Denne protokollen beskriver stabilisering av oksygennivået i en liten mengde resirkulert buffer og metodologiske aspekter ved opptak aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet i neddykket akutt hippocampus skiver.
Selv om eksperimenter på hjernen stykker har vært i bruk siden 1951, fortsatt problemer som reduserer sannsynligheten for å oppnå en stabil og vellykket analyse av synaptic overføring modulering når potensielle eller intracellulær andre. Dette manuskriptet beskriver metodiske aspekter som kan være nyttig i å forbedre eksperimentelle forhold for vedlikehold av akutt hjernen skiver og opptak feltet eksitatoriske postsynaptic potensialer i en kommersielt tilgjengelig neddykking kammer med en strøm-carbogenation enhet. Strøm-carbogenation bidrar til å stabilisere oksygennivået eksperimenter som bruker resirkulering av en liten buffer reservoaret for å forbedre kostnadseffektiviteten av stoffet eksperimenter. I tillegg presenterer manuskriptet representant eksperimenter undersøke effekten av ulike carbogenation moduser og stimulering paradigmer på aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet av synaptic overføring.
I 1951 ble første rapporterte akutte hjernen stykke eksperimenter utført1. I 1971, etter vellykket i vitro opptak fra piriform cortex2,3 og funnet at hippocampus neurons er sammenvevd tvers langs septotemporal akse hippocampus4, en av de første i vitro opptak av hippocampus neuronal aktivitet var oppnådd5. Likheten av parameterne nevrofysiologiske eller neurostructural av neurons under i vivo og i vitro forhold er fortsatt gjenstand for noen debatt6, men i 1975, Schwartzkroin7 indikerte at de basale egenskaper av neurons opprettholdes i vitro og den høyfrekvente stimulering (dvs. tetanization) afferente i hippocampus formasjonen induserer en langvarig tilrettelegging av synaptic potensialer8. Elektrofysiologiske opptak av neuronal aktivitet i vitro kraftig utvidet studiet av cellulære mekanismer for aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet9,10, som hadde blitt oppdaget i 1973 av Bliss et al. 11 i vivo eksperimenter med kaniner.
Studiet av neuronal aktivitet eller signalnettverk trasé i hjernen skiver, og særlig i akutt hippocampus skiver, er nå et standardverktøy. Men overraskende, har i vitro eksperimenter ennå å bli standardisert, som dokumentert av flere tilnærminger som fortsatt eksisterer og vedlikehold av akutt hippocampus skiver. Reid et al. (1988) 12 gjennomgått metodiske utfordringer for vedlikehold av akutt hjernen sektorer i ulike typer skive kamre og valg av bading medium, pH, temperatur og oksygen nivå. Disse parametrene er fortsatt vanskelig å kontrollere i innspillingen kammer på grunn av skreddersydde elementer av i vitro skive-opptak oppsett. Publikasjoner kan bli funnet som kan bidra til å overvinne noen metodiske utfordringer og som beskriver nye typer neddykking skive chambers, som en interstitiell 3D microperfusion system13, et kammer med forbedret laminær strømning og oksygen Angi14, et system med datastyrt temperatur kontroll15og en multi kammer innspilling system16. Siden disse rommene ikke er lett å bygge, stole de fleste forskere på kommersielt tilgjengelig skive kamre. Disse rommene kan monteres på et mikroskop system, slik at for kombinasjonen av electrophysiology og fluorescens imaging17,18,19. Siden disse rommene holde hjernen skiver neddykket i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), må en høy flow rate i buffer løsning opprettholdes, øke bekostning av medikament programmet. Dette har vi innarbeidet en resirkulering perfusjon system med strøm-carbogenation som gir tilstrekkelig stabilitet for langsiktig opptak av feltet potensialer i en neddykking skive kammer med et relativt lite aCSF volum. I tillegg oppsummert vi hvordan bruk av eksperimentell carbogenation/perfusjon systemet påvirker resultatet av aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet10 og hvordan hemming av eukaryote forlengelse faktor-2 kinase (eEF2K) modulerer synaptic overføring20.
Selv om grensesnittet skive kamre utstilling mer robust synaptic svar25,26,27,28, gir neddykking chambers ekstra praktisk for patch-klemme opptak og fluorescens bildebehandling. Derfor har vi beskrevet flere aspekter av potensielle feltopptak i akutt hippocampus skiver med en kommersiell neddykking skive kammer som kan enkelt utvides til avbilding av fluorescens sonder neurons…
The authors have nothing to disclose.
Ww gjennomført, analysert, og designet eksperimenter og skrev manuskriptet. D.X. og C.P. assistert figur forberedelse og gjennomført eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NSFC (31320103906) og 111 Project (B16013) TB
Reagents required | |||
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
Tools and materials for dissection | |||
Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
Electrophysiology equipment and materials | |||
Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
thermostatic water bath | Zhongcheng Yiqi,China | HH-1 | |
4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02mm |
tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
lens cleaning paper | Kodak | ||
50 ml conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |