Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt in einem kleinen Volumen der recycelten Puffer und methodischen Aspekten der Aufnahme aktivitätsabhängige synaptische Plastizität in getauchten akute hippocampal Scheiben.
Abstract
Obwohl Experimente an Hirnschnitten seit 1951 im Einsatz gewesen, noch Probleme, die die Wahrscheinlichkeit, dass eine stabile und erfolgreiche Analyse der synaptischen Übertragung Modulation bei potenziellen oder intrazellulären Feldaufnahmen zu reduzieren. Dieses Manuskript beschreibt methodische Aspekte, die bei der Verbesserung der experimenteller Bedingungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten und zum Aufzeichnen von Feld exzitatorischen postsynaptischen Potenziale in einer handelsüblichen untertauchen Kammer hilfreich sein könnten mit einem Abfluss-Carbogenation. Die Abfluss-Carbogenation hilft, um den Sauerstoffgehalt in Experimenten zu stabilisieren, die verlassen sich auf das recycling von einem kleinen Puffer Reservoir zur Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Droge Experimente. Darüber hinaus präsentiert das Manuskript repräsentative Experimente, die die Auswirkungen von verschiedenen Carbogenation-Modi und Stimulation Paradigmen auf die aktivitätsabhängige synaptische Plastizität der synaptischen Übertragung untersuchen.
Introduction
1951 wurden die ersten gemeldeten akuten Gehirn Slice Experimente durchgeführt1. 1971, nach erfolgreichen in-vitro- Aufnahmen von Piriform Rinde2,3 und die Entdeckung, dass hippocampale Neuronen quer entlang der Septotemporal Achse des Hippocampus4, eines miteinander der in-vitro- Ersteinspielungen von hippocampal neuronalen Aktivität erreicht5war. Die Ähnlichkeit der neurophysiologischen oder Neurostructural Parameter der Neuronen in Vivo und in Vitro Bedingungen sind noch Gegenstand der Debatte6, aber im Jahr 1975, Schwartzkroin7 darauf hingewiesen, dass die basale Eigenschaften der Neuronen werden in Vitro beibehalten und die Hochfrequenz-Stimulation (z.B. Tetanization) der Afferenzen in der hippocampal Bildung induziert eine lang anhaltende Erleichterung der synaptischen Potentiale8. Elektrophysiologische Aufzeichnung von neuronaler Aktivität in Vitro stark erweitert die Studie der zellulären Mechanismen aktivitätsabhängige synaptische Plastizität9,10, 1973 von Bliss entdeckt worden war Et al. 11 in in Vivo Experimente mit Kaninchen.
Die Untersuchung von neuronaler Aktivität oder Signalwege in Gehirnscheiben und besonders in akuten hippocampal Scheiben, ist jetzt ein Standardwerkzeug. Jedoch schon überraschend, in-vitro- Experimente standardisiert werden, wie durch die mehrere Ansätze, die für die Erstellung und Pflege von akuten hippocampal Scheiben bestehen. Reid Et al. (1988) 12 überprüft die methodischen Herausforderungen für die Aufrechterhaltung der akuten Hirnschnitten in verschiedene Arten von Slice-Kammern und die Entscheidungen des Badens Medium, pH-Wert, Temperatur und Sauerstoff. Diese Parameter sind immer noch schwer zu kontrollieren in der Aufnahme Kammer durch die maßgefertigte Elemente der in-vitro- Slice-Aufnahme-Setups. Publikationen finden Sie, dass einige methodischen Herausforderungen und das überwinden helfen, neue Arten von Überflutung Slice Kammern, z. B. eine interstitielle 3D Microperfusion System13, eine Kammer mit verstärkten Laminar-Flow und Sauerstoff beschreiben könnte liefern Sie14, ein System mit computergesteuerten Temperatur Kontrolle15und ein Mehrkammer-Aufnahme System16. Da diese Kammern nicht leicht zu bauen sind, verlassen sich die meisten Wissenschaftler auf handelsüblichen Slice Kammern. Diese Räume können auf einem Mikroskopsystem, so dass die Kombination der Elektrophysiologie und Fluoreszenz-imaging-17,18,19montiert werden. Da diese Kammern die Gehirnscheiben in künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS) unter Wasser halten, muss eine hohe Durchflussrate der Pufferlösung beibehalten werden, erhöht die Kosten der Droge-Anwendung. Zu diesem Zweck haben wir ein Recyclingsystem Perfusion mit Abfluss-Carbogenation integriert, die genügend Stabilität für die Langzeitaufzeichnung von Feld-Potenziale in einer Überflutung Slice Kammer mit einem relativ kleinen ACFS Volume bereitstellt. Darüber hinaus zusammengefasst wir wie die Verwendung von diesem experimentellen Carbogenation/Perfusion System das Ergebnis der Tätigkeit-abhängige synaptische Plastizität10 auswirkt und wie Hemmung der eukaryotischen Dehnung Faktor-2 Kinase (eEF2K) moduliert synaptische Getriebe20.
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Protocol
Die Tiere wurden im Einklang mit den etablierten Standards der Pflege der Tiere und Verfahren des Institute of Brain Science und State Key Labor der medizinischen Neurobiologie der Fudan University, Shanghai, China aufrechterhalten.
1. Vorbereitung der Lösung
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
- Bereiten Sie den slicing Puffer (modifizierte Gey-Lösung): 92 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM Nahco33, 2, 5 mM 25 mM Glukose, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-Pyruvat, 10 mM MgSO4und 0,5 mM CaCl2.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 mit 1 M NaOH ohne Carbogenation.
- Speichern des Puffers bei 4 ° C.
Hinweis: Die Titration klärt die trübe Flüssigkeit. Die Osmolalität ist 305-310 mOsm. Die Carbogen21 enthält 5 % Kohlendioxid und 95 % Sauerstoff. - Vorbereiten der ACFS durch Verdünnung eine 10-fach-Stammlösung der ACFS, die keine Bikarbonat und Glucose, enthält geben eine endgültige Zusammensetzung des: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2und 1,25 mM KH2PO4.
- Fügen Sie Bikarbonat und Glukose um 10 mM Glukose und 26 mM Nahco33erreichen.
- Carbogenate der ACFS durch eine perforierte Silikonschlauch mit einem blockierten Ende sofort nach dem Hinzufügen der Nahco3-3.
- Messen Sie den pH-Wert während der Carbogenating (pH 7,3-7,4).
Hinweis: Die Pufferkapazität kann leicht durch die Veränderung der Menge an Nahco33angepasst werden. Da die daraus resultierenden pH-Wert temperaturabhängig ist, ist es notwendig, den daraus resultierenden pH-Wert während der Carbogenating bei der Arbeitstemperatur (z. B. 30 ° C) zu überprüfen.
2. Vorbereitung des akuten Hippocampal Scheiben
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
- Legen Sie ein Slice-Holding-Netz in eine Inkubation Kammer für akute Gehirnscheiben, füllen Sie die Kammer mit ACFS und Carbogenate (4-6 L/h) für mindestens 30 min22 bei 28-30 ° C.
- Cool die chirurgischen Instrumente bis auf 2 bis 4 ° C.
- Ort ein Becherglas gefüllt mit kalt- und Carbogenated schneiden Puffer (2 bis 4 ° C), in ein Eis-Wasser-Gemisch, in der Nähe der Vibratome beibehalten.
- Ratten oder Mäusen zu betäuben, bis die Hornhaut Reflexe (30-50 s) verschwinden mit Isofluran indem man 500 µL einer 2 L-Glas-Glas oder 12,5 µL in einem 50 mL-Tube.
- Isolieren des Gehirns mit einer Methode beschrieben und dargestellt im Detail in den Publikationen der Mathis Et al. (2011) 23 und Yuanxiang Et al. (2014) 24.
- Cool das Gehirn 2-4 ° c in einem eiskalten slicing Puffer (für mindestens 2 min) vor das Kleinhirn sezieren und Trennung der Hemisphären.
- Verwenden Sie eine kalte chirurgischen Klinge, um ein Stück des dorsalen Cortex in einem Winkel von 70 ° entlang der dorsalen Kante jeder Hemisphäre25 quer Scheiben von den ventralen und den mittleren Teil des Hippocampus, zu untersuchen, wie in Abbildung 1C und E.
- Übertragen Sie mit einem kalten dental Zement Spachtel eine Halbkugel auf ein Stück Filterpapier kurz trocknen die erstellte Fläche (ca. 1-2 s).
- Montieren Sie die beiden Hemisphären mit frisch geschnittenen Oberflächen auf der eiskalten slicing-Plattform mit schnell wirkenden Klebstoff Leim; haben Sie die kaudalen Ende der Hemisphären Fläche die Rasierklinge (Abbildung 1D).
- Die Slice-Plattform in die Kühlkammer ein Vibratome und füllen Sie die Kammer mit dem slicing Puffer (2 bis 4 ° C). Carbogenate mit einem perforierten Silikonschlauch.
- 350 µm-Scheiben mit angemessenen Vibratome Einstellungen (z. B. Klinge Vorwärtsgeschwindigkeit: 1,2 mm/s, Klinge Amplitude: 1 mm).
- Isolieren die hippocampale Bildung aus dem Subiculum und dem entorhinalen Cortex mit zwei Injektion Kanülen (> 28 G) als Schere.
- Entfernen Sie die Luftblasen aus dem Slice-Holding-Netz der zuvor vorbereiteten Inkubation Kammer mit einer Pasteurpipette.
- Übertragen Sie die Scheiben, die gewisse Transparenz an das Stratum Pyramidale von der Schneid-Plattform auf dem Netz der Inkubation Kammer haben. Vermeiden Sie Falten, stretching, Überschneidungen und schweben durch Absaugen ACFS und die Scheibe in einem großen Mund Pasteurpipette.
Hinweis: Die ganze Prozedur (Schritt 2.5-2.14) kann 5-10 Minuten dauern; Daher ist es wichtig, die Temperatur der Pufferlösung im Laufe der Zeit weiterhin bei 4 ° c zu überprüfen - Inkubieren Sie die Scheiben bei 30 ° C für mindestens 1,5-2 h in der Inkubation Kammer und bieten Sie Carbogen bei 4-6 L/h.
Hinweis: Stellen Sie die Durchflussmenge des Carbogen zirkulieren den Puffer in den Inkubator, sondern verhindern, dass die Scheiben schweben.
(3) Änderungen der Carbogenation für das ACFS Recycling von kleinen Stauseen
- Fügen Sie einen 3-Wege-Rohr-Anschluss bis zum Ausfluss des recycling-Systems (Abbildung 2B).
- Anschließen Sie den mittleren Arm des 3-Wege-Rohr-Verbinder mit einem Carbogen Zuleitung und regulieren Sie die Durchflussmenge mit einem Luftstrom Meter (ca. 3-4 L/h, Abbildung 2D und Abbildung 4C).
- Fügen Sie einen zweiten Rohr 3-Wege-Connector auf den Zufluss des recycling-Systems. Schließen Sie den mittleren Arm an das Rohr mit Blick auf die Inline-Heizung, am Oberarm zu einem dünnen Silikonschlauch (10 cm Länge) und der Unterarm mit dem Zustrom Schlauch aus dem Reservoir (Tiefpass-Filter; Abbildung 4 ( C).
- Legen Sie den Schlauch Squeezer auf einen dünnen Silikonschlauch (OD: 2 mm) an einer Position entlang dem Rohr wo das Pulsieren der ACFS in der Slice-Kammer, erzeugt durch die peristaltischen Pumpe befindet sich an seinem Minimum.
Hinweis: Die Abfluss-Carbogenation (Abfluss-Carb.) Änderung verringert die Empfindlichkeit der Carbogenation Ebene, um die Lautstärke des ACFS Reservoirs, die Recyclingquote, ACFS und relative Rohr positioniert in kleinen ACFS Stauseen (< 50 mL; ( Abbildung 3). Bezüglich der Tiefpass-Filter reduziert eine bestimmte Menge an Luft in der dünnen Silikonschlauch das Pulsieren der ACFS Strömung; Daher sollte der Schlauch meist mit Luft befüllt werden.
4.Aufnahme synaptische Antworten in einer Überflutung Slice Kammer
Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien.
- Vorwärmen der ACFS Lösung in einem Wasserbad auf ca. 28-30 ° C (Dies verhindert Blasenbildung in der Aufnahme-Kammer).
- Starten Sie das recycling-System (4-5 mL/min) und aktivieren Sie die Inline-Heizung um das System für mindestens 1 h equilibrate.
- Weichen Sie ein kleines Stück Linsenreinigung Papier und eine Nylon-Netzgewebe für ein paar Minuten (Abbildung 4) auf eine u-förmige Platindraht in der Überflutung Slice Kammer fixiert.
- Entfernen Sie den u-förmigen Platindraht.
- Schalten Sie das recycling und legen Sie eine Scheibe auf der Linse Reinigungspapier.
- Sofort das Slice-Holding-Netz auf das Slice, schalten Sie die Pumpe, und lassen Sie die Scheibe für 30 min equilibrate ohne Eintauchen das Ziel in der ACFS.
- ACFS Borosilikat-Mikropipette (d. h. die Aufnahme-Elektrode) einfüllen (Tipp Widerstand: 1-2 MΩ, 1/3 mit ACFS gefüllt) und in die Pipette Halterung zu montieren.
- Die Isolierung des Metall Stimulationselektrode überprüfen, indem es in Nahco33 Lösung (> 40 mM). Verbinden Sie die Elektrode am Minuspol Ein Gleichspannungserzeuger (1-2 V, Pluspol: Silber oder Platin Draht), und beobachten Sie die Blasenbildung an der Spitze unter dem Mikroskop Dissektion (> 60 X Vergrößerung).
- Setzen die getesteten Epoxy-isolierte Wolfram Stimulationselektrode in den Manipulator-Halter und die Referenz Drähten in der Slice-Kammer.
- Fügen Sie eine zweite Referenzelektrode in die Kammer und schließen Sie es an die Referenz-Buchse des Headstage der Aufnahme-Elektrode (Abb. 4A).
- Klicken Sie in der Verstärker-Steuerungssoftware auf das Feld "Null Klammer-Modus" und fahren Sie durch Doppelklicken auf das Feld "Output gain Liste". Wählen Sie einen Gewinn von "100", doppelklicken Sie auf das "high-Pass Filter Listenfeld (Bessel)," wählen Sie "0,1 Hz", und doppelklicken Sie auf das "low Pass Filter Listenfeld (AC)" wählen Sie "3 kHz."
- Klicken Sie in der Recording-Software, die auf "Acquire | Protokoll zu öffnen." Wählen Sie eine Protokoll, die Einstellungen für episodische Stimulationen erlaubt hat und die Digitalisierung der verstärkten Potentiale bei 10-20 kHz für 50-100 ms und löst automatisch eine Reiz-Isolator 10 ms nach dem Start eine episodische Aufnahme.
- Legen Sie die Stimulation und Aufnahme Elektroden in Linie und Parallel zur Stratum Pyramidale, zum Beispiel (Abbildung 4B und Abbildung 5).
- Klicken Sie auf "erwerben | Bearbeiten Sie Protokoll"und wählen Sie die Registerkarte"Trigger"(im Popup-Fenster). Klicken Sie auf den "Trigger-Quelle" Feld und wählen Sie "Leertaste" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf "Record", um die Übernahme starten und beachten das Popup-Fenster mit einem Trigger-Taste.
- Klicken Sie in der Impuls-Isolator-Software auf das Feld "Voltage Control" und geben Sie "0". Klicken Sie auf den Button "Download". Klicken Sie im Fenster "recording-Software" und drücken Sie die Leertaste. Wiederholen Sie diesen Zyklus durch sequentiell Eingabe von Werten von 1 bis 8, z. B. bei 1 mV Schritten im Feld "Voltage Control".
- Korrelieren Sie die Stärke der Stimulation mit fEPSP-Hang-Werte und bestimmen Sie die Stimulation Kraft benötigt, um 40 % fEPSP-Steigung maximal. Klicken Sie auf "Voltage Control Box" und geben Sie den ermittelten Wert. Klicken Sie auf den Button "Download".
Hinweis: Ein Reiz-Isolator wird verwendet, um kurze Spannung oder Stromimpulse auf Gehirngewebe anwenden. Die biphasische Impulse haben 100 µs pro Phase. - Klicken Sie in der Aufzeichnungssoftware die Stopp-Taste und dann Menü "Acquire". Klicken Sie auf "Bearbeiten-Protokoll" und wählen Sie die Registerkarte "Trigger" im Popup-Fenster. Klicken Sie auf den Trigger Quellensammlung und wählen Sie "interner Timer" als Triggerquelle. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK". Klicken Sie auf der Record-Taste, die die automatische Aufzeichnung von Feld Potenziale beginnt alle 30 s, zum Beispiel. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp" nach 30-60 min.
- Klicken Sie im Menü "Acquire", klicken Sie auf "Open Protocol", wählen Sie das gewünschte Induktion Protokoll der synaptischen Plastizität, und klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "Record", um automatisch die hochfrequente Stimulation und Aufzeichnung zu aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp".
Hinweis: Bei Studien in Bezug auf synaptische Plastizität, wenden Sie eines der standard Induktion Paradigmen für Langzeitpotenzierung oder Langzeitdepression nach längerer Grundlinie Aufnahme. Repräsentative Beispiele für die resultierende Modulation des synaptischen Getriebes sind in Abbildung 7 und Abbildung 8dargestellt. - In der Aufzeichnungssoftware, klicken Sie auf "Acquire | Öffnen Sie Protokoll"und wählen Sie das gleiche Protokoll wie in Schritt 4.12. Klicken Sie auf "OK" und klicken Sie dann auf "Record." Laufen Sie automatisch potenzielle Feldaufnahmen für 2-4 h, zum Beispiel. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Stopp", um die Aufzeichnung zu beenden.
- Im Falle von pharmazeutischen Studien gelten die Verbindung direkt zu der ACFS Reservoir ist ständige Verbindung Verwaltung gewünscht (Abbildung 6).
5. Reinigung der Einrichtung und Hinweise
Hinweis: Siehe unten für allgemeine Tipps.
- Reinigen Sie das System wöchentlich durch das recycling von 10 % H2O2 für nicht mehr als 20 min, gefolgt vom Waschen mit entionisiertem H2O.
Hinweis: Ethanol ist nicht für die Reinigung empfohlen. Es empfiehlt sich ebenfalls nicht die Referenz Drähten und Ziel in H2O2einzutauchen. - Niedergeschlagene Salz auf der Oberfläche der Objektivlinse oder Kammer Umgebung mit 0,1 N HCl und dann Wasser zu entfernen.
- Waschen Sie Carbogen Bubbler in destilliertem Wasser oder 0,1 N HCl.
- Tauchen die Scheibe Inkubation Kammer 10 % H2O2 für 5 min einmal in der Woche und dann gründlich ausspülen der Inkubation Kammer mit entionisiertem H2O.
- Spülen Sie bei Metall Stimulation Elektroden die anregende Elektrodenspitze mit entionisiertem Wasser nach jedem Experiment und wischen Sie die anregende Elektrodenspitze mit einem Wattebausch, getränkt mit Ethanol, verbleibende Gewebe zu entfernen.
- Reduzieren Sie den Widerstand der kommerziellen Metall Stimulation Elektroden durch die Isolierung an der Spitze durch eine sorgfältige streichen mit Schleifpapier entfernen.
- Reduzieren Sie den Verlust von Carbogen aus der ACFS und recycling durch die Rohre durch den Austausch der Silikon-Schläuche mit Polytetrafluorethylen Röhren.
- Halten Sie die silberne Drähte der Aufnahme Elektrode und Bezugselektrode in Bleichmittel für mehrere Tage auf der Drahtoberfläche AgCl bilden.
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Representative Results
Im Abschnitt Protokoll beschrieben wir die Vorbereitung der akuten hippocampal Scheiben aus dem ventralen und mittleren Teil der hippocampalen Bildung (Abbildung 1) von männlichen C57BL/6 Mäusen und männliche Wistar-Ratten (5-8 Wochen). Die Position der Hemisphären auf der Aufschnittmaschine-Plattform hilft um sie stabil zu halten und beseitigt die Notwendigkeit der Stabilisierung mit Agar oder Agarose. Die Perfusion System selbst basiert auf einer peristaltischen Pumpe betrieben auf hohe Rotation, den erforderliche Durchfluss der Flüssigkeit zu geben. So erstellt die rasche Alterung der standard Rohre innerhalb der Pumpe ein wesentliches Problem, das wir überwanden mithilfe nicht-Silikon-Schläuche (ID: 1,02 mm). Der Unterdruck für den Abfluss entsteht auch durch zwei Parallel geschalteten Röhren, die einen Innendurchmesser von 2,79 mm haben. Diese beiden Rohre sind mit einer Kanüle in der Aufnahme Kammer ermöglicht das Absaugen der Flüssigkeit (Abb. 4A) verbunden. Die Carbogenation bei der ACFS im Behälter muss stabil sein über viele Stunden, die schwer zu erreichen mit Belüftung Steinen oder Rohre mit kleinen Poren sein kann. Da der Abfluss-Carbogenation nicht auf kleine Poren, die Carbogen Durchflussmenge über Zeit bleibt stabil (Abbildung 2) angewiesen ist. Wenn die Experimente mit einem kleinen ACFS Reservoir sind, hilft die Abfluss-Carbogenation um ein Gleichgewicht des gelösten Sauerstoffs (Abbildung 3) zu erreichen. Darüber hinaus minimiert es die Variabilität der Sauerstoffgehalt zwischen den Experimenten anhand einer veränderten Zufluss/Abfluss Rohr Position, die Anzahl der aktiven Poren auf die Carbogen Blase Rohre und die flüssige Recyclingquote.
Die Scheibe wird auf Linsenpapier erlauben einige Flüssigkeitsaustausch von unten (Abb. 4A) gelegt. Da die Slice-Kammer auf eine aufrechte Mikroskop montiert werden kann, die mit einem 40 X Objektiv ausgestattet ist, kann die Position der Elektroden gut kontrollierten (Abbildung 4B und Abbildung 5). Dies senkt die Variabilität der Experimente in der täglichen Arbeit.
Bestimmen Sie die Stimulation Kraft für die Basislinie Aufnahme des Feldes Potenzial, die Abhängigkeit der Größe des möglichen auf die Stärke der Stimulation ermittelt werden muss, durch die Aufnahme der fEPSPs in verschiedenen Stärken (Abbildung 5 ). Die Messung der Input-Output-Kennlinie schafft etwas Stress auf die Scheibe bei höheren Stimulation stärken. Somit ist ein weiterer Ansatz für eine Stimulation Stärke suchen, die nur eine positive Bevölkerung Spike-Komponente in der fEPSP-Zerfall (schwarze Pfeile in Abbildung 5)26evoziert.
Nach der Aufnahme einer stabile Basis für mindestens 30 min, kann Medikamentengabe beginnen. Hier haben wir ein Beispiel für die Auswirkungen der Inhibitor eEF2K auf synaptische Übertragung vorgestellt. Hemmung der eEF2K fördert die synaptische Übertragung(Abbildung 6),ein Effekt, der durch die Hemmung der p38 MAPK (Abb. 6B)20abgeschwächt wurde.
Aktivitätsabhängige synaptische Plastizität kann durch eine Vielzahl von Stimulation Paradigmen10induziert werden. Hier präsentierten wir repräsentative Experimente der synaptischen Plastizität, die basieren auf einer kontinuierlichen Abfolge von Reize bei 100 Hz und wiederholte Stimulationen bei 1 Hz über 15 min. Die resultierende Modulation des synaptischen Getriebes wurde in Abbildung 7 und Abbildung 8dargestellt. Darüber hinaus ist es in Abbildung 7 und Abbildung 8 gezeigt, dass die Stabilisierung der Sauerstoffgehalt der kleinen Puffer Reservoirs durch den Abfluss-Carbogenation (weiße Kreise, relative Sauerstoffgehalt bei 24-40 min in Abbildung 3) die LTP verbessert und LTD Induktion im Vergleich zu Experimenten mit Reservoir-Carbogenation nur (graue Kreise, Sauerstoffgehalt bei 7-24 min). Wir haben die Kombination von Abfluss-Carbogenation und Reservoir-Carbogenation (7-24 min) nicht getestet, weil wir ein experimentelles System mit niedriger und einfacher Carbogen interessiert waren. Der Stausee-Carbogenation ohne recycling (bis zu 7 min) das Grundniveau des Sauerstoffs in der ACFS Reservoir darstellt.
Abbildung 1: Positionierung der Gehirnhälften Quere Scheiben des Hippocampus mit einem Vibratome erhalten. (A) die hippocampale Bildung ist in einer seitlichen Ansicht der rechten Hemisphäre, in grün, in einem rekonstruierten Maus Gehirn Modell angegeben. (B) ein ventrale Ansicht der hippocampalen Bildung. (C) die rostral-kaudalen Ansicht zeigt einen Abschnitt der ventralen und mittleren Teil der hippocampalen Bildung für die rechte Hemisphäre in der Horizontalebene. Da verschiedene Regionen entlang der Septotemporal Achse des Hippocampus unterschiedliche Grade der Innervation und Funktion31,haben32, verschiedene Schnittwinkel erforderlich für quer Scheiben des dorsalen Hippocampus für Beispiel. Maßstabsleiste = 3 mm (horizontale weiße Linien). (D) das Foto zeigt die Hemisphären des einem Rattengehirn geklebt auf einer Vibratome Plattform. Maßstabsleiste = 6 mm. (E) die Skizze zeigt den Winkel zum Trimmen der dorsalen Rand des Kortex (obere Schema) des abgetrennten rechten Hemisphäre (gestrichelte schwarze Linie) und die Rotation (roter Pfeil), das Gehirn auf der erstellten Oberfläche auf der Schneid-Plattform zu kleben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Elemente des Carbogenation Systems für ACFS Stauseen unterhalb von 50 mL. (A) Standard Carbogenation Systeme mit (a) perforierte Rohre als Carbogen Blase Gerät; ein Rohr wurde durch mehrere Einstiche mit einem 250 µm Durchmesser Edelstahldraht durchbohrt. (B) Abfluss-Carbogenation durch (b) eine 3-Wege-Rohr-Verbinder (Innendurchmesser: 2 mm) oder (C) ein Ventil-Einheit, die hinteren Flüssigkeitsstrom mit hydrophober Filter verhindert.Die mittleren Arm von der 3-Wege-Rohr-Verbinder mit einem Carbogen Tank nach einem Manometer verbunden ist (Gasdruck: < 1 atm) und ein Durchflussmesser. Die restlichen Waffen sind innerhalb der ACFS Abfluss Rohr verbunden. Durchflussmesser (D) die Carbogen Durchfluss gesteuert. Während der Experimente werden ACFS Stauseen bei 28-30 ° c gehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Der Sauerstoffgehalt in 40 mL ACFS bei unterschiedlichen Bedingungen. Der Sauerstoffgehalt in den Stausee-Carbogenation (res-Carb.) und ACFS recycling stetig zurückgegangen (Grau-gefüllte Kreise, n = 3). Jedoch die Abfluss-Carbogenation (Abfluss-Carb.) während der ACFS recycling reduziert die Tropfen die Sauerstoff-Niveau, das Gleichgewicht am Ausgangswert erreicht (weiße gefüllte Kreise, n = 3). Ausgangswerte wurden mit Res-Carb gemessen. ohne ACFS recycling. Die vertikalen gepunkteten graue Linien kennzeichnen die Umstellung auf verschiedene Carbogenation Protokolle. Die Auswirkungen von RES-Carb mit recycling (7-24 min) und Abfluss-Carb. mit dem recycling (weiße Kreise, 24-40 min) auf die Induktion der LTP und LTD sind in Abbildung 7 und Abbildung 8dargestellt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM präsentiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Komponenten der Abfluss-Carbogenation für Experimente in einer Überflutung Slice Kammer. (A) Präsentation der Überflutung Slice Kammer. Die u-förmige Platindraht mit den Nylonfasern halten eine hippocampale Scheibe wird dargestellt. Eine kleine Kanüle, erstellen eine Spule um den Bereich der Silberdraht Endung zu erhöhen wurden die silbernen Drähten gewickelt. Stimulation Referenz Draht in den Abfluss Kammer gestellt, und die Aufnahme-Referenz war in der Hauptkammer. Halten die Bezugselektrode mögliche stabile flüssige Übungslevel, Aufnahme Referenz Draht durch ein Kunststoffrohr, indem man nur die "Unterwasser" Teil des Drahtes in den Puffer ausgesetzt isoliert werden kann. (B) die Hellfeld-Bild zeigt eine repräsentative akute hippocampal Scheibe und die Elektroden. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: dentate Gyrus; Sub: Subiculum; EG: entorhinalen Kortex. (C) der Schaltplan zeigt die Hauptkomponenten der Abfluss-Carbogenation, ohne Angabe der Durchflussmesser für die Carbogen und der peristaltischen Pumpe. Ein Tiefpass Filter kann direkt vor der Inline-Heizung, das Pulsieren der ACFS Strömung zu reduzieren platziert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Abhängigkeit der Bereich möglicher Form auf Anregung Stärke und die Position der Elektroden. (A) repräsentative Beispiele des Feldes, die Potenziale, evozierte in unterschiedlichen Abständen von den Stratum Pyramidale (str. (Pyr.) und Stimulation stärken dargestellt werden. Die horizontalen schwarzen Pfeile zeigen die positiven Quellkomponente Bevölkerung Spike im Feld möglicher Zerfall. Die positive Quellkomponente Bevölkerung Spike blieb ungefähr in der Mitte der Anstieg fEPSP Phase überhaupt getestet "in-Line" Elektrodenpositionen, außer dem einen, ganz in der Nähe der Zellkörper Schicht (e). (B) die Position der Quelle positiver Bestandteil der Bevölkerung Spike unterschiedlich aufgrund der Fehlstellung der Stimulation und Aufnahme Elektroden. Lac.: Stratum Lacunosum-Moleculare; Rad.: Stratum Radiatum; Pyr.: Stratum Pyramidale; REC: Aufzeichnung Elektrode; Stim.: Stimulationselektrode. Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Repräsentatives Beispiel für die Auswirkungen der Inhibitor eEF2K auf hippocampal synaptische Übertragung mit Abfluss-Carbogenation, mit dem recycling von einem kleinen ACFS Reservoir20 . Nach der Aufnahme von fEPSPs in 1 min Abständen für 20 min, wurde die eEF2K-Inhibitor A-484954 direkt an der ACFS Reservoir (horizontale Linie) hinzugefügt. Eine rasche Zunahme der synaptischen Übertragung war nachweisbar (weiße gefüllte Kreise). Wenn das Medikament nicht angewendet wurde, blieb der fEPSP-Piste im Laufe der Zeit der Aufnahme (Grau-gefüllte Kreise). (B) Anwendung der p38 MAPK Inhibitor (graue horizontale Linie) verhindert die eEF2K Inhibito-induzierte Steigerung der Feld-Potenziale. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM präsentiert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Vertreter Aufnahmen von aktivitätsabhängige Potenzierung der synaptischen Übertragung mit Abfluss-Carbogenation (Abfluss-Carb; weiße Kreise) und Reservoir-Carbogenation (res-Carb; schwarze Kreise), mit dem recycling von einem kleinen ACFS Reservoir. Die Potenzierung wurde nach dem Zeitpunkt 0 von 100 Hz/s-Bahn dreimal induziert (Tet.: Tetanization, hochfrequente Stimulation). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM Halterung vorgestellt: statistischer Vergleich von Gruppen pro Zeitpunkt; ungepaarten T-Test, nicht konsistent Standardabweichung vorausgesetzt. * p < 0,05.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : Abhängigkeit der Tätigkeit-abhängige Depression der synaptischen Übertragung auf Anregung Stärke und Carbogenation. (A) mit Reservoir-Carbogenation (res-Carb.) mit dem recycling von einem großen ACFS Volumen, evoziert eine 1 Hz Stimulation für 15 min bei 80 % der maximalen fEPSP-Neigung eine starke Depression der synaptischen Übertragung (weiße Kreise). Jedoch wurde, wie der repräsentativen fEPSP vor (schwarze Spur Spuren) und nach (rote Spur bei der 110th -min) LTD Induktion zeigen, der präsynaptischen Faser Volley (vertikale schwarzer Pfeil) stark reduziert. Dies ist ein Beispiel, die darauf hinweist, dass die elektrochemischen Prozesse an die Stimulationselektrode Schaden könnte die Afferenzen, verursacht eine Depression, die teilweise nicht auf LTD-bezogene Mechanismen angewiesen ist. Verringerung der Stärke der Stimulation auf 50 % der maximalen fEPSP-Hang induziert eine Depression der synaptischen Übertragung in einem geringeren Maße, aber ohne Änderung die präsynaptischen Faser volley (Grau-gefüllte Kreise). (B) LTD Induktion nicht hervorrufen, eine dauerhafte Depression fEPSP-Pisten in den Experimenten mit Reservoir-Carbogenation und das recycling von einem kleinen ACFS Reservoir (res-Carb; Grau gefüllte Quadrate). (C) die Abfluss-Carbogenation mit dem recycling von einem kleinen ACFS Reservoir verbessert das Ergebnis der LTD Induktion. Die Einsätze präsentieren repräsentative fEPSPs vor (schwarze Spuren) und nach (110th min, rote Spuren) LTD Induktion. Für die repräsentativen fEPSPs, die vertikale Skala Balken 1 mV, und die horizontale Skalierung Bars entsprechen 2 Ms. die Daten stammen aus akuten hippocampal Scheiben (350 µm) von 1 bis 2 Monate alten C57/BL 6 Mäusen und sind als Mittelwert ± SEM Klammern dargestellt : statistischer Vergleich von Gruppen pro Zeitpunkt; ungepaarten T-Test, nicht konsistent Standardabweichung vorausgesetzt. * p < 0,05, ns: nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl Schnittstelle Slice Kammern robuster synaptische Antworten25,26,27,28aufweisen, bieten untertauchen Kammern zusätzlichen Komfort für die Patch-Clamp-Aufnahme und Fluoreszenz Imaging. So haben wir beschrieben, verschiedene Aspekte der möglichen Feldaufnahmen in akuten hippocampal Scheiben mit einer kommerziellen untertauchen Slice-Kammer, die leicht auf die Darstellung der Fluoreszenz Sonden in Neuronen17,18ausgedehnt werden kann, 19. Neben der Scheibe Vorbereitung25stellt die Aufrechterhaltung eines konstanten Carbogen in der Aufnahme Kammer nach vielen Stunden ein Hindernis dar. Da Carbogen Niveau nur durch die erste Sättigung des Stausees ACFS steuerbar ist, sind Unterschiede in der Sauerstoffgehalt in der ACFS leicht laufende Experimente zu erhalten. So empfiehlt sich eine Sauerstoff-Messgerät, um die Fehlersuche zu beschleunigen und Anpassung der Bedingungen (z. B. Temperatur, Durchfluss Carbogen Carbogenation Werkzeuge und ACFS Recyclingquote) um mindestens 28 mg/L zu erreichen Sauerstoff in der ACFS Stausee am Stall Ebenen. Darüber hinaus kann die gängige Praxis, ändern Sie die Größe des Behälters ACFS für Droge-Anwendung Auswirkungen auf Feld Potenziale aufgrund von Unterschieden in ihrer Carbogen induzieren.
Die Verwendung von Abfluss-Carbogenation von einem kleinen recycling Puffervolumen verbessert das Ergebnis der Experimente synaptische Plastizität. Verbesserte Auflösung der Sauerstoff in der Flüssigkeit beruht auf der größeren Verhältnis zwischen die Kontaktfläche der Flüssigkeit und Carbogen. Darüber hinaus reduziert die Abfluss-Carbogenation die Lieferung von Carbogen erschöpft ACFS im ACFS Reservoir. Die Stabilität der Carbogenation könnte durch eine speziell entwickelte Venturi basierend auf dem Prinzip der Handelsprodukte29weiter verbessert werden.
Selbst mit der besten Stück Vorbereitung und Einrichtung Bedingungen ist es oft unvermeidbar, dass Feld Potentiale induziert werden können nicht, wenn isolierte Metall Stimulation Elektroden verwendet werden. Oft ist der Grund, dass die Isolierung beschädigt ist, durch Biegen oder Reinigung. Wie wir in den Methoden angedeutet habe, ist ein einfacher Ansatz, die Blasenbildung bei niedriger DC-Spannung zu überprüfen. Darüber hinaus hilft dieser Schritt reinigen der Spitze und die Impedanz der Stimulationselektrode zu reduzieren. Die Verwendung von Glaspipetten zur Stimulation ist üblich und hat den Vorteil, dass einen engeren Bereich der Faser-Stimulation. Oft ist es nicht möglich, einen maximale fEPSP Hang zu finden, wenn Glas Pipette Stimulation verwendet wird. Die Darstellung der positiven Quellkomponente Bevölkerung Spike in der fEPSP-Decay-Phase könnte dann die Stimulation Stärke23anpassen verwendet werden.
Kann Publikation bezüglich der Induktion von aktivitätsabhängige synaptische Plastizität und die Einbeziehung der verschiedenen Signalwege abhängig von der angewandten Induktion-Protokoll verfügbar10. Allerdings könnte die hochfrequente Stimulation aus methodischer Sicht deutliche Artefakte verursachen, die die erfolgreiche Induktion der synaptischen Plastizität verhindern könnte. Eine wiederholte 100 Hz/1 s Stimulation könnte dazu führen, dass Polarisation der Elektroden Stimulation oder elektrochemischen Reaktionen30, was in der Depression der synaptischen Übertragung wegen um zu Schäden an den Afferenzen (siehe Abbildung 8 für ein Beispiel). Um die elektrochemischen Prozesse zu minimieren, biphasische Stimulation Impulse und eine Stimulation macht nicht mehr als 2 V für Ausgangsmessungen aufgezeichnet werden empfohlen.
Zusammenfassend lässt sich sagen hilft Abfluss-Carbogenation, um den Sauerstoffgehalt in den Experimenten zu stabilisieren, die auf das recycling von kleinen Puffer Reservoir, Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Droge Experimente verlassen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.
Acknowledgments
W.W durchgeführt, analysiert, und die Experimente entworfen und schrieb das Manuskript. D.X. und C.P Abbildung Vorbereitung unterstützt und die Experimente durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt von NSFC (31320103906) und 111-Projekt (B16013), T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
