Denne protokol beskriver stabilisering af iltindholdet i en lille mængde genanvendt buffer og metodologiske aspekter af optagelse aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet i undersøiske akut hippocampus skiver.
Selv om eksperimenter på hjerne skiver har været i brug siden 1951, fortsat problemer at reducerer sandsynligheden for at opnå en stabil og succesfuld analyse af synaptisk transmission graduering, når du udfører felt potentielle eller intracellulære optagelser. Dette manuskript beskriver metodologiske aspekter, der kan være nyttige i at forbedre eksperimentelle betingelser for opretholdelsen af akut hjernen skiver og optagelse feltet excitatoriske postsynaptiske potentialer i et kommercielt tilgængelige submersion kammer med en udstrømning-carbogenation enhed. Udstrømning-carbogenation hjælper med at stabilisere iltindholdet i eksperimenter, der er baseret på genbrug af en lille buffer reservoir til at forbedre omkostningseffektiviteten for drug eksperimenter. Derudover præsenterer håndskriftet repræsentative eksperimenter, at undersøger virkningerne af forskellige carbogenation tilstande og stimulation paradigmer på aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet af synaptisk transmission.
I 1951 blev først rapporteret akut hjernen skive eksperimenter gennemført1. I 1971, efter vellykket in vitro- optagelser fra piriform cortex2,3 og den opdagelse, at hippocampus neuroner hænger paa tvaers langs septotemporal aksen af hippocampus4, en af de første in vitro- optagelser af hippocampus neuronal aktivitet var opnået5. Ligheden mellem de neurofysiologiske eller neurostructural parametre af neuroner in vivo og in vitro- betingelser er stadig genstand for nogle debat6, men i 1975, Schwartzkroin7 oplyste, at de basale egenskaber af neuroner vedligeholdes i vitro og at højfrekvente stimulation (dvs. tetanization) af afferenter i hippocampus dannelse inducerer en langvarig lettelse af synaptiske potentialer8. Elektrofysiologiske optagelse af neuronal aktivitet in vitro- stærkt udvidet studiet af de cellulære mekanismer i aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet9,10, som var blevet opdaget i 1973 af lyksalighed et al. 11 i in vivo forsøg med kaniner.
Studiet af neuronal aktivitet eller signalering veje i hjernen skiver, og især i akut hippocampus skiver, er nu en standard værktøj. Men overraskende, in vitro- eksperimenter har endnu ikke standardiseres, som det fremgår af de flere tilgange, der stadig findes for forberedelse og vedligeholdelse af akut hippocampus skiver. Reid et al. (1988) 12 gennemgik de metodologiske udfordringer for vedligeholdelse af akut hjernen skiver i forskellige typer af skive kamre og valg af badning medium, pH, temperatur og ilt niveau. Disse parametre er stadig svære at styre optagelse her på grund af de skræddersyede elementer af in vitro- skive-optagelse opsætninger. Publikationer kan findes at kunne bidrage til at overvinde nogle af de metodologiske udfordringer og at beskrive nye typer af submersion skive chambers, en interstitiel 3D microperfusion system13, et kammer med forbedret laminar flow og ilt levere14, et system med edb temperatur kontrol15og en multi kammer optagelse system16. Da disse kamre ikke er let at bygge, de fleste forskere er afhængige af kommercielt tilgængelige skive kamre. Disse kamre kan monteres på et mikroskop system, således at kombination af Elektrofysiologi og fluorescens imaging17,18,19. Da disse kamre holde hjernen skiver neddykket i kunstige cerebrospinalvæske (aCSF), skal en høj gennemstrømning stødpudeopløsning vedligeholdes, øge bekostning af drug application. Til dette formål har vi indarbejdet et genvindingssystem perfusion med udstrømning-carbogenation, der giver tilstrækkelig stabilitet for feltet potentialer i en submersion skive afdeling ved hjælp af en forholdsvis lille aCSF volumen langsigtet optagelsen. Hertil kommer, sammenfattet vi hvordan brugen af dette eksperimentelle carbogenation/perfusion system påvirker resultatet af aktiviteten-afhængige synaptisk plasticitet10 og hvordan hæmning af eukaryote brudforlængelse faktor-2 kinase (eEF2K) modulerer synaptic transmission20.
Selvom interface skive kamre udviser mere robust synaptic svar25,26,27,28, levere neddykning kamre ekstra bekvemmelighed for patch-clamp optagelse og fluorescens Imaging. Dermed, vi har beskrevet flere aspekter af feltet potentielle optagelser i akut hippocampus skiver ved hjælp af en kommerciel submersion skive kammer, der kan nemt udvides til billeddannelse af fluorescens sonder i neuroner<s…
The authors have nothing to disclose.
WW gennemført, analyseres, og designet af eksperimenter og skrev manuskriptet. D.X. og C.P. bistået i figur forberedelse og udført eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af NSFC (31320103906) og 111 projekt (B16013) til T.B.
Reagents required | |||
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
Tools and materials for dissection | |||
Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
Electrophysiology equipment and materials | |||
Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi,China | HH-1 | |
4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
lens cleaning paper | Kodak | ||
50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |