Summary
이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.
Abstract
비록 뇌 조각에 실험 1951 년부터 사용 되었습니다, 문제는 필드 잠재적인 또는 세포내 녹음을 수행할 때 시 냅 시스 전송의 조음의 안정적이 고 성공적인 분석을 달성의 가능성을 감소 시키는 남아 있다. 이 원고는 상용 침수 챔버에 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 기록에 대 한 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 실험 조건 개선에 도움이 될 수 있는 방법론 기능을 설명 합니다. 와 유출 carbogenation 단위. 유출 carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 향상 시키기 위해 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다. 또한, 원고는 시 냅 시스 전송의 활동-종속 시 냅 스가 소성에 다른 carbogenation 모드와 자극 패러다임의 효과 검사 하는 대표적인 실험을 선물 한다.
Introduction
1951 년에 처음 보고 급성 뇌 조각 실험 실시1했다. Piriform 피2,3 , hippocampal 신경 해 마4, 중 septotemporal 축 transversely 상호는 발견에서 성공적인 생체 외에서 녹음 후 1971 년에는 첫 체 외에 녹음 hippocampal 신경 활동의 달성된5이었다. Vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 하에서 뉴런의 신경 생리학 또는 neurostructural 매개 변수의 유사성은 여전히6의 일부 토론 주제 하지만 1975 년에, Schwartzkroin7 표시는 기저 뉴런의 속성은 체 외에서 고 hippocampal 형성에 afferents의 그 높은-주파수 자극 (즉, tetanization)의 시 냅 스 전위8오랫동안 촉진 유도. 신경 활동의 기록 electrophysiological 생체 외에서 크게 확장 활동-종속 시 냅 스가 소성9,10, 블 리스에 의해 1973 년에 발견 했다 세포 메커니즘의 연구 외. 11 vivo에서 토끼로 실험.
신호 경로 뇌 조각, 그리고 급성 hippocampal 조각, 특히 신경 활동의 연구는 이제 표준 도구입니다. 그러나, 의외로, 실험 체 외에 는 아직 표준화 될 준비 및 급성 hippocampal 조각의 유지 보수에 대 한 여전히 존재 하는 여러 방법에 의해 입증. 리드 외. (1988) 12 조각 챔버의 다른 유형과 매체, pH, 온도 및 산소 레벨 목욕의 선택에 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 방법론 문제 검토. 이러한 매개 변수는 여전히 조각-녹음 설정 생체 외에서 의 맞춤 요소 때문 녹음 실에서 제어 하기 어렵다. 게시는 설명할 수 있습니다. 극복 하는 데 도움이 방법론 도전과 그의 일부 침수 슬라이스 챔버, 중간 3D microperfusion 시스템13, 향상 된 층 류 및 산소 챔버의 새로운 유형을 찾을 수 있습니다. 14, 컴퓨터 온도 제어15, 시스템 및 다중 챔버 녹음 시스템16공급 한다. 이러한 챔버 구축 하기 쉬운 이므로, 대부분의 과학자 들은 상업적으로 사용 가능한 슬라이스 챔버에 의존 합니다. 이 챔버는 전기 생리학 및 형광 이미징17,,1819의 조합에 대 한 되므로 현미경 시스템에 장착할 수 있습니다. 이 약 실은 뇌 조각 인공 척수 (실제)에 빠져들 계속, 버퍼 솔루션의 높은 유량 필요 유지, 약물 응용 프로그램의 비용을 증가 합니다. 이 위해, 우리는 유출-carbogenation 침수 슬라이스 챔버는 상대적으로 작은 실제 볼륨을 사용 하 여 필드 전위의 장기 기록에 대 한 충분 한 안정성을 제공 하는 재활용 관류 시스템을 통합 했습니다. 또한, 우리는이 실험 carbogenation/관류 시스템의 사용 활동-종속 시 냅 스가 소성10 의 결과 미치는 영향 및 진 핵 신장 요인 2 키 니 아 제 (eEF2K)의 억제 시 냅 스 변조 방법 요약 전송20.
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Protocol
동물 동물 보호의 설립된 기준 및 뇌 과학 연구소 및 상태 키 실험실의 의학 신경 생물학의 복 단 대학, 상해, 중국의 절차에 따라 유지 되었다.
1. 솔루션 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
- 조각화 버퍼 (수정된 Gey 솔루션) 준비: 92 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4, 30 mM NaHCO3, 25 mM 포도 당, 20 mM HEPES, 3mm 나+-pyruvate, 10mm MgSO4및 0.5 m m CaCl2.
- Carbogenation 없이 1 M NaOH를 사용 하 여 7.6에 pH를 조정 합니다.
- 4 ° c.에 버퍼 저장
참고: 적정 흐린 액체를 명확히. osmolality 305-310 mOsm입니다. Carbogen21 5% 이산화탄소와 95% 산소를 포함합니다. - 실제의 최종 조성 주는 중 탄산염과 포도 당을 포함 하지 않는 실제의 재고 솔루션 x 10를 diluting 하 여 준비: 124 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 2.5 m m CaCl2, 2 mM MgCl2및 1.25 m m KH2포4.
- 중 탄산염 및 10 mM 포도 당 및 26 m m NaHCO3에 도달 하는 포도 추가 합니다.
- Carbogenate NaHCO3를 추가한 후 즉시 차단 엔드와 천공된 실리콘 튜브를 통해 실제.
- Carbogenating (pH 7.3-7.4) 동안 pH를 측정 합니다.
참고: 버퍼 용량 NaHCO3의 금액을 변경 하 여 약간 조정할 수 있습니다. 결과 pH 온도 의존 하는 때문에, 그것은 작동 온도 (예, 30 ° C)에서 carbogenating 동안 결과 pH를 확인 하는 데 필요한.
2입니다. 급성 Hippocampal 조각의 준비
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
- 급성 뇌 조각에 대 한 보육 챔버를 슬라이스 잡고 메쉬 장소, 실제, 및 carbogenate (4-6 L/h) 적어도 30 분22 28-30 ° c.에 대 한 챔버를 채우기
- 2-4 ° c.까지 수술 도구 쿨
- 감기와 carbogenated 버퍼 (2-4 ° C), 유지 하는 vibratome 근처 얼음/물 혼합물을 깔 끔 히 가득 유리 비 커를 놓습니다.
- 각 막 반사 (30-50 s) 사라질 때까지 쥐 또는 쥐를 anesthetize 2 L 유리 용기 또는 50 mL 튜브에 12.5 µ L에 500 µ L를 취하여 isoflurane를 사용 하 여.
- 설명 및 매 티 스 외 의 간행물에 자세히 시각화 방법을 사용 하 여 뇌를 분리 (2011 년) 23 , Yuanxiang 외. (2014) 24.
- 2-4 ° c 뇌 소 뇌를 해 부하 고 반구를 분리 하기 전에 (적어도 2 분)에 대 한 차가운 조각화 버퍼에 멋진.
- 차가운 수술 블레이드를 사용 하 여 그림 1C 는 복 부와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역을 각 반구25 의 등 쪽 가장자리를 따라 70 ° 각도로 지 피 조각 해 부 그리고 E.
- 감기 치과 시멘트 주걱으로 짧게 만든된 표면 (1-2 s) 건조 필터 종이의 조각에 반구를 전송.
- 갓 잘라 표면 두 반구 빠른 연기 접착제 접착제;를 사용 하 여 차가운 조각화 플랫폼에 탑재 반구 면 면도날 (그림 1D)의 꼬리 끝을 있다.
- vibratome의 냉각 챔버도 조각화 플랫폼을 놓고 조각화 버퍼 (2-4 ° C)와 그 챔버를 입력 합니다. Carbogenate 구멍된 실리콘 튜브를 사용 하 여입니다.
- 적절 한 vibratome 설정을 사용 하 여 350 µ m 조각 잘라 (예를 들어, 블레이드 앞으로 속도: 1.2 m m/s, 블레이드 진폭: 1mm).
- 분리는 subiculum를 사용 하 여 두 개의 주입 뉼 entorhinal 외피가 hippocampal 형성 (> 28 G)가 위로.
- 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 이전 준비 보육 상공의 슬라이스 잡고 메쉬에서 거품을 제거 합니다.
- 인큐베이션 챔버의 메쉬에 조각화 플랫폼에서 지층 pyramidale에서 몇 가지 투명도 있는 분할 영역을 전송 합니다. 모든 폴딩, 스트레칭, 중복, 및 큰 입 파스퇴르 피 펫으로 실제와 슬라이스를 발음에 의해 부동 하지 마십시오.
참고: 모든 절차 (단계 2.5-2.14) 5-10 분; 걸릴 수 있습니다. 따라서, 그것은 4 ° c.에 그것을 유지 하는 시간이 지남에 따라 버퍼 솔루션의 온도 확인 하는 것이 중요 - 보육 실에서 적어도 1.5-2 h 30 ° C에서 슬라이스를 품 어 고 carbogen 4-6 L/h에서 제공 합니다.
참고: 버퍼는 인큐베이터에 순환 하지만 부동에서 슬라이스를 방지 carbogen의 유량을 조정 합니다.
3. 수정은 실제에 대 한 Carbogenation의 작은 저수지의 재활용
- 재활용 시스템 (그림 2B)의 유출에 3 방향 튜브 커넥터를 추가 합니다.
- Carbogen 공급 튜브 3 방향 튜브 커넥터의 가운데 팔을 연결 하 고 공기 흐름 미터 (3-4 L/h,D 그림 2및 그림 4C) 유량을 조절.
- 재활용 시스템의 유입에 두 번째 3-방향 튜브 커넥터를 추가 합니다. 중간 팔 (로우-패스 필터; 저수지에서 유입 튜브를 인라인 히터, 얇은 실리콘 튜브 (10 ㎝ 길이), 상 완 및 더 낮은 팔을 직면 하는 튜브를 연결 그림 4 C)입니다.
- 얇은 실리콘 튜브 튜브 압착 기 장소 (OD: 2mm) 튜브 연동 펌프에 의해 생성 된 조각 챔버에 실제의 맥의 최소한은 한 위치에서.
참고: 유출-carbogenation (유출-수화물.) 수정 실제 저수지, 재활용 율, 실제의 볼륨을 carbogenation 레벨의 감도 감소 시키고 상대 튜브 작은 실제 저수지 내 위치 (< 50 mL; 그림 3)입니다. 로우-패스 필터에 관한 얇은 실리콘 튜브에 공기의 일정 금액의 실제 흐름; 맥 동 감소 따라서, 튜브 공기도 주로 가득 한다.
4입니다.침수 슬라이스 챔버에 시 냅 스의 응답을 기록
주: 자료의 테이블을 참조 하십시오.
- 미리 따뜻한 물 목욕 약 28-30 ° c (이것은 녹음 실에서 거품 형성 방지)에서 실제 솔루션.
- 재활용 시스템 (4-5 mL/min)를 시작 하 고 적어도 1 시간을 위한 시스템을 equilibrate 하 인라인 히터를 활성화.
- 렌즈 종이 나일론 메쉬 (그림 4) 몇 분 동안 침수 슬라이스 챔버에 U 자 모양의 백 금 철사에 고정을 청소의 작은 조각을 presoak합니다
- U 자 모양의 백 금 철사를 제거 합니다.
- 재활용 전환 하 고 종이 청소 하는 렌즈에 슬라이스를 놓습니다.
- 즉시 조각 위에 슬라이스 잡고 메쉬, 스위치는 펌프를 놓고 슬라이스는 실제 목적은 찍기에 없이 30 분 동안 equilibrate 하자.
- 실제와 붕 micropipette (즉, 녹음 전극)를 작성 (저항 팁: 1-2 m ω, 1/3 실제 가득) 피 펫 홀더에 탑재.
- NaHCO3 솔루션으로 그것을 배치 하 여 금속 자극 전극의 절연 제를 확인 (> 40 mM). DC 전압 발생기의 부정 극 전극 연결 (1-2 V, 긍정 극: 은색 또는 백 금 선), 해 부 현미경 아래 끝에 거품의 형성을 관찰 하 고 (> 60 배 확대).
- 조작 홀더에서 테스트 에폭시 절연 텅스텐 자극 전극을 놓고 슬라이스 챔버에 전선 참조.
- 두 번째 참조 전극 챔버를 추가 하 고 기록 전극(그림 4)의 headstage의 참조 소켓에 연결.
- 앰프 제어 소프트웨어에서 "제로 클램프 모드" 상자에서 클릭 하 고 "출력 이득 목록" 상자를 두 번 클릭 하 여 진행 합니다. 이득 선택 "100 년"의 "높은 통과 필터 목록 상자 (베셀)"를 두 번 클릭 "0.1 Hz,"를 선택 하 고 "3로"를 선택 하는 "낮은 패스 필터 목록 상자 (AC)"를 두 번 클릭
- 클릭 기록 소프트웨어에는에 "취득 | 프로토콜을 엽니다. " 설정이 자동으로 에피소드 stimulations 고 50-100 ms에 대 한 10-20 kHz에서 증폭 된 잠재력의 디지털화에 대 한 허용 하는 프로토콜의 에피소드 녹화 시작 후 10 ms 자극 아이 솔 레이 터를 트리거를 선택 합니다.
- 자극 및 기록 전극 선과 평행한 지층 pyramidale의 예 (그림 4B 및 그림 5)에 배치 합니다.
- 클릭 "취득 | "프로토콜 편집 하 고 (팝업 창)에서"트리거"탭을 선택 합니다. 트리거 소스 "트리거 소스" 상자 및 선택 "스페이스 바" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 인수를 시작 하 고 트리거 버튼으로 팝업 창에 "기록" 버튼을 클릭 합니다.
- 자극 아이 솔 레이 터 소프트웨어에서 "전압 제어" 상자를 클릭 하 고 "0" 입력 "다운로드" 버튼을 클릭 합니다. "소프트웨어"를 녹음 창에 클릭 하 고 스페이스바를 누릅니다. 입력 하 여 순차적으로 값 1에서 8, 예를 들어 "전압 제어" 상자에서 1 mV 단계에이 주기를 반복 합니다.
- FEPSP 경사 값 자극 강도 연관 하 고 최대 fEPSP 슬로프의 40%를 얻을 하는 데 필요한 자극 강도 결정 합니다. "전압 제어 상자"를 클릭 하 고 결정된 된 값을 입력 합니다. "다운로드" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 자극 아이 솔 레이 터는 뇌 조직에 간단한 전압 또는 전류 펄스를 적용 하는 데 사용 됩니다. 복 형 펄스 위상 당 100 µs를 가질 수 있습니다. - 레코딩 소프트웨어에서 정지 버튼을 누른 다음 "취득" 메뉴를 클릭 합니다. "편집 프로토콜"에 클릭 하 고 팝업 창에서 "트리거" 탭을 선택 하십시오. 트리거 소스 트리거 소스 상자 및 선택 "내부 타이머" 클릭 합니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다. 모든 30 필드 전위의 자동 녹음 시작 기록 단추를 클릭 예를 들면 s. 30-60 분 후 "정지" 버튼을 클릭 합니다.
- "취득" 메뉴에서 클릭, "개방형 프로토콜," 클릭 시 냅 스가 소성의 원하는 유도 프로토콜을 선택 하 고 "확인" 버튼을 클릭 합니다. 자동으로 활성화-고주파 자극 및 기록에 "기록" 버튼을 클릭 합니다. "정지" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 경우 시 냅 스가 소성에 관한 연구, 적용 장기 potentiation 또는 장기간된 초기 녹음 후 장기 불황에 대 한 표준 유도 패러다임 중 하나. 시 냅 시스 전송의 결과 변조의 대표적인 예는 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다. - 레코딩 소프트웨어에서 클릭 "취득 | 프로토콜 "열고 단계 4.12는 동일한 프로토콜을 선택 합니다. "확인" 버튼을 클릭 한 다음 "기록 합니다."를 클릭 자동으로 예를 들면 2-4 h에 대 한 필드 잠재적인 녹음을 실행 하십시오. 녹음을 종료 하려면 "stop" 버튼을 클릭 합니다.
- 제약 연구 시 적용 화합물 직접는 실제 저수지 영구 복합 관리 경우 원하는 (그림 6).
5. 청소 설치 및 힌트
참고: 일반 팁에 대 한 아래 참조.
- 더 이상 20 분, 이온 H2o. 세척 하 여 다음에 대 한 10% H2O2 를 재활용 하 여 매주 시스템 청소
참고: 에탄올 청소에 대 한 권장 하지 않습니다. 그것은 마찬가지로 바람직하지 몰입할 참조 전선 및 H2O2에 목표. - 렌즈 또는 0.1 N HCl와 다음 물 약 실 주변의 표면에 침전 된 소금을 제거 합니다.
- Carbogen bubbler 증류수 또는 0.1 N HCl을 씻어.
- 담가 5 분 동안 10% H2O2 에 슬라이스 인큐베이션 챔버 일주일에 한 번 그리고 후 철저 하 게 린스 이온 H2o. 보육 실
- 금속 자극 전극의 경우 각 실험 후 이온된 수로 자극 전극 팁을 린스 하 고 잔여 조직을 제거 하는 에탄올과 젖은 면봉으로 자극 전극 팁을 부드럽게 닦아 내십시오.
- 샌드 페이퍼로 조심 슬쩍 통해 끝 단을 제거 하 여 상용 금속 자극 전극의 저항을 줄일 수 있습니다.
- 소계 튜브 실리콘 튜브를 대체 하 여 튜브를 통해 재활용 하는 동안은 실제에서 carbogen 손실을 줄일.
- 양식에 AgCl 와이어 표면에 표 백제 몇 일 동안 기록 전극 및 참조 전극은 전선 유지.
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Representative Results
프로토콜 섹션에서 우리는 조각의 급성 hippocampal hippocampal 형성 (그림 1)의 복 부와 중간 부분에서 남성 C57BL/6 마우스 및 남성 Wistar 쥐 (5-8 주)의 준비를 설명. 슬라이서 플랫폼에 반구의 위치 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 하 고 안정화 한 천 또는 agarose의 필요를 제거 합니다. 관류 시스템 자체 운영 하는 액체의 필요한 유량을 주고 높은 회전에 연동 펌프를 기반으로 합니다. 따라서, 펌프 내에서 표준 튜브의 급속 한 노후화 만든 우리 비 실리콘 튜브를 사용 하 여 극복 하는 상당한 문제 (ID: 1.02 m m). 유출에 대 한 부정적인 압력 2.79 m m 내부 직경 두 병렬 연결 된 관에 의해 만들어집니다. 이 두 관 액체(그림 4)의 열망에 대 한 수 있도록 녹음 실에서 정 맥에 연결 됩니다. 저수지에서 실제의 carbogenation 속도 작은 구멍으로 환기 돌 또는 튜브를 사용 하 여 달성 하기 어려울 수 있습니다 많은 시간 동안 안정 해야 합니다. 이후 유출-carbogenation 작은 구멍, (그림 2) 시간이 남아 안정 이상의 carbogen 흐름 속도에 의존 하지 않습니다. 실험은 작은 실제 저수지와 함께 실시, 유출-carbogenation 용 존된 산소 (그림 3)의 균형을 달성 하기 위해 수 있습니다. 또한, 변경 된 유입/유출 튜브 위치, carbogen 버블 튜브와 액체 재활용 비율에서 활성 숨 구멍의 수에 따라 실험 사이 산소 레벨의 변화를 최소화 합니다.
조각(그림 4)까지 일부 액체 교환 수 있도록 렌즈 종이에 배치 됩니다. 때문에 슬라이스 챔버 40 X 목표를 갖춘 직 립 현미경에 거치 될 수 있다, 잘 제어 (B 그림 4및 그림 5)는 전극의 위치 될 수 있습니다. 이 더 일상 업무에 실험의 가변성을 감소 시킨다.
잠재적인 자극 강도 따라 필드 잠재적인 크기의 종속성은 다른 자극 강점 (그림 5에서 fEPSPs를 기록 하 여 결정 되어야 합니다 필드의 초기 기록에 필요한 자극 강도 확인 하려면 ). 입력-출력 특성의 측정 높은 자극 힘에 조각에 몇 가지 스트레스를 만듭니다. 따라서, 다른 방법은 그냥 fEPSP-감퇴 (검은 화살표 그림5에서)26에 긍정적인 인구 스파이크 구성 요소 끝 자극 강도 대 한 검색입니다.
적어도 30 분 동안 안정 기준선을 기록한 후 약국 시작할 수 있습니다. 여기, 우리는 시 냅 스 전송에 eEF2K 억제제의 효과의 예 제시. eEF2K의 억제 시 냅 스 전송 (그림 6A), p38 MAPK (그림 6B)20의 억제에 의해 감쇠는 그 효과 촉진 합니다.
활동-종속 시 냅 스가 소성 자극 패러다임10의 다양 한에 의해 유도 될 수 있다. 100 Hz에서 자극의 연속 시퀀스와 1 hz 15 분 이상 반복된 stimulations에 여기, 우리는 시 냅 스가 소성의 대표적인 실험 제시. 시 냅 시스 전송의 결과 변조 그림 7 과 그림 8에 묘사 되어 있다. 또한, 그것은 표시 그림 7 과 그림 8 에 유출-carbogenation (흰 동그라미, 그림 3에서 24-40 분 상대 산소 수준)에 의해 작은 버퍼 저수지의 산소 수준의 안정화는 LTP 개선 그리고 (회색 서클, 산소 수준 7-24 분) 저수지-carbogenation만 실험에 비해 LTD 유도. 우리 우리 낮고 간단 carbogen 사용 실험 시스템을 만들기에 관심이 있기 때문에 유출-carbogenation와 저수지-carbogenation (7-24 분)의 결합을 테스트 하지 않았다. 없이 저수지 carbogenation 실제 저수지에서 산소의 기준선 수준을 나타냅니다 재활용 (최대 7 분).
그림 1: 는 vibratome를 사용 하 여 해 마의 가로 슬라이스를 두뇌 반구를 위치. (A) hippocampal 형성 복원된 마우스 뇌 모델 내에서 녹색 오른쪽 뇌의 측면 보기에 표시 됩니다. (B) A hippocampal 형성의 복 부 전망. (C) rostral-꼬리 보기 hippocampal 형성 수평 평면에 오른쪽 뇌에 대 한 복 부와 중간 부분의 섹션을 보여 줍니다. 해 마의 septotemporal 축 다른 지역 신경 분포와 기능31,의 다른 학위를가지고 있기 때문에32, 다른 절단 각도 필요 해 마 등의 가로 분할 영역 예를 들어. 눈금 막대 = 3 mm (가로 흰색 라인). (D) 사진은 vibratome 플랫폼에 붙어 쥐 뇌의 반구. 눈금 막대 = 6 m m. (E) 스케치 분리 오른쪽 반구 (점선된 검은 선) 및 조각화 플랫폼에서 만든된 표면에 뇌를 접착제로 회전 (빨간색 화살표)의 외피 (위 스키마)의 등 쪽 가장자리를 트리밍에 대 한 각도 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 50 mL 아래 실제 저수지에 대 한 carbogenation 시스템의 요소. (A) 표준 carbogenation 시스템 (a) 구멍이 튜브를 사용 하 여 carbogen 거품 장치; 튜브는 250 µ m 직경 스테인리스 와이어 여러 구멍에서 구멍 했다. (B) 유출-carbogenation (b) 3 방향 튜브 커넥터 (내경: 2mm) 또는 소수 성 필터와 액체의 역류를 방지 하는 (C)는 환기 단위.3-방향 튜브 커넥터의 가운데 팔 한 차압 후 carbogen 탱크에 연결 되어 (가스 압력: < 1 atm) 및 유량 계. 나머지 무기는 실제 유출 튜브 내에서 연결 됩니다. (D)는 carbogen 유량 흐름 미터에 의해 제어 됩니다. 실험을 하는 동안 실제 저수지는 28-30 ° c.에 유지 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 서로 다른 조건에서 실제의 40 mL의 산소 수준. 저수지-carbogenation 동안 산소 수준 (res.-수화물.) 지속적으로 감소 실제 재활용 (회색 가득 동그라미, n = 3). 그러나, 유출-carbogenation (유출-수화물.) 실제 중 산소 수준, 평형 기준선 수준에 도달의 드롭 감소 재활용 (화이트 가득 동그라미, n = 3). 초기 레벨 res. 탄수화물으로 측정 되었다. 없이 실제 재활용. 수직 점선된 회색 줄 다른 carbogenation 프로토콜에 스위치를 나타냅니다. 재활용 (7-24 분)와 함께 res. 수화물 및 유출 수화물의 효과. LTP와 LTD의 유도에 (흰 동그라미, 24-40 분)를 재활용으로 그림 7 과 그림 8에 묘사 된다. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 침수 슬라이스 챔버에 실험에 대 한 유출-carbogenation의 구성 요소. (A) 침수 슬라이스 챔버의 프리젠테이션. 들고 hippocampal 슬라이스 나일론 섬유와 U 자 모양의 백 금 철사 그려져 있습니다. 실버 와이어 실버 와이어 결말의 영역을 증가 하려면 코일을 만드는 작은 정을 감싸 했다. 자극 참조 와이어 유출 챔버에 배치 했다 그리고 기록 참조 메인 챔버. 서로 다른 액체 수준에서 안정, 기록 참조 와이어 버퍼에 노출 하는 와이어의 "수 중" 부분만 떠나 플라스틱 튜브로 절연 수 있습니다 잠재적인 참조 전극 유지. (B) 밝은 필드 이미지는 대표적인 급성 hippocampal 조각과 전극 보여 줍니다. CA1, CA3: 뿔 Ammonis 1, 3; DG:가 이랑; 하위: subiculum; EC: entorhinal 외피입니다. (C) 회로도 carbogen 및 연동 펌프 유량의 표시 없이 유출-carbogenation의 주요 구성 요소를 강조 표시합니다. 로우 패스 필터를 실제 흐름의 맥 동을 줄이기 위해 인라인 히터 앞 놓일 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 자극 강도 및 전극의 위치에 잠재적인 모양 필드의 종속성. (A) 지층 pyramidale (pyr str.), 그리고 자극 장점에서 다른 거리에 갖는 잠재력 묘사 된다 분야의 대표적인 예. 수평 검은 화살표는 필드 잠재적인 붕괴에 인구 스파이크의 포지티브 원본 구성 요소를 나타냅니다. 인구 스파이크의 포지티브 원본 구성 요소는 약 초기 fEPSP 상승 단계에서 모든 테스트 "인라인" 전극 위치 셀 바디 레이어 (e)에 가까운 매우 하나 제외 하 고의 중간에 남아 있었다. 인구 스파이크의 구성 요소 (B)의 포지티브 원본 위치 자극 및 기록 전극의 부정합으로 인해 크게 다양합니다. 락입니다.: 지층 lacunosum moleculare; Rad.: 지층 radiatum; Pyr입니다.: 지층 pyramidale; 레크 리에이: 기록 전극; Stim입니다.: 자극 전극입니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 유출-carbogenation를 사용 하 여 작은 실제 저수지20 의 재활용으로 hippocampal 시 냅 스 전송에 eEF2K 억제제의 효과의 대표적인 예 . 20 분 동안 1 분 간격 fEPSPs를 기록한 후 eEF2K 억제 물 A-484954는 직접 실제 저수지 (수평 라인)에 추가 되었습니다. 시 냅 시스 전송의 급속 한 증가 감지 (화이트-채워진 원) 이었다. 약은 적용 되지 fEPSP 사면 녹화 (회색 가득 원)의 시간 동안 안정 유지. P38 MAPK 억제제 (회색 가로 선) 응용 프로그램 (B) eEF2K inhibito-유도 증진 분야 잠재력의 방지. 데이터 평균 ± SEM.로 표시 됩니다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 유출-carbogenation를 사용 하 여 시 냅 시스 전송의 활동-종속 potentiation의 대표 녹음 (유출-수화물.; 흰 동그라미)와 저수지-carbogenation (해상도-수화물.; 검은 서클), 작은 실제의 재활용과 저수지. 후 시간 포인트 0에 의해 3 시간 100 Hz/s 기차는 potentiation 유도 되었다 (Tet.: tetanization, 높은-주파수 자극). 데이터 평균 ± SEM. 브라켓으로 제공 됩니다: 시간 포인트; 당 그룹의 통계 비교 짝이 없는 T-테스트, 일관 된 표준 편차를 가정 하지. * p < 0.05.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8 : 자극 강도 및 carbogenation 시 냅 시스 전송의 활동-종속 우울증의 종속성. (A) 저수지-carbogenation를 사용 하 여 (res.-수화물.) 큰 실제 볼륨의 재활용으로 최대한 fEPSP 슬로프의 80%에서 15 분 동안 1 자극 시 냅 시스 전송 (흰색 원)의 강한 우울증 갖는. 그러나, 대표 fEPSP (검은 추적) 하기 전에 추적 그리고 후 (빨간 추적 110일 분) LTD 유도 표시, 연 접 섬유 발리 (수직 검은 화살표) 크게 감소 했다. 이 자극 전극에서 전기 화학적 인 과정 회사 관련 메커니즘에 부분적으로 의존 하지 않는 우울증을 일으키는 afferents 해 수를 나타내는 예입니다. 더 낮은 정도에 시 냅 시스 전송의 우울증 유발 자극 강도 fEPSP 사면 최대 50% 감소 하지만 변경 하지 않고 연 접 섬유 발리 (회색 가득 원). FEPSP-슬로프 저수지-carbogenation와 실험에서의 지속적인 우울증과 작은 실제 저수지의 재활용 (B) LTD 유도 연상 하지 않았다 (res.-수화물.; 회색 채워진 사각형). (C) 유출-carbogenation 작은 실제 저수지의 재활용 향상 LTD 유도의 결과. 삽입 (검은 추적) 하기 전에 대표 fEPSPs 제시 (110일 분, 붉은 흔적) 후 LTD 유도. 대표 fEPSPs에 대 한 수직 눈금 막대 표시 1 mV, 그리고 2 양 데이터 1에 2 개월 된 C57/BL 6 쥐의 급성 hippocampal 조각 (350 µ m)에서 가져온 고 평균 ± SEM. 괄호로 표시 됩니다에 해당 하는 가로 비율 바 : 시간 포인트; 당 그룹의 통계 비교 짝이 없는 T-테스트, 일관 된 표준 편차를 가정 하지. * p < 0.05, ns: 비-중요 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
인터페이스 슬라이스 챔버 더 강력한 시 냅 스 응답25,26,,2728전시, 침수 챔버 패치 클램프 기록 및 형광에 대 한 추가 편의 제공 이미지입니다. 따라서, 우리 신경17,18, 형광 프로브의 이미지를 쉽게 확장할 수 있는 상업 잠수 슬라이스 챔버를 사용 하 여 급성 hippocampal 조각에서 필드 잠재적인 녹음의 여러 측면을 설명 했습니다. 19. 조각 준비25, 외 많은 시간 후에 녹음 실에서 지속적인 carbogen 레벨의 유지 보수 장애물의 하나를 나타냅니다. Carbogen 수준 실제 저수지의 초기 포화에 의해 제어만 때문에, 차이 실제에 산소 수준에서 쉽게 얻을 수 있습니다 일상적인 실험에. 따라서, 산소 미터는 것이 좋습니다 문제 해결 가속화 하 고 적어도 28 mg/L 도달 조건 (예: 온도, carbogen 유량, carbogenation 도구 및 실제 재활용 비율) 조정 안정에서 실제 저수지에서 산소 수준입니다. 또한, 약물 응용 프로그램에 대 한 실제 컨테이너의 크기를 변경 하는 일반적인 연습 그들의 carbogen 레벨 차이로 인해 필드 전위에 효과 유도할 수 있다.
작은 재활용 버퍼 볼륨의 유출 carbogenation를 사용 하 여 시 냅 스가 소성 실험의 결과 향상. 향상 된 액체에서 산소의 용 해 액체의 접촉 영역 사이의 carbogen 큰 비율을 기반으로 합니다. 또한, 유출 carbogenation 실제 저수지에서 carbogen 고갈 실제의 공급을 감소 시킨다. carbogenation의 안정성 상용 제품29의 원칙에 따라 구체적으로 설계 된 venturi에 의해 더 향상 될 수 있습니다.
함께 최고의 슬라이스 준비 및 설치 조건, 그것은 종종 피할 수 절연된 금속 자극 전극을 사용 하는 경우 필드 전위를 유도 될 수 없습니다. 종종, 이유는 단 열 절곡 또는 청소 손상 되었습니다. 우리는 방법에 표시 된 있다, 낮은 DC 전압에서 거품 형성을 확인 하는 간단한 방법이입니다. 또한,이 단계는 팁을 청소 하 고 자극 전극의 임피던스를 줄일 수 있습니다. 자극에 대 한 유리 펫의 사용 일반적 이며 섬유 자극의 좁은 분야를 제공 하는 이점이 있다. 종종, 유리 피 펫 자극 사용 하는 경우 최대 fEPSP 슬로프를 찾을 수 아니다. FEPSP 감퇴 단계에서 인구 스파이크의 포지티브 원본 컴포넌트의 외관 다음 자극 강도23조정 사용할 수 있습니다.
다른 신호 경로 적용된 유도 프로토콜에 의존의 참여는 사용할 수 있는10고 활동-종속 시 냅 스가 소성의 유도 관한 게시 수 있습니다. 그러나, 방법론의 관점에서 높은-주파수 자극 시 냅 스가 소성의 성공적인 유도 막을 수 있는 뚜렷한 유물을 발생할 수 있습니다. 반복된 100/1의 자극 자극 전극의 전기 화학 반응30, afferents (예를 들어 그림 8 참조)에 손상을 인해 시 냅 시스 전송의 우울증에 따른 양극 화가 될 수 있습니다. 전기 화학 프로세스를 최소화 하기 위해 초기 기록에 대 한 복 형 자극 펄스와 자극 전원 2 V 보다 더 많은 것 아닙니다의 사용을 권장 합니다.
요약 하자면, 유출-carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 강화 하는 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.
Acknowledgments
트 면 실시, 분석, 실험을 설계 하 고 원고를 썼다. D.X. 및 C.P. 그림 준비에서 원조 하 고 실험을 실시. 이 작품은 NSFC (31320103906)에 의해 지원 되었다 결핵을 111 프로젝트 (B16013)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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