeleitet sind, und hat identische pathogene Profile bei Mäusen und Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten in den Mücken 18 gezeigt .

Hierin beschreiben wir ein Protokoll, in dem beschrieben wird, wie man die infektiösen Klonplasmide wächst, in vitro eine Volllängen-Virus-RNA (das virale Genom) erzeugt und in der Zellkultur ein infektiöses Virus wiederherstellt. Zuerst beschreiben wir die Ausbreitung von Plasmiden in Bakterien oder bakterienfreien Verstärkung mittels Rollkreisverstärkung (RCA). Als nächstes zeigen wir, wie die beiden Plasmide verdaut werden und dann anschließend miteinander ligiert werden, um ein Volllängenvirus zu erzeugen. Schließlich beschreiben wir die Produktion von transkribierter RNA und deren anschließende Elektroporation in Vero-Zellen, gefolgt von Titration des gewonnenen Virus (Abbildung 1 ). Der beschriebene Ansatz ist schnell, so dass foR Erholung von infektiösen Virusbeständen in 1-2 Wochen.

Protocol

1. Transformation und Wiederherstellung von infektiösen Klonplasmiden Transformieren Sie beide Plasmide (getrennt) unter Verwendung eines kommerziellen Transformationsprotokolls ( z. B. NEB 5 Minute Transformation Protocol) mit einigen Modifikationen. Beide Plasmide enthalten ein für die Ampicillinresistenz kodierendes Gen, daher verwenden sie Ampicillin oder Carbenicillin zur Selektion. Carbenicillin wird bevorzugt, da es stabiler ist. Entfernen Sie die Zellen (siehe Mate…

Representative Results

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von infektiösem Klon-abgeleiteten Zika-Virus. Das Manipulieren des Zwei-Plasmid-Infektios-Klonsystems ist einfach, wenn es mit Sorgfalt durchgeführt wird, im Vergleich zu Volllängen-Versionen, die sehr instabil sind (Daten nicht gezeigt). Nach der Verdauung und Ligation der beiden verschiedenen Stücke wird eine Capped-RNA unter Verwendung einer in vitro- Transkription mit T7-Polymerase hergestellt, die dann in…

Discussion

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic und Claudia Rückert für ihre Unterstützung bei der Charakterisierung des vom Klon abgeleiteten Virus. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Nationalen Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten, NIH unter den Stipendien AI114675 (BJG) und AI067380 (GDE) unterstützt.

Materials

NEB Stable CompetentE. coli New England BioLabs C3040H
Carbenicillin, Disodium Salt various
Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo Research D4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit Zymo Research D4202
SalI-HF New England BioLabs R3138S 20,000 units/ml
NheI-HF New England BioLabs R3131S 20,000 units/ml
ApaLI New England BioLabs R0507S 10,000 units/ml
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S 20,000 units/ml
BamHI-HF New England BioLabs R3136S 20,000 units/ml
HindIII-HF New England BioLabs R3104S 20,000 units/ml
illustra TempliPhi 100 Amplification Kit GE Healthcare Life Sciences 25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609.5
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) New England BioLabs M0371S 1,000 units/ml
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England BioLabs M0290S 10,000 units/ml
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S 400,000units/mL
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit New England BioLabs E2065S
Vero cells ATCC CCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation System BTX 45-0423 Other machines are acceptable.
LB Broth with agar (Miller) Sigma L3147 Can be homemade as well.
Terrific Broth Sigma T0918 Can be homemade as well.
Petri Dish Celltreat 229693
Culture Tubes VWR International 60818-576
T75 flasks Celltreat 229340
T182 flasks Celltreat 229350
1x PBS Corning 21-040-CV
RPMI 1640 with L-glutamine Corning 10-040-CV
DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose Corning 10-017-CV
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlas Biologicals FP-0500-A
Tragacanth Powder MP Bio MP 104792
Crystal Violet Amresco 0528-1006
Ethanol Denatured VWR International BDH1156-1LP
6 well plate Celltreat 229106
12 well plate Celltreat 229111
Sequencing Oligos IDT see table 1
Qubit 3.0 ThermoFisher Qubit 3.0 other methods are acceptable.
Qubit dsDNA BR Assay Kit ThermoFisher Q32850 other methods are acceptable.
Qubit RNA HS Assay Kit ThermoFisher Q32852 other methods are acceptable.
Class II Biosafety Cabinet Varies N/A This is necessary for live-virus work.

References

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Weger-Lucarelli, J., Duggal, N. K., Brault, A. C., Geiss, B. J., Ebel, G. D. Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone. J. Vis. Exp. (124), e55857, doi:10.3791/55857 (2017).

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