Her beskriver vi en protokoll for genomgående bred kartlegging av integrasjonssteder for Moloney murine leukemi virusbaserte retrovirale vektorer i humane celler.
Moloney-murine leukemi (MLV) virusbaserte retrovirale vektorer integreres overveiende i acetylerte forsterkere og promotorer. Av denne grunn kan mLV integrasjonssteder brukes som funksjonelle markører av aktive regulatoriske elementer. Her presenterer vi et retroviralt skanningsverktøy, som muliggjør genomsøkende identifikasjon av celle-spesifikke forsterkere og promotorer. Kort fortalt blir målcellepopulasjonen transdusert med en mLV-avledet vektor, og genomisk DNA blir spaltet med et ofte kuttende restriksjonsenzym. Etter ligering av genomiske fragmenter med en kompatibel DNA-linker tillater linker-mediert polymerasekjedereaksjon (LM-PCR) amplifikasjonen av virus-vert-genom-krysset. Massiv sekvensering av amplikonene brukes til å definere mLV-integrasjonsprofilen genom-bred. Endelig defineres klynger av tilbakevendende integrasjoner for å identifisere celle-spesifikke regulatoriske regioner, som er ansvarlige for aktiveringen av spesifikke transkripsjonsprogrammer av celletype.
<p class= "Jove_content"> Det retrovirale skanningsverktøyet tillater genomspennende identifisering av celle-spesifikke promotorer og forsterkere i prospektive isolerte målcellepopulasjoner. Spesielt representerer retroviral skanning en instrumentteknikk for retrospektiv identifisering av sjeldne populasjoner ( f.eks . Somatiske stamceller) som mangler robuste markører for fremtidig isolasjon.Cellidentitet bestemmes av uttrykket av spesifikke sett av gener. Rollen av cis-regulatoriske elementer, som for eksempel promotorer og forsterkere, er avgjørende for aktiveringen av spesifikke transkripsjonelle programmer av celletypen. Disse regulatoriske områdene kjennetegnes av spesifikke kromatinfunksjoner, som for eksempel spesielle histon-modifikasjoner, transkripsjonsfaktorer og ko-faktorbindinger, og kromatintilgjengelighet, som har vært mye brukt for deres genom-breddeidentifikasjon i flere celletyper 1 , 2 , 3 . Spesielt benyttes den genomgående profilen for acetylering av histon H3-lysin 27 (H3K27ac) vanligvis for å definere aktive promotorer, forsterkere og superforsterkere 4 , 5 , 6 .
Moloney murine leukemi virus (MLV) er et gamma retrovirus som er mye brukt for genOverføring i pattedyrceller. Etter infeksjon av en målcelle blir det retrovirale RNA-genomet retro transkribert i et dobbeltstrenget DNA-molekyl som binder virale og cellulære proteiner for å samle preintegrasjonskomplekset (PIC). PIC går inn i kjernen og binder vertscellekromatinet. Her medierer viral integrasen, en nøkkel PIC-komponent, integrering av det provirale DNA i vertscellegenomet. MlV-integrasjon i det genomiske DNA er ikke tilfeldig, men forekommer i aktive cis-regulatoriske elementer, slik som promotorer og forsterkere, på en celle-spesifikk måte 7 , 8 , 9 , 10 . Denne spesielle integrasjonsprofilen formidles av en direkte interaksjon mellom mLV integrasen og de cellulære bromodomain og extraterminalt domene (BET) proteiner 11 , 12 , 13 . BET-proteiner (BRD2, BRD3 ogBRD4) virker som en bro mellom vertschromatin og mLV PIC: Gjennom bromodomene anerkjenner de høyt acetylerte cis-regulatoriske regioner, mens extraterminalt domene interagerer med mLV integrase 11 , 12 , 13 .
Her beskriver vi retroviral skanning, et nytt verktøy for å kartlegge aktive cis-regulatoriske regioner basert på integrasjonsegenskapene til mLV. Kort fortalt blir celler transdusert med mLV-avledet retroviral vektor som uttrykker det forsterkede grønne fluorescerende protein (eGFP) reportergenet. Etter genomisk DNA-ekstraksjon forsterkes kryssene mellom den 3 'lange terminalrepetisjonen (LTR) av mlV-vektoren og det genomiske DNA ved hjelp av linker-mediert PCR (LM-PCR) og massivt sekvensert. MLV-integrasjonssteder er kartlagt til det humane genom og genomiske regioner som er svært målrettet av mLV, defineres som klynger av mLV-integrasjonssteder.
Retroviral skanningNing ble brukt til å definere celle-spesifikke aktive regulatoriske elementer i flere humane primære celler 14 , 15 . MLV-klynger samkartet med epigenetisk definerte promotorer og forsterkere, hvorav de fleste inneholdt aktive histon-merker, slik som H3K27ac, og var celle-spesifikke. Retroviral skanning tillater genomsøkende identifisering av DNA-regulatoriske elementer i prospektive rensede cellepopulasjoner 7 , 14 , så vel som i tilbakevendende definerte cellepopulasjoner, slik som keratinocytstamceller, som mangler effektive markører for fremtidig isolasjon 15 .
Her beskrev vi en protokoll for genomsøkende kartlegging av integrasjonsstedene for mLV, et retrovirus som målretter kromatinregioner, epigenetisk merket som aktive promotorer og forsterkere. Kritiske trinn og / eller begrensninger av protokollen inkluderer: (i) mLV-transduksjon av målcellepopulasjonen; (Ii) amplifisering av virus-vert-kryssinger av LM-PCR; (Iii) gjenfinning av en høy andel av integrasjonssteder. MLV-baserte retrovirale vektorer overfører effektivt delende celler. Den lave effektiviteten ved transd…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Det europeiske forskningsrådet (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Det italienske ministeriet for utdanning, universiteter og forskning (FIRB-Futuro i Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro i Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), Det italienske Helsedepartementet (Unge forskere Ring 2011 GR-2011-02352026) og Imagine Institute Foundation (Paris, Frankrike).
PBS, pH 7.4 | ThermoScientific | 10010031 | or equivalent |
Fetal Bovine Serum | ThermoScientific | 16000044 | or equivalent |
0.2 ml tubes | general lab supplier | ||
1.5 ml tubes | general lab supplier | ||
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit | QIAGEN | 51306 | or equivalent |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202T | |
T4 DNA Ligase Reaction buffer | New England BioLabs | M0202T | |
Linker Plus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
Linker Minus Strand oligonucleotide | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3’ (Purification grade: SDS-PAGE) | |
Tru9I | Roche-Sigma-Aldrich | 11464825001 | |
SuRE/Cut Buffer M | Roche-Sigma-Aldrich | 11417983001 | |
PstI | Roche-Sigma-Aldrich | 10798991001 | |
SuRE/Cut Buffer H | Roche-Sigma-Aldrich | 11417991001 | |
Platinum Taq DNA Polimerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10mM dNTP Mix | Invitrogen | 18427013 | or equivalent |
PCR grade water | general lab supplier | ||
96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
linker primer | general lab supplier | 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
MLV-3’ LTR primer | general lab supplier | 5’-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3’ (Purification grade: PCR grade) | |
linker nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
MLV-3’ LTR nested primer 454 | general lab supplier | 5’-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
linker nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
MLV-3’ LTR nested primer Illumina | general lab supplier | 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Purification grade: SDS-PAGE) | |
Sodium Acetate Solution (3M) pH 5.2 | general lab supplier | ||
Ethanol (absolute) for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
Topo TA Cloning kit (with pCR2.1-TOPO vector) | Invitrogen | K4500-01 | |
QIAquick Gel Extraction kit | QIAGEN | 28704 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | or equivalent |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | or equivalent |
100 bp DNA ladder | Invitrogen | 15628019 | or equivalent |
6X Loading Buffer | ThermoScientific | R0611 | or equivalent |
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000 | |
Nextera XT Index kit | Illumina | FC-131-1001 or FC-131-1002 | |
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Dynal magnetic stand for 2 ml tubes | Invitrogen | 12321D | or equivalent |
Agencourt AMPure XP 60 ml kit | Beckman Coulter Genomics | A63881 | |
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5 | general lab supplier | ||
Agilent 2200 TapeStation system | Agilent Technologies | G2964AA | or equivalent |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | or equivalent |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | or equivalent |
KAPA Library Quantification Kit for Illumina platforms (ABI Prism) | KAPA Biosystems | KK4835 | |
ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4329003 | |
NaOH 1.0 N, molecular biology-grade | general lab supplier | ||
HT1 (Hybridization Buffer) | Illumina | Provided in the MiSeq Reagent Kit | |
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycles) | Illumina | MS-102-3001 | |
MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |