Summary
本协议描述了在少量回收的缓冲液中的氧水平的稳定, 以及在淹没的急性海马切片中记录活动依赖性突触可塑性的方法学方面。
Abstract
尽管自1951年以来, 脑切片的实验已经开始使用, 但问题仍然存在, 这就降低了在执行场电位或胞内记录时对突触传输调制进行稳定和成功分析的可能性。这篇手稿描述的方法学方面, 可能有助于改善实验条件的维护急性脑切片和记录场兴奋性突触后电位在一个商业可用的淹没室与流出-carbogenation 单位。外流 carbogenation 有助于稳定氧气水平的实验, 依靠回收的小缓冲水库, 以提高成本效益的药物实验。此外, 该手稿还有代表性的实验, 考察不同的 carbogenation 模式和刺激范式对突触传递的活动依赖性突触可塑性的影响。
Introduction
在 1951年, 第一次报告的急性脑切片实验进行了1。在 1971年, 在成功的体外录音从梨皮层2,3和发现海马神经元是相互连接横向沿 septotemporal 轴海马4, 其中一个第一个体外海马神经元活动的记录实现了5。神经或 neurostructural 参数的相似性神经元在体内和体外条件仍然是一些辩论的主题6, 但在 1975年, Schwartzkroin7表示, 基神经元的性质是保持在体外和高频刺激 (即,后背) 的传入在海马形成诱导一个长期的促进突触潜能8。神经元活动的电生理记录在体外极大地扩展了活动依赖性突触可塑性的细胞机制的研究910在1973年被极乐发现et al.11在体内实验中用家兔。
研究神经元活动或信号通路的脑切片, 特别是在急性海马切片, 现在是一个标准的工具。然而, 令人惊讶的是,在试管中的实验还没有标准化, 这证明了在急性海马切片的制备和维持方面仍然存在着多种方法。里德et al.(1988)12回顾了在不同类型的切片室中维持急性脑切片的方法学挑战, 以及沐浴培养基、pH 值、温度和氧水平的选择。由于体外切片记录设置的 custom-made 元素, 这些参数在记录室中仍然难以控制。可以找到的出版物, 可能有助于克服一些方法上的挑战, 并描述了新类型的淹没切片室, 如间质 3D microperfusion 系统13, 一个室的层流和氧气增强提供14, 一个具有计算机温度控制的系统15, 以及一个多记录系统16。由于这些房间不易建造, 大多数科学家依赖于商业上可用的切片室。这些室可以安装在显微镜系统, 从而允许的电生理和荧光成像的结合17,18,19。由于这些腔室保持脑切片淹没在人工脑脊液 (aCSF), 高流速的缓冲液的解决方案需要保持, 增加了药物应用的费用。为此, 我们已经采用了一个循环再灌注系统与流出-carbogenation, 提供足够的稳定性, 以长期记录的现场电位在一个浸没的切片室使用相对较小的 aCSF 体积。此外, 我们总结了如何使用这个实验 carbogenation/灌注系统影响的结果, 活动相关的突触可塑性10和如何抑制真核伸长 factor-2 激酶 (eEF2K) 调节突触传输20。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
这些动物是按照中国上海复旦大学脑科学研究所和医学神经生物学国家重点实验室的既定动物保育标准和程序进行维护的。
1. 溶液制备
注意: 请参见材料表。
- 准备切片缓冲区 (修改后的 Gey 的解决方案):92 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 1.25 毫米 NaH2PO4, 30 mm NaHCO3, 25 mm 葡萄糖, 20 mm HEPES, 3 mm Na+-丙酮酸, 10 mm MgSO4, 0.5 mm CaCl2。
- 将 pH 值调整到 7.6, 使用1米氢氧化钠而不 carbogenation。
- 将缓冲区存储在4° c。
注: 滴定澄清混浊液体。渗透是 305-310 mOsm。卡波金21包含5% 的二氧化碳和95% 的氧气。 - 通过稀释不含碳酸氢盐和葡萄糖的 aCSF 的10x 储存液来制备 aCSF, 给出最后的成分: 124 毫米氯化钠, 2.5 毫米氯化钾, 2.5 mm CaCl2, 2 mm 氯化镁2, 和 1.25 mm 的2PO4。
- 添加碳酸氢钠和葡萄糖达到10毫米葡萄糖和 26 mm NaHCO3。
- Carbogenate 的 aCSF 通过一个穿孔的硅管, 并在添加 NaHCO3后立即阻止其结束。
- 测量 ph 值而 carbogenating (ph 值 7.3-7.4)。
注意: 通过更改 NaHCO3的数量, 可以稍微调整缓冲区容量。由于所产生的 ph 值是温度依赖性的, 因此必须在工作温度 (例如, 30 ° c) 时检查所产生的 ph 值而 carbogenating。
2. 急性海马切片的制备
注意: 请参见材料表。
- 将切片保持网格放入一个用于急性脑切片的孵化室中, 用 aCSF 填充腔, carbogenate (4-6 升/小时), 在28-30 ° c 时至少为 30 min22 。
- 把手术器械冷却到2-4 ° c。
- 放置一个玻璃烧杯充满冷和 carbogenated 切片缓冲 (2-4 ° c), 保持在一个冰/水混合物, 附近的 vibratome。
- 麻醉鼠或小鼠, 直到角膜反射消失 (30-50 秒) 使用异氟醚, 采取500µL 到2升玻璃罐或12.5 µL 到50毫升管。
- 使用在《马修斯et al.的出版物中详细描述和可视化的方法隔离大脑(2011)23和远et al.(2014)24。
- 在解剖小脑和分离半球之前, 将大脑降温至2-4 ° c, ice-cold 切片缓冲 (至少2分钟)。
- 使用冷手术刀片解剖在每个半球的背缘25的一个70角度的背部皮质块, 从腹侧和海马的中间部分获得横向切片, 如图 1C所示和E。
- 用一个冷的牙科水泥刮刀, 转移一个半球到一块滤纸, 以简要干燥创建的表面 (1-2 s)。
- 在 ice-cold 切片平台上用快作用的胶粘胶将两个半球用新的切割表面装入;让半球尾端面对刀片式服务器 (图 1D)。
- 将切片平台放入 vibratome 的冷却室中, 并将该腔室与切片缓冲 (2-4 ° c) 填充。Carbogenate 使用穿孔硅管。
- 使用适当的 vibratome 设置 (例如,刀片前进速度: 1.2 毫米/秒, 刀片振幅: 1 mm) 切割350µm 切片。
- 用两个注射套管 (#62; 28 克) 将海马的形成从 subiculum 和嗅皮层分离出来, 作为剪刀。
- 使用巴斯德吸管从先前准备的孵化室的切片保持网格中除去气泡。
- 将具有一定透明度的切片从孵化室的网格上的切片平台转移到 pyramidale 层。避免任何折叠, 伸展, 重叠, 和浮动的吸 aCSF 和切片到一个大嘴巴斯德吸管。
注: 整个过程 (步骤 2.5-2.14) 可以采取5-10 分钟;因此, 在4° c 的情况下, 检查缓冲液的温度以保持它的时间是很重要的。 - 孵育在30° c 的切片在孵化室至少 1.5-2 小时, 并提供卡波金在4-6 升/小时。
注意: 调整卡波金的流速以在孵化器中循环缓冲, 但防止切片漂浮。
3. Carbogenation 对小型水库 aCSF 循环的改造
- 将3路管道连接器添加到回收系统的流出 (图 2B)。
- 将3路管接头的中间臂与卡波金的电源管连接起来, 并使用气流指示器 (3-4 升/小时、图 2D和图 4C) 调节流量。
- 添加第二个3路管接头到回收系统的流入。将中间臂与内圈加热器的管子相连, 将上臂与一根薄薄的硅管 (10 厘米长) 和下臂连接到流入管 (低通过滤器;图 4C)。
- 将管机放在一个薄的硅管上 (外径: 2 毫米), 在该管的位置上, 由蠕动泵产生的 aCSF 在切片室中的脉动最小。
注: 流出-carbogenation (流出-碳水化合物) 的改性降低了 carbogenation 水平对 aCSF 储层容积、aCSF 回收率和小 aCSF 油藏内相对管位的敏感性 (#60; 50 毫升;图 3)。对于低通滤波器, 在稀薄的硅管中一定量的空气减少了 aCSF 流的脉动;因此, 该管应填补大部分与空气。
4。在浸没的切片室中记录突触反应
注意: 请参见材料表。
- 预热 aCSF 溶液在水浴到大约28-30 ° c (这将防止气泡形成在记录室)。
- 启动回收系统 (4-5 毫升/分钟), 并激活内联加热器, 平衡系统至少1小时。
- 打一小块镜片清洁纸和一个尼龙网格固定在 U 形的铂丝在浸没的切片室几分钟 (图 4)。
- 取下 U 形铂丝。
- 关闭回收, 并在镜头清洁纸上放置一个切片。
- 立即将切片保持网格放在切片的顶部, 打开泵, 让切片平衡30分钟, 而不将目标浸入 aCSF。
- 填充硼硅酸盐微 (即,记录电极) 与 aCSF (尖端电阻: 1-2 ω, 填充1/3 与 aCSF), 并将其装入吸管支架。
- 通过将金属刺激电极放入 NaHCO3溶液 (和 #62; 40 mM) 来检查其绝缘性。将电极连接到直流电压发生器的负极 (1-2 V, 正极: 银或铂线), 并观察在解剖显微镜 (和 #62; 60x 放大倍率) 下, 在尖端形成气泡。
- 将经测试的环氧绝缘钨刺激电极放在机械手支架和切片室中的参考线上。
- 将第二个参考电极添加到腔室, 并将其连接到记录电极的 headstage 的参考插座 (图 4a)。
- 在放大器控制软件, 点击 "零钳模式" 框, 并通过双击 "输出增益列表" 框进行。选择增益 "100", 双击 "高通滤波器列表框 (贝塞尔)", 选择 "0.1 Hz", 然后双击 "低通滤波器列表框 (AC)" 以选择 "3 赫"。
- 在录制软件中, 单击 "获取 |开放的协议。选择一个协议, 允许在10-20 赫50-100 毫秒的场景刺激和放大电位的数字化的设置, 并自动触发了一个在一幕式录音开始后, 一个激励隔离10毫秒。
- 将刺激和记录电极与地层 pyramidale 平行, 例如图 4B和图 5)。
- 点击 "获取 |编辑协议 ", 然后选择" 触发器 "选项卡 (在弹出窗口中)。点击 "触发源" 框, 选择 "空格键" 作为触发源。单击 "确定" 按钮。单击 "记录" 按钮开始获取, 并注意带有触发器按钮的弹出窗口。
- 在刺激隔离软件中, 点击 "电压控制" 框, 进入 "0"。单击 "下载" 按钮。单击 "录制软件" 窗口并按空格键。重复此循环, 按顺序输入值从1到 8, 例如, 在 "电压控制" 框中的 1 mV 步骤。
- 将激发强度与 fEPSP 斜率值进行关联, 并确定获得40% 的 fEPSP 斜率最大的激发强度。单击 "电压控制箱" 并输入确定的值。单击 "下载" 按钮。
注: 刺激隔离器用于将短电压或电流脉冲应用于脑组织。双相脉冲可以有100µs 每个阶段。 - 在录制软件中, 单击 "停止" 按钮然后 "获取" 菜单。单击 "编辑协议", 然后在弹出窗口中选择 "触发器" 选项卡。单击 "触发器源" 框, 然后选择 "内部计时器" 作为触发器源。单击 "确定" 按钮。例如, 单击 "记录" 按钮, 每个三十年代开始自动记录字段电位。30-60 分钟后单击 "停止" 按钮。
- 点击 "获取" 菜单, 点击 "打开协议", 选择所需的突触可塑性感应协议, 然后点击 "OK" 按钮。点击 "记录" 按钮, 自动激活高频刺激和录音。单击 "停止" 按钮。
注: 在与突触可塑性相关的研究中, 在长时间的基线记录之后, 应用一种标准的归纳范式来长期增强或长期抑郁。在图 7和图 8中描述了由此产生的突触传输调制的典型示例。 - 在录制软件中, 单击 "获取 |打开协议 "并选择与步骤4.12 中相同的协议。单击 "确定" 按钮, 然后单击 "录制"。例如, 保持自动运行2-4 小时的现场潜在录音。单击 "停止" 按钮以终止录制。
- 在药物研究的情况下, 如果需要永久性复合管理 (图 6), 直接将化合物应用于 aCSF 油藏。
5. 清理设置和提示
注: 请参阅下面的一般提示。
- 每周通过回收 10% H2O2来清洁系统, 不超过20分钟, 然后用去离子 H2o 进行清洗。
注: 不推荐使用乙醇清洗。同样不建议在 H2O2中浸入参考线和目标。 - 在物镜或室周围的表面上用0.1 的 HCl 和水除去沉淀的盐。
- 在蒸馏水或0.1 的 HCl 中清洗卡波金起泡。
- 将切片孵化室浸泡在10% 小时2O2中, 每周5分钟, 然后用去离子 H2O 彻底冲洗孵化室。
- 在金属刺激电极的情况下, 每次实验后用去离子水冲洗刺激电极尖端, 用乙醇浸泡的棉球轻轻擦拭刺激电极尖端, 除去残留的组织。
- 通过对砂纸进行仔细的滑动, 去除尖端的绝缘层, 从而降低商业金属刺激电极的电阻。
- 通过用聚四氟乙烯管取代硅管, 减少从 aCSF 中回收卡波金的损失。
- 将记录电极和参考电极的银线保持在漂白剂中数天, 以形成氯化在金属丝表面上。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在 "协议" 部分, 我们描述了由雄性 C57BL/6 小鼠和雄性大鼠 (5-8 周) 的海马形成 (图 1) 的腹侧和中间部分的急性海马切片的制备。半球在切片机平台上的位置有助于保持它们的稳定, 并消除琼脂或琼脂糖对稳定的需要。灌注系统本身是基于在高转速下运行的蠕动泵, 以提供所需的液体流速。因此, 在泵的标准管迅速老化造成了一个很大的问题, 我们克服了使用硅管 (ID: 1.02 毫米)。流出的负压也由两个平行连接的管子产生, 内径为2.79 毫米。这两个管连接到记录室中的套管, 以允许液体的吸入 (图 4a)。储层中 aCSF 的 carbogenation 率必须在多个小时内保持稳定, 这可能难以用通风石或小孔管来实现。由于流出-carbogenation 不依赖于小孔隙, 卡波金流率随着时间的推移保持稳定 (图 2)。如果实验是用一个小的 aCSF 油藏进行的, 流出-carbogenation 有助于实现溶解氧的平衡 (图 3)。此外, 它最小化氧气水平的可变性在实验之间根据改变的流入或流出管位置, 活跃毛孔的数量在卡波金泡管和液体回收率。
切片被放在透镜纸上, 允许从下面进行一些液体交换 (图 4A)。由于切片室可以安装在配备40X 目标的直立显微镜上, 因此可以很好地控制电极的位置 (图 4B和图 5)。这进一步减少了实验在日常工作中的变异性。
为了确定场电位基线记录所需的刺激强度, 必须通过在不同的激发强度下记录 fEPSPs 来确定场电位大小对激发力的依赖性 (图5).输入输出特性的测量在较高的激励强度下对切片产生一定的应力。因此, 另一种方法是寻找一种刺激强度, 它只是唤起了 fEPSP 衰变中的正人口峰值分量 (图 5中的黑色箭头)26。
在记录了至少30分钟的稳定基线之后, 药物管理局就可以开始了。在这里, 我们介绍了一个 eEF2K 抑制剂对突触传递的影响的例子。抑制 eEF2K 促进突触传输 (图 6A), 这一效果被 p38 MAPK (图 6B)20的抑制作用所衰减。
活动依赖性突触可塑性可以诱发的各种刺激范例10。在这里, 我们提出了典型的突触可塑性的实验, 这是基于连续的100赫兹刺激序列和1赫兹以上15分钟的重复激励。在图 7和图 8中描述了突触传输的结果调制。此外, 在图 7和图 8中显示了由流出-carbogenation (白圈、相对氧位在图 3中 24-40 min) 的氧气水平的稳定改善了和有限责任公司的诱导相比, 只有 carbogenation 的实验 (灰色圆圈, 氧气水平在7-24 分钟)。我们没有测试流出-carbogenation 和水库-carbogenation (7-24 分钟) 的组合, 因为我们有兴趣创建一个实验系统的低和更简单的卡波金使用。carbogenation 不回收 (最多7分钟) 的水库是 aCSF 水库中氧气的基线水平。
图 1:用 vibratome 定位大脑半球以获得海马的横向切片.(a) 在重建的小鼠脑模型内, 在右半球的侧视图中显示海马形成。(B) 海马形成的腹侧视图。(C) rostral-to-caudal 视图演示在水平平面上右半球的海马形成的腹侧和中间部分的一部分。由于不同地区沿 septotemporal 轴海马有不同程度的神经支配和功能31,32, 需要一个不同的切割角度的横向切片的背海马,例如.缩放条形图 = 3 mm (水平白线)。(D) 照片显示的是老鼠大脑半球被粘在 vibratome 平台上。缩放条形图 = 6 mm (E) 草图描述了用于修剪被分离的右半球 (虚线黑线) 和旋转 (红色箭头) 的皮层 (上部模式) 的背缘的角度, 以在切片平台上的创建的表面上粘附大脑。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在50毫升以下的 aCSF 油藏的 carbogenation 系统的元素.(a) 标准 carbogenation 系统, 使用 (a) 穿孔管作为卡波金气泡装置;一根管子被多孔穿孔与250µm 直径不锈钢线。(b) 流出-carbogenation 由 (B) 3 路管子连接器 (内径: 2 毫米) 或 (C) 一个排气装置, 防止液体回流与疏水过滤器。3路管接头的中间臂在压力计 (气压: 和 #60; 1 atm) 和流量计后连接到卡波金油箱。剩余的武器在 aCSF 流出管之内连接。(D) 卡波金流率由流量计控制。在试验过程中, aCSF 油藏保持在28-30 ° c。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:40 毫升 aCSF 的氧水平在不同的条件下.在储层-carbogenation (res-碳水化合物) 和 aCSF 循环中的氧水平不断下降 (灰色填充圆, n = 3)。然而, 流出-carbogenation (流出-碳水化合物) 在 aCSF 循环期间减少了氧气水平的下落, 到达平衡在基准水平 (白色被填装的圈子, n = 3)。基线水平是用 res-碳水化合物测量的。没有 aCSF 回收。垂直虚线灰色线表示切换到不同的 carbogenation 协议。再循环 (7-24 分钟) 和流出-碳水化合物的作用。在图 7和图 8中描述了循环利用 (白色圆圈, 24-40 分钟) 的感应。数据显示为平均± SEM.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 流出-carbogenation 的元件, 用于在浸没的切片室中进行实验.(A) 介绍浸没的切片室。描述了用尼龙纤维夹持海马切片的 U 形铂丝。银线被包裹在一个小套管周围, 创造了一个线圈来增加银线的结束面积。在流出室中放置刺激参考线, 记录参考在主腔内。为了使参考电极电位在不同的液位保持稳定, 记录的参考线可以被塑料管绝缘, 只留下暴露在缓冲中的导线的 "水下" 部分。(B) 亮场图像显示有代表性的急性海马切片和电极。CA1, CA3: 角海马 1, 3;DG: 齿状回;分: subiculum;EC: 嗅皮质。(C) 示意图突出了流出 carbogenation 的主要成分, 没有指示卡波金和蠕动泵的流量表。低通滤波器可以放在内嵌加热器的前面, 以减少 aCSF 流的脉动。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 场电位形状对激发强度和电极位置的依赖性.(A) 在不同距离地层 pyramidale (str. pyr) 和激发强度的情况下, 有代表性的场电位的例子。水平的黑色箭头表示在场势衰减的种群峰值的正源分量。人口高峰的正面来源组分仍然近似地在最初的 fEPSP 上升的阶段中间在所有被测试的 "在线" 电极位置, 除了一个非常接近细胞身体层数 (e)。(B) 由于刺激和记录电极的失调, 人口峰值的正源分量的位置有很大差异。lacunosum: 地层 moleculare;Rad: 地层 radiatum;Pyr: 地层 pyramidale;记录电极;控: 刺激电极。缩放栏 = 100 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 具有代表性的例子, eEF2K 抑制剂对海马突触传递的影响使用流出-carbogenation, 回收小 aCSF 水库20 .在记录 fEPSPs 1 分钟间隔20分钟后, eEF2K 抑制剂 A-484954 直接添加到 aCSF 油藏 (水平线)。突触传递的快速增加是可检测的 (白色填充的圆圈)。如果药物没有被应用, fEPSP-倾斜在记录的时期保持稳定 (灰色被填装的圈子)。(B) p38 MAPK 抑制剂 (灰色水平线) 的应用阻止了 eEF2K inhibito 诱导的场电位增强。数据显示为平均± SEM.请单击此处查看此图的较大版本.
图 7:使用流出-carbogenation (流出-碳水化合物; 白色圆圈) 和油藏-carbogenation (res-碳水化合物; 黑色圆圈) 的具有活动依赖性的突触传递增益的有代表性的记录, 用小 aCSF 回收水库.在时间点0乘以三乘100赫兹/秒的火车 (春节: 后背, 高频刺激) 后诱发增效。这些数据被显示为平均± SEM. 支架: 每个时间点组的统计比较不配对 T 检验, 不假设一致的标准偏差。* p 和 #60; 0.05。请点击这里查看更大版本的这个数字。
图 8: 在刺激强度和 carbogenation 时, 突触传递的活动依赖性抑郁症的依赖性.(A) 使用水库-carbogenation (res.-carb) 利用大 aCSF 量的回收, 1 赫兹刺激15分钟, 在80% 的最大 fEPSP 斜率诱发了突触传递的强烈抑郁 (白色圆圈)。然而, 作为代表 fEPSP 踪影在 (黑踪影) 和以后 (红色踪影在 110th分钟) 有限公司归纳表明, 前纤维凌空抽射 (垂直的黑箭头) 极大地减少了。这是一个例子, 表明在刺激电极的电化学过程可能会损害传入, 造成一个不依赖于有限责任公司相关机制的抑郁症。将刺激强度降低到 fEPSP 的 50%, 可使突触传递到较低的程度, 但不改变前纤维凌空 (灰填充圈)。(B) 感应在水库-carbogenation 和小 aCSF 水库 (res-carb) 的试验中, 没有引起 fEPSP 斜坡的持久凹陷。(C) 流出-carbogenation 与回收的一个小 aCSF 水库改善了该公司的结果。插入物存在代表 fEPSPs 在之前 (黑踪影) 和以后 (110th极小, 红色踪影) 有限公司归纳。对于代表 fEPSPs, 垂直刻度条表示 1 mV, 水平标尺对应于2毫秒. 数据从急性海马切片 (350 µm) 的1至2月老 C57/BL 6 小鼠获得, 并以平均± SEM 显示. 括号: 每个时间点组的统计比较;不配对 T 检验, 不假设一致的标准偏差。* p 和 #60; 0.05, ns: 显著。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然界面切片室表现出更强大的突触响应25,26,27,28, 淹没腔室为膜片钳记录和荧光提供了额外的便利成像.因此, 我们已经描述了几个方面的现场电位记录的急性海马切片使用商业浸没切片室, 可以很容易地扩展到成像的荧光探针在神经元17,18, 19。除切片准备25外, 在数小时后的记录室中保持恒定的卡波金水平是其中一个障碍。由于卡波金水平只能由 aCSF 储层初始饱和度控制, 所以在日常实验中容易得到 aCSF 的氧水平的差异。因此, 建议使用氧气计来加速故障排除, 并调整条件 (例如,温度、卡波金流速、carbogenation 工具和 aCSF 回收率), 以在稳定的 aCSF 油藏中达到至少28毫克/升氧气水平.此外, 通常的做法, 改变大小的 aCSF 容器的药物应用, 可以诱发影响的领域潜力, 由于不同的卡波金水平。
利用流出-carbogenation 的一个小的回收缓冲体积提高了突触可塑性实验的结果。液体中氧的溶解是基于液体的接触面积和卡波金的较大比例。此外, 外流-carbogenation 减少了 aCSF 水库卡波金枯竭的 aCSF 的供应。根据商用产品的原理29, 可进一步改进 carbogenation 的稳定性。
即使采用最佳的切片制备和设置条件, 在使用绝缘金属刺激电极时, 也不可避免地不能诱发场电位。通常, 原因是绝缘材料因弯曲或清洗而损坏。正如我们在方法中所指出的, 一个简单的方法是在低直流电压下检查气泡的形成。此外, 此步骤有助于清洁尖端和减少刺激电极的阻抗。利用玻璃管进行刺激是很常见的, 它的优点是提供了一个较窄的纤维刺激领域。通常, 在使用玻璃吸管时, 不可能找到最大的 fEPSP 斜率。在 fEPSP 衰变阶段中, 人口峰值的正源分量的出现可以用来调整刺激强度23。
5月出版物关于诱导活动依赖性突触可塑性和介入不同的信号通路依赖于应用的归纳协议是可利用的10。然而, 从方法论的角度来看, 高频刺激可能会导致明显的伪影, 可以阻止突触可塑性的成功诱导。重复的 100 Hz/1 s 刺激可能导致极化的刺激电极或电化学反应30, 导致突触传递的抑郁症, 由于损坏的传入 (见图 8的例子)。为了使电化学过程最小化, 建议使用双相刺激脉冲和一个不超过2伏的刺激功率进行基线记录。
总之, 外流 carbogenation 有助于稳定氧气水平的实验, 依靠回收的小缓冲水库, 提高了成本效益的药物实验。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人声明, 这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的, 可被理解为潜在的利益冲突。
Acknowledgments
. 进行、分析、设计了实验并写了手稿。D.X. 和中共协助图准备和进行实验。这项工作得到了自然科学基金 (31320103906) 和111项目 (B16013) 对肺结核
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
