Summary
ويصف هذا البروتوكول تحقيق الاستقرار في مستوى الأوكسجين في كمية صغيرة من المخزن المؤقت المعاد تدويرها والجوانب المنهجية لتسجيل تعتمد على النشاط اللدونة متشابك في شرائح هيبوكامبال الحاد المغمورة.
Abstract
على الرغم من أن التجارب التي أجريت على شرائح المخ كانت تستخدم منذ عام 1951، ما زالت المشاكل التي تقلل من احتمال تحقيق تحليلاً مستقرة وناجحة للتحوير انتقال متشابك عند إجراء التسجيلات الميدانية المحتملة أو داخل الخلايا. هذه المخطوطة يصف الجوانب المنهجية التي قد تكون مفيدة في تحسين الظروف التجريبية للحفاظ على شرائح الدماغ الحادة وتسجيل إمكانات بوستسينابتيك ضادات الميدانية في دائرة غمر متاحة تجارياً مع وحدة كاربوجينيشن إلى الخارج. ويساعد التدفق--كاربوجينيشن لتحقيق الاستقرار في مستوى الأوكسجين في التجارب التي تعتمد على إعادة تدوير الخزان العازلة الصغيرة لتعزيز فعالية التكاليف التجارب المخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، يعرض المخطوطة تجارب الممثل أن دراسة آثار أنماط كاربوجينيشن مختلفة ونماذج التحفيز على اللدونة متشابك تعتمد على نشاط انتقال متشابك.
Introduction
في عام 1951، كانت التجارب شريحة الدماغ الحادة التي ذكرت أول أجرى1. في عام 1971، بعد التسجيلات الناجحة في المختبر من الكمثرى قشرة2،3 واكتشاف أن الخلايا العصبية هيبوكامبال مترابطة العرض على طول المحور سيبتوتيمبورال الحصين4، واحدة من وكان أول التسجيلات في المختبر لنشاط الخلايا العصبية هيبوكامبال حققت5. التشابه بين المعلمات العصبية أو نيوروستروكتورال من الخلايا العصبية تحت ظروف فيفو في و في المختبر لا تزال موضوعا ل المناقشة بعض6، ولكن في عام 1975، أشارت شوارتزكروين7 القاعدية يتم الاحتفاظ بخصائص الخلايا العصبية في المختبر وأن التحفيز عالية التردد (أي، تيتانيزاتيون) من أفيرينتس في تشكيل هيبوكامبال الحث تيسير إمكانات متشابك8طويلة الأمد. الكهربية من تسجيل نشاط الخلايا العصبية في المختبر توسعا كبيرا في دراسة الآليات الخلوية المعتمدة على النشاط اللدونة متشابك9،10، التي اكتشفت في عام 1973 بالنعيم et al. 11 في فيفو التجارب مع الأرانب.
دراسة نشاط الخلايا العصبية أو إشارات المسارات في شرائح المخ، ولا سيما في الشرائح هيبوكامبال الحاد، الآن أداة قياسية. ولكن المثير للدهشة، تجارب في المختبر لم تكون موحدة، كما يدل على ذلك النهج المتعددة التي لا تزال قائمة لإعداد وصيانة لشرائح هيبوكامبال الحاد. ريد et al. (1988) 12 استعراض التحديات المنهجية للحفاظ على شرائح الدماغ الحادة في أنواع مختلفة من الدوائر شريحة والخيارات للاستحمام المستوى المتوسط والأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والأكسجين. هذه المعلمات التي ما زال من الصعب التحكم في قاعة التسجيل بسبب عناصر مصنوعة خصيصا للأجهزة في المختبر تسجيل شريحة. منشورات يمكن العثور على أنه قد تساعد على التغلب على بعض التحديات المنهجية والتي تصف أنواع جديدة من غمر شريحة الدوائر، مثل نظام ميكروبيرفوسيون 3D فراغي13، دائرة مع تعزيز تدفق الصفحي والأكسجين العرض14، ونظام ب مراقبة درجة الحرارة المحوسبة15، و نظام تسجيل غرفة متعددة16. هذه الغرف ليست سهلة لبناء، تعتمد معظم العلماء على الدوائر شريحة المتاحة تجارياً. يمكن تحميل هذه الدوائر على نظام مجهر، مما يسمح للجمع بين الكهربية والأسفار التصوير18،،من1719. نظراً لهذه الدوائر تبقى شرائح المخ المغمورة في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)، بمعدل تدفق عالية من المخزن المؤقت الحل تحتاج إلى صيانة، زيادة نفقات تطبيق المخدرات. وتحقيقا لهذه الغاية، ادخلنا نظام التروية إعادة تدوير مع تدفق--كاربوجينيشن الذي يوفر الاستقرار كافية لتسجيل الإمكانات الميدانية في دائرة غمر شريحة باستخدام وحدة تخزين صغيرة نسبيا قام طويلة الأجل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا تلخيص كيف يؤثر استخدام هذا النظام التجريبي كاربوجينيشن/التروية نتائج تعتمد على النشاط اللدونة متشابك10 وكيف ينظم متشابك تثبيط استطالة حقيقية النواة 2 عامل كيناز (eEF2K) 20من انتقال العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى على الحيوانات وفقا للمعايير المقررة لرعاية الحيوان والإجراءات لمعاهد علوم المخ والدولة مفتاح المختبر من الطبية بيولوجيا الأعصاب من جامعة فودان، شانغهاي، الصين.
1-حل إعداد
ملاحظة: انظر الجدول للمواد.
- إعداد المخزن المؤقت تشريح (حل معدلة جي): 92 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملم بوكل، 1.25 ملم نة2بو4، 30 ملم ناكو3، جلوكوز 25 مم، 20 مم حبيس، 3 مم نا+-بيروفات، 10 مم MgSO4، و 0.5 مم كاكل2.
- قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم م 1 دون كاربوجينيشن.
- مخزن المخزن المؤقت في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: توضح المعايرة السائل الملبدة بالغيوم. أوسمولاليتي موسم 305-310. كاربوجين21 يحتوي على الأكسجين 5% ثاني أكسيد الكربون و 95 في المائة. - إعداد قام بإضعاف 10 × الحل الأسهم من قام يحتوي على بيكربونات والسكر، إعطاء تكوين نهائي ل: 124 مم كلوريد الصوديوم 2.5 ملم بوكل، كاكل 2.5 ملم2، 2 مم مجكل2و 1.25 مم خ2ص4.
- إضافة بيكربونات والسكر تصل إلى 10 ملم الجلوكوز و 26 ملم ناكو3.
- كاربوجيناتي قام من خلال أنبوب مثقب سيليكون مع نهاية محظورة فورا بعد إضافة ناكو3.
- قياس درجة الحموضة بينما كاربوجيناتينج (7.3-7.4 pH).
ملاحظة: سعة المخزن المؤقت يمكن تعديلها قليلاً عن طريق تغيير كمية ناكو3. نظراً لدرجة الحموضة الناتجة تعتمد على درجة الحرارة، من الضروري أن تحقق درجة الحموضة الناتجة أثناء كاربوجيناتينج في درجة حرارة العامل (مثلاً، 30 درجة مئوية).
2-إعداد شرائح هيبوكامبال الحادة
ملاحظة: انظر الجدول للمواد.
- وضع شبكة شريحة-عقد في تشكيل غرفة حضانة لشرائح الدماغ الحادة، وملء الدائرة مع قام، وكاربوجيناتي (4-6 لتر/ساعة) على الأقل 30 دقيقة22 في 28-30 درجة مئوية.
- بارد الأدوات الجراحية وصولاً إلى 2-4 درجة مئوية.
- ضع كوب زجاج مليئة بالبرد وتقطيع المخزن المؤقت (2-4 درجة مئوية) وصيانتها في أن خليط جليد ومياه، قرب فيبرتوم كاربوجيناتيد.
- تخدير الجرذان أو الفئران حتى تختفي ردود الفعل القرنية (30-50 ثانية) باستخدام إيسوفلوراني بأخذ 500 ميليلتر في جرة زجاجية 2 لتر أو 12.5 ميليلتر في أنبوب 50 مل.
- عزل الدماغ باستخدام أسلوب وصف وتصور بالتفصيل في منشورات ماتيس et al. (2011) 23 ويوانكسيانج et al. (2014) 24.
- تبريد الدماغ وصولاً إلى 2-4 درجة مئوية في مخزن مؤقت تشريح المثلج (لمدة 2 دقيقة على الأقل) قبل تشريح المخيخ وفصل في نصفي الكرة الأرضية.
- استخدام شفرة جراحية باردة لتشريح قطعة من قشرة الظهرية بزاوية 70 درجة على طول الحافة الظهرية لكل نصف الكرة الأرضية25 للحصول على شرائح عرضية من البطني والجزء المتوسط من قرن آمون، كما هو مبين في الشكل 1ج و هاء.
- مع ملعقة أسمنت أسنان باردة، نقل نصف الكرة بقطعة من ورق الترشيح بإيجاز الجافة على السطح الذي تم إنشاؤه (ق 1-2).
- جبل نصفي مع الأسطح طازجة قطع على منصة تشريح المثلج باستخدام الغراء لاصق سريع المفعول؛ لقد نهاية والذيلية من على وجه الكرة الأرضية شفرة حلاقة (الشكل 1د).
- وضع منهاج تشريح في غرفة التبريد فيبرتوم وملء تلك الدائرة مع المخزن المؤقت تشريح (2-4 درجة مئوية). كاربوجيناتي استخدام أنبوب مثقب سليكون.
- قص 350 ميكرون الشرائح باستخدام إعدادات فيبرتوم كافية (مثل سرعة النصل إلى الأمام: 1.2 mm/s، بليد السعة: 1 ملم).
- عزل تشكيل هيبوكامبال من سوبيكولوم وكورتيسيس انتورهينال باستخدام اثنين الحقن cannulas (> ز 28) كالمقص.
- إزالة الفقاعات من مش عقد شريحة الدائرة الحضانة المعدة مسبقاً باستخدام ماصة باستور.
- نقل الشرائح التي لديها بعض الشفافية في بيراميدالي الطبقة من منصة تشريح على شبكة غرفة الحضانة. تجنب أي قابلة للطي وتمتد، والتداخل، والعائمة قبل يسفط قام والشريحة إلى ماصة باستور كبير فم.
ملاحظة: يمكن أن يستغرق الإجراء بأكمله (الخطوة 2، 5-2، 14) 5-10 دقيقة؛ ولذلك، من المهم لفحص درجة حرارة المخزن المؤقت الحل مع مرور الوقت للحفاظ عليه في 4 درجات مئوية. - احتضان الشرائح عند 30 درجة مئوية على الأقل 1.5-2 ح في غرفة الحضانة وتوفير كاربوجين في 4-6 لتر في الساعة.
ملاحظة: ضبط معدل تدفق كاربوجين تعميم المخزن المؤقت في الحاضنة، ولكن منع الشرائح عائمة.
3-إدخال تعديلات على كاربوجينيشن لقام "إعادة التدوير من الخزانات الصغيرة"
- إضافة موصل أنبوب 3-الطريق إلى التدفق الخارجي لنظام إعادة التدوير (الشكل 2ب).
- توصيل الذراع الأوسط موصل الأنبوب 3-الطريقة مع أنبوب توريد كاربوجين وتنظيم معدل التدفق مع مقياس تدفق الهواء (3-4 لتر في الساعة، الشكل 2د و الشكل 4ج).
- إضافة موصل أنبوب 3-الطريقة ثانية لتدفق نظام إعادة التدوير. توصيل الذراع الأوسط للأنبوبة التي تواجه سخان مضمنة والقسم العلوي من الذراع إلى أنبوب رقيقة سليكون (طولها 10 سم)، والذراع السفلي إلى أنبوب التدفق من الخزان (المنخفضة تمرير مرشح؛ الشكل 4 ج).
- مكان عصارة أنبوب على أنبوب رقيقة سليكون (OD: 2 مم) في موضع على طول الأنبوب أين نبض قام في قاعة شريحة، التي تم إنشاؤها بواسطة مضخة تمعجية، في حدها الأدنى.
ملاحظة: التدفق كاربوجينيشن (تدفق-الكربوهيدرات.) تعديل يقلل حساسية على المستوى كاربوجينيشن لحجم الخزان قام، قام إعادة التدوير معدل، والمواقف النسبية أنبوب داخل الخزانات الصغيرة قام (< 50 مل؛ الشكل 3). فيما يتعلق بمرشح تمرير منخفض، يقلل كمية معينة من الهواء في أنابيب رقيقة سيليكون نبض تدفق قام؛ وهكذا، ينبغي ملء الأنبوب في الغالب مع الهواء.
4.تسجيل الاستجابات متشابك في دائرة شريحة غمر
ملاحظة: انظر الجدول للمواد.
- قبل الحارة الحل قام في حمام مائي لحوالي 28-30 درجة مئوية (وهذا يمنع تكوين فقاعة في دائرة التسجيل).
- بدء تشغيل نظام إعادة التدوير (4-5 مل/دقيقة) وتنشيط سخان مضمنة حجته نظام ح 1 على الأقل.
- بريسواك قطعة صغيرة من عدسة تنظيف الورق ونايلون شبكة ثابتة على سلك البلاتين على شكل U في قاعة شريحة غمر لبضع دقائق (الشكل 4).
- إزالة سلك البلاتين على شكل U.
- إيقاف تشغيل إعادة التدوير ووضع شريحة على العدسة تنظيف الورق.
- فورا بوضع شبكة عقد شريحة أعلى الشريحة والتبديل على المضخة واسمحوا شريحة حجته لمدة 30 دقيقة دون غمس الهدف إلى قام.
- ملء ميكروبيبيتي البورسليكات (أي، مسرى التسجيل) مع قام (تلميح المقاومة: شغل MΩ 1-2، 1/3 مع قام) وجبل بأنها في حامل ماصة.
- فحص العزل الكهربائي التحفيز معدنية بوضعه في NaHCO3 الحل (> 40 ملم). الاتصال القطب إلى القطب السلبي من مولد الجهد DC (الخامس 1-2، القطب إيجابية: سلك الفضة أو البلاتين)، ومراعاة تكوين فقاعات في التلميح تحت مجهر تشريح (> التكبير 60 x).
- ضع مسرى التحفيز التنغستن معزول الإيبوكسي تم اختبارها في حامل مناور وأسلاك الإشارة في قاعة شريحة.
- إضافة قطب إشارة ثانية إلى الدائرة وتوصيله إلى مقبس إشارة من هيدستاجي تسجيل القطب (الشكل 4أ).
- في برنامج التحكم مكبر للصوت، انقر فوق مربع "وضع المشبك صفر" والمضي قدما بالنقر المزدوج فوق مربع "إخراج الحصول على قائمة". اختر مكسب من "100"، انقر نقراً مزدوجاً فوق "عالية تمرير تصفية مربع القائمة (سل)،" اختر "0.1 هرتز"، وانقر نقراً مزدوجاً فوق "تمرير منخفض مرشح مربع القائمة (AC)" لاختيار "3 كيلو هرتز."
- في برنامج التسجيل، انقر فوق شأن "اكتساب | فتح البروتوكول ". اختر بروتوكول يحتوي على إعدادات السماح تلقائياً للتحفيز العرضية والترقيم من إمكانات تضخيم في 10-20 كيلو هرتز 50-100 مللي ثانية، وأن يشغل المعزل تحفيز 10 مللي ثانية بعد بدء تسجيل العرضية.
- ضع التحفيز واقطاب تسجيل في سطر وموازية ل pyramidale الطبقة، على سبيل المثال (الشكل 4ب و الشكل 5).
- انقر فوق "الحصول على | تحرير البروتوكول "واختر علامة التبويب" المشغل "(في إطار منبثق). انقر فوق المربع "مشغل مصدر" واختيار "الفضاء بار" كمصدر للمشغل. انقر فوق الزر "موافق". انقر فوق الزر "تسجيل" لبدء اكتساب وملاحظة نافذة منبثقة مع زر الزناد.
- في برنامج حافز المعزل، انقر فوق مربع "التحكم بالجهد" وأدخل "0". انقر فوق الزر "تحميل". انقر فوق في إطار "برنامج تسجيل" واضغط على شريط المسافة. كرر هذه الدورة بالتتابع إدخال القيم من 1 إلى 8، وعلى سبيل المثال، في خطوات أم 1 في المربع "التحكم بالجهد".
- الربط بين قوة التحفيز مع القيم فيبسب-المنحدر وتحديد قوة التحفيز المطلوب للحصول على الحد الأقصى 40% من فيبسب-المنحدر. انقر فوق "مربع عنصر التحكم الجهد"، وقم بإدخال القيمة المحددة. انقر فوق الزر "تحميل".
ملاحظة: يتم استخدام المعزل تحفيز تطبيق الجهد موجزة أو البقول الحالية على أنسجة المخ. يمكن أن يكون للحبوب ثنائية الطور المايكروثانيه 100 كل مرحلة. - في برنامج التسجيل، انقر فوق الزر إيقاف ثم في القائمة "الحصول". انقر فوق "تحرير البروتوكول" واختر علامة التبويب "المشغل" في إطار منبثق. انقر فوق مربع المصدر مشغل واختار "جهاز ضبط الوقت الداخلي" كمصدر للمشغل. انقر فوق الزر "موافق". انقر فوق الزر السجل يبدأ التسجيل التلقائي للإمكانات الميدانية كل 30 ثانية، على سبيل المثال. انقر فوق الزر "إيقاف" بعد 30-60 دقيقة.
- انقر فوق القائمة "الحصول على"، انقر فوق "بروتوكول مفتوحة"، اختر البروتوكول التعريفي المرجوة من اللدونة متشابك، وانقر فوق الزر "موافق". انقر فوق الزر "تسجيل" لتنشيط تلقائياً على تحفيز عالية التردد وتسجيل. انقر فوق الزر "إيقاف".
ملاحظة: في حالة الدراسات المتصلة اللدونة متشابك، تطبيق واحد من النماذج القياسية التعريفي للتقوية طويلة الأجل أو طويلة الأجل من الاكتئاب بعد التسجيل المطول خط الأساس. يصور الممثل أمثلة على تحوير الناتجة عن انتقال متشابك في الرقم 7 و الرقم 8. - في برنامج التسجيل، انقر فوق "الحصول على | فتح بروتوكول "واختر البروتوكول نفسه كما في الخطوة 4، 12. انقر فوق الزر "موافق" ومن ثم انقر فوق "تسجيل". الاحتفاظ تلقائياً بتشغيل التسجيلات الميدانية المحتملة ح 2-4، على سبيل المثال. انقر فوق الزر "إيقاف" إنهاء التسجيل.
- في حالة الدراسات الصيدلانية، تطبيق المجمع مباشرة قام خزان إذا كانت الإدارة مجمع الدائمة المطلوب (الشكل 6).
5-تنظيف الإعداد وتلميحات
ملاحظة: انظر أدناه للحصول على نصائح عامة.
- تنظيف النظام الأسبوعي بإعادة تدوير 10 ٪ ح2س2 للا يزيد عن 20 دقيقة، متبوعاً بالغسيل بواسطة H2o.
ملاحظة: لا ينصح الإيثانول للتنظيف. ليس من المستحسن كذلك أن تزج بأسلاك المرجع والهدف في ح2س2. - إزالة الملح سرع على سطح العدسة الهدف أو محيط الدائرة مع 0.1 N HCl ثم الماء.
- أغسل bubbler كاربوجين في الماء المقطر أو 0.1 N HCl.
- تزج غرفة الحضانة شريحة في 10 ٪ ح2س2 لمدة 5 دقائق مرة واحدة في أسبوع وثم شطف جيدا غرفة الحضانة مع منزوع H2o.
- في حالة أقطاب التحفيز معدنية، شطف نصيحة الكهربائي محفزة مع المياه. بعد كل تجربة ولطف يمسح طرف القطب حفز مع كرة القطن غارقة مع الإيثانول لإزالة الأنسجة المتبقية.
- تقليل مقاومة أقطاب التحفيز المعدنية التجارية عن طريق إزالة العزل في تلميح عن طريق انتقد حذراً مع الصنفرة.
- الحد من الخسائر كاربوجين من قام أثناء إعادة التدوير من خلال الأنابيب باستبدال أنابيب السيليكون بأنابيب تترافلوروايثيلين.
- إبقاء الأسلاك الفضية لتسجيل القطب والقطب مرجع في التبييض لعدة أيام بشكل أجكل على سطح الأسلاك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في المقطع بروتوكول، وصفت لنا إعداد شرائح هيبوكامبال الحاد من الجزء البطني والوسيطة لتشكيل هيبوكامبال (الشكل 1) من الفئران الذكور C57BL/6 وذكور جرذان ويستار (5-8 أسابيع). يساعد على المحافظة على استقرار وضع نصفي الكرة الأرضية على منصة تقطيع اللحم ويزيل الحاجة إلى تحقيق الاستقرار مع أجار أو [اغروس]. نظام التروية نفسه يستند على مضخة تمعجية يعمل على تناوب عالية لإعطاء معدل التدفق المطلوبة من السائل. وهكذا، الشيخوخة السريعة لمعيار أنابيب داخل المضخة خلقت مشكلة كبيرة أن تغلبنا باستخدام أنابيب غير السليكون (معرف: 1.02 مم). يتم أيضا إنشاء الضغط السلبي للتدفق بالأنابيب الموصولة بالتوازي مع اثنين التي تحتوي قطر داخلي مم 2.79. تتصل هذه الأنابيب اثنين قنية في قاعة التسجيل للسماح لتطلع السائل (الشكل 4أ). يجب أن يكون معدل كاربوجينيشن قام في الخزان مستقرة على مدى ساعات عديدة، التي يمكن أن تكون صعبة لتحقيق استخدام الحجارة التهوية أو أنابيب مع المسام الصغيرة. منذ خروج-كاربوجيناتيون لا تعتمد على المسام الصغيرة، وأن معدل تدفق كاربوجين على مر الوقت ما زالت مستقرة (الشكل 2). إذا كانت التجارب مع خزان صغير قام، التدفق-كاربوجينيشن يساعد على تحقيق توازن الأوكسجين الذائب (الشكل 3). وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يقلل من تباين مستوى الأوكسجين بين التجارب التي تستند إلى وضع أنبوب تغيير تدفق/تدفق عدد المسام النشطة في أنابيب فقاعة كاربوجين، ومعدل إعادة تدوير السائل.
يتم وضع الشريحة على ورقة العدسة للسماح بتبادل بعض السائل من أسفل (الشكل 4أ). منذ الدائرة شريحة يمكن تركيبة على مجهر تستقيم التي هي مجهزة هدفا س 40، يمكن وضع أقطاب كهربائية منضبطة (الشكل 4ب و الشكل 5). وهذا يقلل زيادة تنوع التجارب في العمل اليومي.
لتحديد قوة التحفيز المطلوب لتسجيل الأساس الميدانية المحتملة، الاعتماد على حجم الحقل المحتملة على قوة التحفيز يجب أن تتقرر بتسجيل فيبسبس في حفز مختلف نقاط القوة (الرقم 5 ). قياس المدخلات والمخرجات والسمة يخلق بعض التوتر على الشريحة في أعلى نقاط قوة التحفيز. وهكذا، هو نهج آخر للبحث عن قوة تحفيز التي تثير فقط مكون سبايك سكان إيجابية في فيبسب-الانحلال (الأسهم السوداء في الشكل 5)26.
وبعد تسجيل خط أساس مستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل، يمكن أن تبدأ إدارة المخدرات. هنا، وقد عرضنا مثال من آثار مثبطات eEF2K على انتقال متشابك. تثبيط eEF2K يعزز انتقال متشابك (الشكل 6A)، هو تأثير الذي كان يخفف بتثبيط p38 MAPK (الشكل 6ب)20.
تعتمد على النشاط اللدونة متشابك يمكن تكون الناجم عن مجموعة متنوعة من نماذج التحفيز10. هنا، قدمنا تجارب الممثل من اللدونة متشابك التي تعتمد على تسلسل مستمر من المحفزات في 100 هرتز والتحفيز المتكرر في 1 هرتز ما يزيد على 15 دقيقة. وقد تم يصور التحوير الناتج من انتقال متشابك في الرقم 7 و الرقم 8. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إظهاره في الشكل 7 و 8 الرقم أن استقرار مستوى الأوكسجين من الخزانات الصغيرة المخزن المؤقت بالتدفق كاربوجينيشن (دوائر بيضاء، مستوى الأوكسجين النسبي في 24-40 دقيقة في الشكل 3) تحسنت الكمونية والتعريفي المحدودة بالمقارنة مع تجارب مع خزان كاربوجينيشن فقط (دوائر رمادية، مستوى الأوكسجين في دقيقة 7-24). ونحن لا اختبار المزيج من كاربوجينيشن إلى الخارج وخزان-كاربوجينيشن (7-24 دقيقة) لأننا كنا تهتم بإنشاء نظام تجريبي مع استخدام كاربوجين أقل وأبسط. الخزان كاربوجينيشن بدون إعادة التدوير (تصل إلى 7 دقيقة) يمثل مستوى خط الأساس للأكسجين في الخزان قام.
رقم 1: تحديد المواقع في نصفي الكرة الأرضية الدماغ للحصول على شرائح عرضية من الحصين استخدام فيبرتوم. (أ) تشكيل هيبوكامبال يرد في طريقة عرض أفقي في نصف الكرة الأيمن، باللون الأخضر، ضمن نموذج الدماغ ماوس أعيد بناؤها. (ب) عرض البطني تشكيل هيبوكامبال. (ج) رأي روسترال إلى والذيلية يوضح قسم من الجزء البطني والوسيطة من تشكيل هيبوكامبال لنصف الكرة الأيسر في الطائرة الأفقي. نظراً لمختلف المناطق على طول محور سيبتوتيمبورال الحصين درجات مختلفة من وظيفة وتعصيب31،32، زاوية قطع مختلفة مطلوب لشرائح عرضية من الحصين الظهرية، عن على سبيل المثال. شريط المقياس = 3 مم (خطوط بيضاء أفقية). (د) تظهر الصورة في نصفي الكرة من الدماغ الفئران لصقها على منصة فيبرتوم. شريط المقياس = 6 مم. (ﻫ) الرسم يصور الزاوية لتقليم الحافة الظهرية من القشرة (مخطط العليا) المنفصلين عن حق نصف الكرة الغربي (خط منقط أسود) والاستدارة (السهم الأحمر) بالغراء الدماغ على السطح الذي تم إنشاؤه على النظام الأساسي تشريح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : عناصر النظام كاربوجينيشن للخزانات قام أدناه 50 مل. (أ) نظم كاربوجينيشن القياسية استخدام أنابيب مثقبة (أ) كجهاز فقاعة "كاربوجين"؛ كان أنبوب مثقب بثقوب متعددة مع أسلاك فولاذ المقاوم للصدأ قطرها ميكرومتر 250. (ب) تدفق--كاربوجينيشن (ب) 3-طريقة أنبوب موصل (القطر الداخلي: 2 مم) أو الوحدة (ج) تنفيس يمنع تدفق السائل مرة أخرى مع عامل تصفية عمود المصباح.الذراع الأوسط موصل 3-طريقة أنبوب متصل بخزان كاربوجين بعد لكنها (ضغط الغاز: < 1 atm) ومقياس التدفق. وترتبط بالأسلحة المتبقية داخل الأنبوب إلى الخارج قام. (د) كاربوجين معدل التدفق يسيطر تدفق متر. وخلال هذه التجارب، تحفظ الخزانات قام في 28-30 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: على مستويات الأوكسجين في 40 مل قام في ظروف مختلفة- مستوى الأكسجين خلال الخزان-كاربوجينيشن (القرار-الكربوهيدرات.) وإعادة التدوير قام انخفض باستمرار (الدوائر مملوءة باللون الرمادي، n = 3). ومع ذلك، التدفق--كاربوجينيشن (تدفق-الكربوهيدرات.) أثناء قام إعادة التدوير تخفض انخفاض مستوى الأكسجين، والتوصل إلى توازن في مستويات خط الأساس (الدوائر مليئة بالأبيض، ن = 3). تم قياس مستويات خط الأساس مع القرار الكربوهيدرات. دون إعادة تدوير قام. خطوط رمادي منقط عمودي تشير إلى رمز التبديل لبروتوكولات كاربوجيناتيون مختلفة. آثار القرار الكربوهيدرات مع إعادة التدوير (7-24 دقيقة) والكربوهيدرات إلى الخارج. مع إعادة التدوير (دوائر بيضاء، 24-40 دقيقة) على استحثاث الكمونية والمحدودة ويرد في الشكل 7 و 8 الرقم. وترد البيانات ± يعني sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عناصر كاربوجينيشن إلى الخارج لإجراء تجارب عليها في دائرة شريحة غمر. (أ) العرض التقديمي شريحة غمر الدائرة. ويرد سلك البلاتين على شكل U بألياف النايلون عقد شريحة هيبوكامبال. أسلاك فضية كانت ملفوفة حول قنية صغيرة، خلق لفائف لزيادة مجال إنهاء أسلاك فضية. وضع سلك مرجع الحفز في الدائرة إلى الخارج، وكان مرجع التسجيل في القاعة الرئيسية. للحفاظ على مسرى إشارة محتملة مستقرة على مختلف المستويات السائلة، يمكن عزل سلك مرجع تسجيل بأنبوب بلاستيكي، تاركة فقط الجزء "تحت الماء" من سلك مكشوف للمخزن المؤقت. توضح الصورة (ب) مجال المشرق شريحة هيبوكامبال حاد ممثل والأقطاب. CA1، CA3: قرن أمونيس 1، 3؛ المديرية العامة: المغزلي المسنن؛ الفرعية: سوبيكولوم؛ الجماعة الأوروبية: انتورهينال اللحاء. (ج) التخطيطي يسلط الضوء على المكونات الرئيسية للتدفق كاربوجينيشن، دون إشارة إلى تدفق متر كاربوجين ومضخة تمعجية. يمكن وضع مرشح تمرير المنخفضة فقط أمام المدفأة مضمنة للحد من نبض تدفق قام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : التبعية لحقل الشكل المحتملة على قوة التحفيز ووضع أقطاب كهربائية- (أ) أمثلة الممثل حقل يصور الإمكانات، أثارت على مسافات مختلفة من الطبقة بيراميدالي (شارع pyr.)، وتحفيز مواطن القوة. السهام السوداء الأفقية تشير إلى عنصر مصدر الإيجابية لارتفاع السكان في الانحلال الميدانية المحتملة. بقي عنصر مصدر الإيجابية لارتفاع السكان تقريبا في منتصف الطريق مواقف القطب "خط" مرحلة اختباره على الإطلاق ارتفاع فيبسب الأولية، ما عدا واحدة قريبة جداً من طبقة خلايا الجسم (ه). (ب) موقف إيجابي المصدر المكون من المصطلحات السكانية اختلافاً سبب اختلالها أقطاب التحفيز وتسجيل. -أمريكا اللاتينية والكاريبي: طبقة لاكونوسوم موليكولاري؛ Rad.: رادياتوم الطبقة؛ Pyr.: pyramidale الطبقة؛ التوصية: تسجيل القطب؛ -Stim: التحفيز الكهربائي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : مثال من آثار مثبطات eEF2K على انتقال متشابك هيبوكامبال استخدام التدفق--كاربوجينيشن، مع إعادة التدوير ل خزان صغير قام20 . وبعد تسجيل فيبسبس في فواصل زمنية 1 دقيقة لمدة 20 دقيقة، أضيفت مثبط eEF2K A-484954 مباشرة إلى خزان قام (خط أفقي). وكان زيادة سريعة لانتقال متشابك يمكن كشفها (الدوائر مليئة بالأبيض). إذا لم يتم تطبيق الدواء، فيبسب-المنحدر ظلت مستقرة على مر الزمن التسجيل (الدوائر مملوءة باللون الرمادي). (ب) تطبيق المانع MAPK p38 (الخط الأفقي الرمادي) منعت eEF2K إينهيبيتو-الناجم عن تعزيز الإمكانات الميدانية. وترد البيانات ± يعني sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
7 الرقم: تسجيلات الممثل للتقوية تعتمد على نشاط انتقال متشابك استخدام تدفق--كاربوجينيشن (تدفق-الكربوهيدرات.؛ ودوائر بيضاء) وخزان-كاربوجينيشن (القرار-الكربوهيدرات.؛ والدوائر السوداء)، مع إعادة تدوير قام الصغيرة خزان- حملت التقوية بعد الوقت 0 نقطة قبل ثلاث مرات 100 هرتز/s القطارات (تيت.: تيتانيزيشن، وتحفيز عالية التردد). وترد البيانات ± يعني قوس sem.: مقارنة إحصائية لمجموعات كل الوقت نقطة؛ مزاوج اختبار T، افتراض لا يتفق الانحراف المعياري. * ف < 0.05.الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8 : التبعية للاكتئاب تعتمد على نشاط انتقال متشابك على قوة التحفيز وكاربوجينيشن- (أ) استخدام الخزان-كاربوجينيشن (القرار-الكربوهيدرات.) مع إعادة التدوير لوحدة تخزين كبيرة قام، أثارت حفز 1 هرتز لمدة 15 دقيقة في 80% من المنحدر فيبسب القصوى اكتئاب الشديد من انتقال متشابك (دوائر بيضاء). ومع ذلك، يتتبع فيبسب الممثل قبل (تتبع الأسود) وبعد تشير إلى الاستقراء (تتبع أحمر في دقيقةال 110) المحدودة، الطائرة الألياف بريسينابتيك (السهم الأسود الرأسي) كان تقلص إلى حد كبير. وهذا مثال مما يشير إلى أن العمليات الكهروكيميائية في مسرى التحفيز يمكن أن تضر أفيرينتس، تسبب اكتئاب التي لا تعتمد جزئيا على الآليات المتصلة بالمحدودة. خفض قوة التحفيز على 50 في المائة من الحد الأقصى فيبسب-المنحدر الناجم عن كساد انتقال متشابك لدرجة أقل من، ولكن دون تغيير الطائرة الألياف بريسينابتيك (الدوائر مملوءة باللون الرمادي). عدم استحضار التعريفي المحدودة (ب) اكتئاب دائم من فيبسب--المنحدرات في التجارب مع الخزان-كاربوجينيشن، وإعادة التدوير لخزان صغير قام (القرار-الكربوهيدرات.؛ والساحات المليئة باللون الرمادي). (ج) التدفق--كاربوجينيشن مع إعادة التدوير من خزان صغير قام تحسين نتائج توجيهي المحدودة. إدراج هذا الممثل فيبسبس قبل (آثار سوداء) وبعد (آثار دقيقة، الأحمرال 110) التعريفي المحدودة. فيبسبس الممثل، تشير إلى أشرطة مقياس عمودي 1 أم، وأشرطة مقياس أفقي تتوافق مع السيدة 2 البيانات تم الحصول عليها من شرائح هيبوكامبال الحاد (350 ميكرومتر) من 1 إلى 2 شهرا 6 C57/BL الفئران وترد ك ± يعني "بين قوسين sem." : مقارنة إحصائية لمجموعات كل الوقت نقطة؛ مزاوج اختبار T، افتراض لا يتفق الانحراف المعياري. * ف < 0.05، ns: غير هامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن واجهة شريحة الدوائر يحمل أكثر قوة الردود متشابك25،26،،من2728، غمر دوائر توفير راحة إضافية لتسجيل التصحيح-المشبك والأسفار التصوير. وهكذا، لقد قمنا بوصف عدة جوانب من التسجيلات الميدانية المحتملة في شرائح هيبوكامبال الحاد باستخدام دائرة شريحة غمر تجارية التي يمكن أن تمتد بسهولة إلى تصوير المسابير fluorescence في الخلايا العصبية17،18، 19. وإلى جانب إعداد شريحة25، الحفاظ على مستوى ثابت كاربوجين في قاعة التسجيل بعد عدة ساعات يمثل إحدى العقبات. نظراً لمستوى كاربوجين يمكن التحكم بتشبع الخزان قام الأولية فقط، يتم بسهولة الحصول على الاختلافات في مستوى الأوكسجين في قام في التجارب اليومية. وبالتالي، يوصي مقياس أكسجين للإسراع في استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتكيف مع الظروف (مثل درجة الحرارة ومعدل التدفق كاربوجين وأدوات كاربوجينيشن وقام معدل إعادة التدوير) تصل إلى مالا يقل عن 28 مغ/لتر أكسجين في الخزان قام في مستقر المستويات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستحث الممارسة الشائعة لتغيير حجم الحاوية قام لتطبيق المخدرات آثار على الإمكانات الميدانية نظراً للاختلافات في مستويات كاربوجين.
استخدام التدفق--كاربوجينيشن من وحدة تخزين المخزن المؤقت إعادة التدوير الصغيرة تحسين نتائج التجارب اللدونة متشابك. يستند إلى تذويب محسنة من الأوكسجين السائل نسبة أكبر بين منطقة الاتصال السائل وكاربوجين. وباﻹضافة إلى ذلك، يقلل التدفق-كاربوجينيشن توريد قام كاربوجين المستنفد في الخزان قام. يمكن زيادة تحسين استقرار كاربوجيناتيون فنتوري مصممة خصيصا على أساس المبدأ من المنتجات التجارية29.
حتى مع أفضل شريحة إعداد وظروف الإعداد، أنها غالباً ما لا مفر منه أن لا الناجمين عن إمكانات الحقل عندما يتم استخدام أقطاب التحفيز معدني معزول. في كثير من الأحيان، والسبب أن العزل قد تضررت بسبب الانحناء أو التنظيف. وكما أشرنا في الأساليب، نهج بسيط للتحقق من تكوين فقاعة في DC-الجهد المنخفض. وبالإضافة إلى ذلك، تساعد هذه الخطوة لتنظيف التلميح وتقليل مقاومة القطب التحفيز. استخدام الماصات الزجاجية لتحفيز شائع ويتميز بتوفير حقل أضيق من تحفيز الألياف. في كثير من الأحيان، من غير الممكن إيجاد منحدر فيبسب قصوى عند استخدام التحفيز ماصة زجاجية. ثم قد يتم استخدام مظهر العنصر المصدر إيجابية لارتفاع السكان في مرحلة الانحلال فيبسب لضبط قوة التحفيز23.
قد نشر فيما يتعلق بتنظيم دورات تعريفية لتعتمد على النشاط اللدونة متشابك وإشراك مسارات إشارات مختلفة تعتمد على بروتوكول التعريفي التطبيقية المتاحة10. ومع ذلك، من وجهة نظر منهجية، قد يسبب تحفيز عالية التردد التحف المتميزة التي يمكن أن تمنع تعريفية ناجحة من اللدونة متشابك. يمكن أن يسبب متكررة 100 هرتز/1 s حفز استقطاب أقطاب التحفيز أو التفاعلات الكهروكيميائية30، أسفر عن الاكتئاب انتقال متشابك نظراً الأضرار التي لحقت أفيرينتس (انظر الشكل 8 على سبيل مثال). لتقليل العمليات الكهروكيميائية، يوصي باستخدام ثنائية الطور تحفيز البقول وقوة تحفيز لا يزيد على 2 الخامس لتسجيلات خط الأساس.
وباختصار، تدفق--كاربوجينيشن يساعد على استقرار مستوى الأوكسجين في التجارب التي تعتمد على إعادة تدوير الخزان العازلة الصغيرة، تعزيز فعالية التكاليف التجارب المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أنه أجرى البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.
Acknowledgments
قد أجرى، وتحليلها، وتصميم التجارب وكتبت المخطوطة. مركزي وس. ب. وساعدت في إعداد الشكل وإجراء التجارب. هذا العمل كان يدعمها تشرف (31320103906) والمشروع 111 (B16013) على يد
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
