Summary
Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.
Abstract
Anche se gli esperimenti su fettine di cervello sono stati in uso fin dal 1951, permangono problemi che riducono la probabilità di realizzare un'analisi stabile e di successo della modulazione della trasmissione sinaptica durante l'esecuzione di registrazioni sul campo potenziale o intracellulare. Questo manoscritto descrive aspetti metodologici che potrebbero essere utili nel migliorare le condizioni sperimentali per la manutenzione delle fette del cervello acuto e per la registrazione di potenziali postsinaptici eccitatori di campo in una camera di immersione disponibili in commercio con un'unità di deflusso-carbogenation. Il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni per migliorare l'efficienza dei costi degli esperimenti di droga. Inoltre, il manoscritto presenta esperimenti rappresentativi che esaminano gli effetti di carbogenation diverse modalità e paradigmi di stimolazione sulla plasticità sinaptica attività-dipendente della trasmissione sinaptica.
Introduction
Nel 1951, gli esperimenti di fetta di primo-ha segnalato il cervello acuto erano condotti1. Nel 1971, dopo il successo in vitro registrazioni da piriform corteccia2,3 e la scoperta che i neuroni hippocampal sono interconnessi trasversalmente lungo l'asse di septotemporal di ippocampo4, uno del prime registrazioni in vitro dell'attività di un neurone hippocampal era raggiunto5. La somiglianza dei parametri neurofisiologici o neurostructural dei neuroni in condizioni in vivo e in vitro sono ancora oggetto di qualche dibattito6, ma nel 1975, Schwartzkroin7 ha indicato che il basale Proprietà dei neuroni vengono mantenuti in vitro e che la stimolazione ad alta frequenza (cioè, tetanization) delle afferenze nella formazione hippocampal induce una facilitazione di lunga durata di potenziali sinaptici8. Elettrofisiologici registrazione dell'attività neuronale in vitro notevolmente ampliato lo studio dei meccanismi cellulari di plasticità sinaptica attività-dipendente9,10, che era stata scoperta nel 1973 da Bliss et al. 11 in vivo gli esperimenti con i conigli.
Lo studio di attività neuronale o segnalazione percorsi nelle fette del cervello e soprattutto in fettine ippocampali acute, è ora uno strumento standard. Tuttavia, sorprendentemente, gli esperimenti in vitro hanno ancora essere standardizzati, come testimoniano i diversi approcci che ancora esistono per la preparazione e la manutenzione di fettine ippocampali acute. Reid et al. (1988) 12 recensione le sfide metodologiche per la manutenzione delle fettine di cervello acuto in diversi tipi di fetta alloggiamenti e le scelte di livello medio, pH, temperatura e ossigeno di balneazione. Questi parametri sono ancora difficili da controllare nella camera di registrazione a causa di elementi su misura in vitro fetta-registrazione Setup. Pubblicazioni possono essere trovati che potrebbe contribuire a superare alcune delle sfide metodologiche e che descrivono nuovi tipi di alloggiamenti di fetta di sommersione, come un sistema interstiziale 3D microperfusion13, una camera con maggiore flusso laminare e ossigeno fornire un sistema di registrazione multi-camera16, un sistema con controllo di temperatura computerizzato15e14. Dal momento che queste camere non sono facili da costruire, maggior parte degli scienziati si basano su chambers fetta commercialmente disponibili. Questi alloggiamenti possono essere montati su un sistema di microscopio, consentendo in tal modo la combinazione di elettrofisiologia e fluorescenza imaging17,18,19. Poiché questi alloggiamenti mantenere le fette di cervello immerse in liquido cerebrospinale artificiale (aCSF), un'alta portata della soluzione tampone deve essere mantenuto, aumentando la spesa dell'applicazione della droga. A tal fine, abbiamo incorporato un sistema di perfusione riciclaggio con deflusso-carbogenation che fornisce una stabilità sufficiente per la registrazione a lungo termine dei potenziali di campo in una camera di fetta di sommersione usando un volume relativamente piccolo aCSF. Inoltre, abbiamo riassunto come l'uso di questo sistema sperimentale carbogenation/aspersione influenza il risultato della plasticità sinaptica attività-dipendente10 e come inibizione della chinasi di allungamento eucariotico factor-2 (eEF2K) modula sinaptica trasmissione20.
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Protocol
Gli animali sono stati mantenuti in conformità con le norme stabilite di cura degli animali e le procedure dei istituti di scienza del cervello e stato chiave laboratorio di medici Neurobiologia della Fudan University, Shanghai, Cina.
1. soluzione preparazione
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
- Preparare il tampone per affettare (soluzione di Gey modificate): 92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, glucosio di 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm Na+-piruvato, 10mm MgSO4e 0,5 mM CaCl2.
- Regolare il pH a 7,6 utilizzando 1 M NaOH senza carbogenation.
- Conservare il tampone a 4 ° C.
Nota: La titolazione chiarisce il liquido torbido. L'osmolalità è 305-310 mOsm. Il carbogen21 contiene 5% di anidride carbonica e il 95% di ossigeno. - Preparare il aCSF diluendo un 10 x soluzione madre di aCSF che non contiene bicarbonato e glucosio, dando una composizione finale di: 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2mm MgCl2e 1,25 mM KH2PO4.
- Aggiungere il bicarbonato e glucosio per raggiungere 10 mM glucosio e 26mm NaHCO3.
- Carbogenate aCSF attraverso un tubo di silicone perforato con un fine bloccato immediatamente dopo l'aggiunta di NaHCO3.
- Misurare il pH mentre carbogenating (pH 7,3-7,4).
Nota: La capacità di buffer può essere regolato leggermente alterando la quantità di NaHCO3. Poiché il pH risultante è temperatura-dipendente, è necessario controllare il pH risultante mentre carbogenating alla temperatura di esercizio (ad es., 30 ° C).
2. preparazione di fettine ippocampali Acute
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
- Posizionare una mesh di fetta-tenuta in una camera di incubazione per fette del cervello acuto, riempire la camera con aCSF e carbogenate (4-6 L/h) per almeno 30 min22 a 28-30 ° C.
- Raffreddare gli strumenti chirurgici fino a 2-4 ° C.
- Posizionare un bicchiere di vetro riempito con carbogenated affettare buffer (2-4 ° C), mantenuto in una miscela di ghiaccio/acqua, nei pressi del vibratome e fredda.
- Anestetizzare ratti o topi fino a far scompaiono i riflessi corneali (30-50 s) utilizzando isoflurano prendendo 500 µ l in un barattolo di vetro 2L o 12,5 µ l in un tubo da 50 mL.
- Isolare il cervello utilizzando un metodo descritto e visualizzato in dettaglio nelle pubblicazioni di Mathis et al. (2011) 23 e Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Raffreddare il cervello fino a 2-4 ° C in un buffer per affettare ghiacciato (per almeno 2 min) prima il cervelletto di dissezione e separazione degli emisferi.
- Utilizzare una lama chirurgica fredda per sezionare un pezzo di corteccia dorsale ad un angolo di 70° lungo il bordo dorsale di ogni emisfero25 per ottenere sezioni trasversali dalle ventrali e la parte intermedia dell'ippocampo, come illustrato nella Figura 1C ed E.
- Con una spatola di freddo cemento dentale, trasferire un emisfero a un pezzo di carta da filtro asciugare brevemente la superficie creata (1-2 s).
- Montare i due emisferi con superfici appena tagliate sulla piattaforma ghiacciata per affettare utilizzando colla adesiva ad azione rapida; hanno l'estremità caudale del viso emisferi la lama di rasoio (Figura 1D).
- Posizionare la piattaforma per affettare nella camera di raffreddamento di un vibratomo e riempire quello alloggiamento con il buffer per affettare (2-4 ° C). Carbogenate utilizzando un tubo di silicone perforato.
- Tagliare 350 µm fette utilizzando le impostazioni adeguate vibratome (ad es., velocità di avanzamento lama: 1,2 mm/s, ampiezza di lama: 1 mm).
- Isolare la formazione hippocampal dal subiculum e le cortecce entorinale utilizzando due cannule di iniezione (> 28 G) come forbici.
- Rimuovere le bolle dalla mesh fetta-tenuta della camera di incubazione precedentemente preparato usando una pipetta Pasteur.
- Trasferire le fette che hanno certa trasparenza presso il corneum pyramidale dalla piattaforma per affettare sulle maglie della camera umida. Evitare qualsiasi pieghevole, stretching, sovrapposti e galleggianti aspirando aCSF e la fetta in una pipetta di Pasteur bocca grande.
Nota: L'intera procedura (passo 2.5-2.14) può prendere 5-10 min; Pertanto, è importante controllare la temperatura della soluzione tampone nel tempo a mantenerla a 4 ° C. - Incubare le fette a 30 ° C per almeno 1,5-2 h nella camera di incubazione e fornire carbogen a 4-6 L/h.
Nota: Regolare la portata di carbogen a circolare il buffer in incubatrice, ma evitare le fette dal galleggiante.
3. le modifiche di Carbogenation per il aCSF riciclaggio dei piccoli serbatoi
- Aggiungere un connettore 3 vie tubo per il deflusso del sistema di riciclaggio (Figura 2B).
- Collegare il braccio medio del connettore 3 vie tubo con un tubo di alimentazione di carbogen e regolare la portata con un misuratore massa aria (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).
- Aggiungere un secondo connettore 3 vie tubo per l'afflusso del sistema di riciclaggio. Collegare il braccio medio al tubo di fronte la stufa in linea, parte superiore del braccio di un tubo sottile in silicone (10 cm di lunghezza) e abbassare il braccio per il tubo di afflusso dal serbatoio (filtro passa-basso; Figura 4 C).
- Posizionare un strizzatubo su un tubo sottile in silicone (OD: 2 mm) in una posizione lungo il tubo dove la pulsazione della aCSF nella camera della fetta, generata dalla pompa peristaltica, è al suo minimo.
Nota: Il deflusso-carbogenation (deflusso-carb.) modifica riduce la sensibilità del livello carbogenation al volume del serbatoio aCSF, aCSF tasso di riciclaggio, e relativo tubo posizioni all'interno di serbatoi di piccole aCSF (< 50 mL; Figura 3). Per quanto riguarda il filtro passa-basso, una certa quantità di aria nel tubo di silicio sottile riduce le pulsazioni del flusso aCSF; così, il tubo dovrebbe essere riempito per la maggior parte con aria.
4.Registrazione di risposte sinaptiche in una camera di fetta di sommersione
Nota: Vedere la tabella dei materiali.
- Pre-riscaldare la soluzione aCSF in un bagno di acqua a circa 28-30 ° C (questo impedirà la formazione di bolle nella camera di registrazione).
- Avviare il sistema di riciclaggio (4-5 mL/min) e attivare il riscaldatore inline per equilibrare il sistema per almeno 1 h.
- PRESOAK un piccolo pezzo di lente pulizia carta e una maglia di nylon fissato su un filo di platino a forma di U, nella camera di fetta di sommersione per pochi minuti (Figura 4).
- Rimuovere il filo di platino a forma di U.
- Spegnere il riciclaggio e mettete una fetta sulla lente carta di pulizia.
- Posizionare immediatamente la mesh di fetta-tenuta sopra la fetta, accendere la pompa e lasciare che la fetta equilibrare per 30 min senza immergendo l'obiettivo nel aCSF.
- Riempire la micropipetta borosilicato (cioè, l'elettrodo di registrazione) con aCSF (resistenza di punta: 1-2 MΩ, riempito con aCSF 1/3) e montarlo nel supporto pipetta.
- Verificare l'isolamento dell'elettrodo metallo stimolazione inserendolo nella soluzione di NaHCO3 (> 40 mM). Collegare l'elettrodo al polo negativo di un generatore di tensione DC (1-2 V, polo positivo: filo d'argento o platino) e osservare la formazione di bolle sulla punta sotto un microscopio di dissezione (> ingrandimento 60x).
- Il riferimento cavi nel vano di fetta e posizionare l'elettrodo di stimolazione di testata a resina epossidica-isolato tungsteno nel supporto manipolatore.
- Aggiungere un secondo elettrodo di riferimento alla camera e collegarlo alla presa di riferimento del headstage dell'elettrodo di registrazione (Figura 4A).
- L'amplificatore software di controllo, fare clic sulla casella "modalità zero morsetto" e procedere facendo doppio clic la casella "elenco di guadagno di output". Scegliere un guadagno di "100", fare doppio clic su "passa-alto filtro casella di riepilogo (Bessel)," scegliere "0,1 Hz" e fare doppio clic su "passa-basso filtro casella di riepilogo (AC)" per scegliere "3kHz."
- Nel software di registrazione, fare clic sulla su "Acquire | Aprire il protocollo". Scegliere un protocollo che dispone di impostazioni che consentono per stimolazioni episodiche e la digitalizzazione dei potenziali amplificati a 10-20 kHz per 50-100 ms e che si innesca automaticamente un isolatore di stimolo 10 ms dopo l'inizio di una registrazione episodica.
- Posizionare la stimolazione ed elettrodi di registrazione in linea e parallela il corneum pyramidale, ad esempio (Figura 4B e Figura 5).
- Fare clic su "acquisire | Modificare il protocollo"e scegliere la scheda"trigger"(nella finestra pop-up). Fare clic sulla casella "fonte di innesco" e scegliere "barra spaziatrice" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "record" per avviare l'acquisizione e notare la finestra popup con un pulsante di trigger.
- Nel software di isolatore di stimolo, fare clic sulla casella "controllo tensione" e inserire "0". Clicca sul pulsante "Scarica". Fare clic sulla finestra "software di registrazione" e premere la barra spaziatrice. Ripetere questo ciclo immettendo valori in sequenza da 1 a 8, ad esempio, a passi di mV 1 nella casella "controllo di tensione".
- Correlare l'intensità di stimolazione con valori fEPSP-pendio e determinare la forza di stimolazione necessaria per ottenere il 40% della fEPSP-pendenza massima. Fare clic sulla casella"controllo tensione" e immettere il valore determinato. Clicca sul pulsante "Scarica".
Nota: Un isolatore di stimolo viene utilizzato per applicare tensione breve o impulsi di corrente al tessuto cerebrale. Gli impulsi bifasici possono avere 100 µs per fase. - Nel software di registrazione, fare clic sul pulsante stop e poi il menu di "Acquisire". Clicca su "Edit protocollo" e scegliere la scheda "grilletto" nella finestra pop-up. Fare clic sulla casella origine trigger e abbiamo scelto il "timer interno" come la fonte di innesco. Fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante record che inizia la registrazione automatica dei potenziali di campo ogni 30 s, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" dopo 30-60 min.
- Fare clic sul menu "Acquisire", fare clic su "Open Protocol," Scegli il protocollo di induzione desiderata della plasticità sinaptica e fare clic sul pulsante "OK". Fare clic sul pulsante "Registra" per attivare automaticamente la stimolazione ad alta frequenza e la registrazione. Fare clic sul pulsante "stop".
Nota: Nel caso di studi relativi alla plasticità sinaptica, applicare uno dei paradigmi induzione standard per potenziamento a lungo termine o la depressione a lungo termine dopo la registrazione prolungata della linea di base. Esempi rappresentativi della conseguente modulazione della trasmissione sinaptica sono raffigurati nella Figura 7 e Figura 8. - Nel software di registrazione, fare clic su "Acquire | Aprire il protocollo"e scegliere il protocollo stesso come descritto al punto 4.12. Fare clic sul pulsante "OK" e quindi fare clic su "Registra". Mantenere automaticamente in esecuzione le registrazioni potenziali del campo per 2-4 h, per esempio. Fare clic sul pulsante "stop" per terminare la registrazione.
- Nel caso di studi farmaceutici, applicare il composto direttamente per il aCSF serbatoio se amministrazione permanente composto è desiderato (Figura 6).
5. pulizia del Setup e suggerimenti
Nota: Vedi sotto per i consigli generali.
- Pulire ogni settimana il sistema di riciclaggio 10% H2O2 per non più di 20 minuti, seguito da lavaggio con deionizzata H2O.
Nota: Etanolo non è raccomandato per la pulizia. Non allo stesso modo si consiglia di immergere i fili di riferimento e obiettivo in H2O2. - Rimuovere il sale precipitato sulla superficie della lente dell'obiettivo o dintorni di camera con acqua e poi 0,1 N HCl.
- Lavare la vasca di gorgogliamento di carbogen in acqua distillata o 0,1 N HCl.
- Immergere la camera di incubazione fetta 10% H2O2 per 5 min una volta a settimana e poi risciacquare accuratamente la camera di incubazione con deionizzata H2O.
- In caso di elettrodi di stimolazione del metallo, risciacquare la punta dell'elettrodo stimolante con acqua deionizzata dopo ogni esperimento e strofinare delicatamente la punta dell'elettrodo stimolante con un batuffolo di cotone imbevuto con etanolo per rimuovere il tessuto residuo.
- Ridurre la resistenza di elettrodi di stimolazione del metallo commerciale rimuovendo l'isolamento sulla punta attraverso un'attenta sfiora con carta vetrata.
- Ridurre la perdita di carbogen dal aCSF mentre riciclaggio attraverso i tubi, sostituendo i tubi in silicone con tubi di politetrafluoroetilene.
- Tenere i fili d'argento dell'elettrodo di registrazione e dell'elettrodo di riferimento in candeggina per diversi giorni per formare AgCl sulla superficie del filo.
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Representative Results
Nella sezione protocollo, abbiamo descritto la preparazione di fettine ippocampali acute dalla parte ventrale e intermedi della formazione hippocampal (Figura 1) del maschio C57BL/6 topi e ratti maschii di Wistar (5-8 settimane). La posizione degli emisferi sulla piattaforma affettatrice aiuta a tenerli stabili ed elimina la necessità di stabilizzazione con agar o dell'agarosi. Il sistema di perfusione stesso è basato su una pompa peristaltica operata su alta rotazione per dare la necessaria portata del liquido. Così, l'invecchiamento rapido di tubi standard all'interno della pompa ha creato un problema notevole che abbiamo superato utilizzando tubi non-silicio (ID: 1,02 mm). La pressione negativa per il deflusso è anche creata da due tubi collegati in parallelo che hanno un diametro interno di 2,79 mm. Questi due tubi sono collegati a una cannula nella camera di registrazione per consentire l'aspirazione del liquido (Figura 4A). Il tasso di carbogenation di aCSF nel serbatoio deve essere stabile sul molte ore, che possono essere difficile da realizzare utilizzando pietre di ventilazione o tubi con pori piccoli. Poiché il deflusso-carbogenation non si basa su piccoli pori, il tasso di flusso di carbogen sul tempo rimane stabile (Figura 2). Se gli esperimenti vengono condotti con un serbatoio piccolo aCSF, il deflusso-carbogenation aiuta a raggiungere un equilibrio dell'ossigeno disciolto (Figura 3). Inoltre, riduce al minimo la variabilità del livello di ossigeno tra gli esperimenti sulla base un'alterato afflusso/deflusso tubo posizione, il numero di pori attivi presso i tubi di bolla di carbogen e il tasso di riciclaggio liquido.
La fetta è posto sulla carta per lenti per consentire qualche scambio liquido dal basso (Figura 4A). Poiché la camera di fetta può essere montata su un microscopio dritto che è dotato di un obiettivo 40x, la posizione degli elettrodi può essere ben controllato (Figura 4B e Figura 5). Ciò riduce ulteriormente la variabilità degli esperimenti nel lavoro quotidiano.
Per determinare la forza di stimolazione necessaria per la registrazione di base del campo potenziale, che la dipendenza della dimensione potenziale del campo al momento la forza di stimolazione deve essere determinata mediante la registrazione di EPSPS presso punti di forza differenti di stimolazione (Figura 5 ). La misura della caratteristica ingresso-uscita crea alcuni stress sulla fetta a maggiore intensità di stimolazione. Così, un altro approccio è per la ricerca di una forza di stimolazione che evoca solo una componente di spike popolazione positiva nel fEPSP-decadimento (frecce nere in Figura 5)26.
Dopo aver registrato una linea di base stabile per almeno 30 min, somministrazione di droga può cominciare. Qui, abbiamo presentato un esempio degli effetti di un inibitore di eEF2K sulla trasmissione sinaptica. L'inibizione del eEF2K promuove la trasmissione sinaptica (Figura 6A), un effetto che è stato attenuato tramite l'inibizione della p38 MAPK (Figura 6B)20.
Plasticità sinaptica attività-dipendente può essere indotta da una varietà di stimolazione paradigmi10. Qui, abbiamo presentato esperimenti rappresentativi della plasticità sinaptica che si basano su una sequenza continua di stimoli a 100 Hz e su stimolazioni ripetute a 1 Hz oltre 15 min. La modulazione della trasmissione sinaptica risultante è stata raffigurata in Figura 7 e Figura 8. Inoltre, è mostrato in Figura 7 e Figura 8 che la stabilizzazione del livello di ossigeno dei serbatoi di buffer di piccole dimensioni di deflusso-carbogenation (cerchi bianchi, livello di ossigeno relativa a 24-40 min in Figura 3) migliorata la LTP e LTD induzione rispetto ad esperimenti con serbatoio-carbogenation solo (cerchi grigi, livello di ossigeno al minuto 7-24). Non abbiamo provato la combinazione di deflusso-carbogenation e serbatoio-carbogenation (7-24 min) perché eravamo interessati a creare un sistema sperimentale con l'uso di carbogen inferiore e più semplice. Il serbatoio-carbogenation senza riciclo (fino a 7 min) rappresenta il livello basale di ossigeno nel serbatoio aCSF.
Figura 1: Posizionamento gli emisferi del cervello per ottenere sezioni trasversali dell'ippocampo utilizzando una vibratome. (A) la formazione hippocampal è indicato in una vista laterale dell'emisfero destro, nel verde, all'interno di un modello di cervello di topo ricostruito. (B), un punto di vista ventrale della formazione hippocampal. (C) la vista rostro-caudale dimostra una sezione della parte ventrale e intermedi della formazione hippocampal per l'emisfero destro al piano orizzontale. Dal momento che diverse regioni lungo l'asse di septotemporal dell'ippocampo hanno diversi gradi di innervazione e funzione31,32, un angolo di taglio diverso è necessaria per le sezioni trasversali dell'ippocampo dorsale, per esempio. Barra della scala = 3 mm (linee bianche orizzontali). (D) la foto Mostra gli emisferi di un cervello di ratto incollati su una piattaforma del vibratome. Barra della scala = mm. 6 (E) il disegno raffigura l'angolo per tagliare il bordo dorsale della corteccia (schema superiore) l'emisfero destro separato (linea nera tratteggiata) e la rotazione (freccia rossa) per incollare il cervello sulla superficie creata sulla piattaforma per affettare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Elementi del sistema carbogenation per serbatoi aCSF inferiore a 50 mL. Sistemi di carbogenation Standard (A) utilizzando (a) tubi forati come un dispositivo di bolla di carbogen; un tubo è stato perforato da punture multiple con un filo di acciaio inossidabile 250 micron di diametro. (B) deflusso-carbogenation di (b) un connettore 3 vie tubo (diametro interno: 2 mm) o unità (C), una presa d'aria che impedisce il flusso del liquido posteriore con un filtro idrofobo.Il braccio centrale del connettore 3 vie tubo è collegato ad un serbatoio di carbogen dopo un manometro (pressione del gas: < 1 atm) e un misuratore di portata. I bracci rimanenti sono collegati all'interno del tubo di deflusso aCSF. (D) il carbogen portata è controllata mediante misuratori di flusso. Durante gli esperimenti, i serbatoi aCSF sono tenuti a 28-30 ° C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: i livelli di ossigeno in 40 mL di aCSF alle diverse condizioni. Il livello di ossigeno durante il serbatoio-carbogenation (RIS.-carb.) e aCSF riciclaggio è diminuito costantemente (cerchi grigio-riempito, n = 3). Tuttavia, il deflusso-carbogenation (deflusso-carb.) durante aCSF riciclaggio riduce il calo del livello di ossigeno, che ha raggiunto equilibrio a livelli basali (cerchi bianco-riempito, n = 3). Livelli basali sono stati misurati con res.-carb. senza aCSF riciclaggio. Le linee grigie punteggiate verticali indicano l'interruttore a carbogenation diversi protocolli. Gli effetti della res.-carb con il riciclaggio (min 7-24) e deflusso-carb. con il riciclaggio (cerchi bianchi, 24-40 min) sull'induzione di LTP e LTD sono raffigurati nella Figura 7 e Figura 8. I dati sono presentati come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Componenti di deflusso-carbogenation per esperimenti in una camera di fetta di sommersione. (A) presentazione della camera di fetta di sommersione. Il legare di platino a forma di U con le fibre di nylon che tiene una fetta hippocampal è raffigurato. I fili d'argento sono stati avvolti intorno a una piccola cannula, creazione di una bobina per aumentare l'area della fine filo d'argento. Il filo di riferimento di stimolazione è stato collocato nella camera di deflusso, e il riferimento di registrazione era nella camera principale. Per mantenere l'elettrodo di riferimento potenziale che stabile a diversi livelli di liquidi, il filo di riferimento di registrazione possa essere isolato da un tubo di plastica, lasciando solo la parte "subacquea" del filo esposto al buffer. (B) il campo chiaro immagine mostra una fetta hippocampal acuta rappresentativa e gli elettrodi. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: giro dentato; Sub: subiculum; CE: corteccia di entorhinal. (C) lo schema evidenzia le componenti principali del deflusso-carbogenation, senza indicazione dei misuratori di portata per il carbogen e la pompa peristaltica. Un filtro passa-basso può essere posizionato proprio di fronte la stufa in linea per ridurre le pulsazioni del flusso aCSF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Dipendenza della figura del potenziale del campo su forza di stimolazione e la posizione degli elettrodi. (A) esempi rappresentativi di campo sono raffigurati potenziali, evocati a distanze diverse dai punti di forza strato pyramidale (Str. pyr.) e la stimolazione. Le frecce nere orizzontali indicano il componente positiva fonte di punta della popolazione nel decadimento campo potenziale. Il componente positiva fonte di punta della popolazione è rimasto circa a metà delle posizioni "in linea" elettrodo fEPSP-aumento iniziale fase testato a tutti, tranne quella molto vicino lo strato di corpo cellulare (e). Componente (B) la posizione della fonte positiva di punta della popolazione varia notevolmente a causa del disallineamento degli elettrodi di stimolazione e registrazione. Lac.: strato lacunosum molecolare; Rad.: strato radiato; Pyr.: corneum pyramidale; REC: registrazione dell'elettrodo; Stim.: elettrodo di stimolazione. Barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Esempio rappresentativo degli effetti di un inibitore di eEF2K sulla trasmissione sinaptica hippocampal utilizzando il deflusso-carbogenation, con il riciclo di un piccolo aCSF serbatoio20 . Dopo la registrazione di EPSPS a intervalli di 1 min per 20 min, l'inibitore di eEF2K A-484954 è stato aggiunto direttamente al serbatoio aCSF (linea orizzontale). Un rapido aumento della trasmissione sinaptica era rilevabile (cerchi bianco-riempito). Se il farmaco non è stato applicato, il fEPSP-pendio è rimasto stabile nel tempo della registrazione (cerchi grigio-riempito). (B) applicazione dell'inibitore MAPK p38 (linea orizzontale grigia) ha impedito la eEF2K inhibito-indotto valorizzazione dei potenziali di campo. I dati sono presentati come la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Rappresentante registrazioni di attività-dipendente potenziamento della trasmissione sinaptica utilizzando deflusso-carbogenation (deflusso-carb.; cerchi bianchi) e serbatoio-carbogenation (RIS.-carb.; cerchi neri), con il riciclo di un piccolo aCSF serbatoio. Il potenziamento è stato indotto dopo tempo punto 0 per tre volte 100 Hz/s treni (Tet.: tetanization, stimolazione ad alta frequenza). I dati sono presentati come la media ± SEM. staffa: confronto statistico dei gruppi al punto di tempo; spaiato T-prova, non assumendo coerente deviazione standard. * p < 0.05.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 : Dipendenza della depressione di attività-dipendente della trasmissione sinaptica su forza di stimolazione e carbogenation. (A) utilizzo di serbatoio-carbogenation (RIS.-carb.) con il riciclo di un volume di grandi dimensioni aCSF, una stimolazione di 1 Hz per 15 min a 80% di fEPSP-pendenza massima evocato una forte depressione della trasmissione sinaptica (cerchi bianchi). Tuttavia, come il rappresentante fEPSP traccia prima (traccia nera) e dopo induzione LTD (traccia rossa al 110 minth ) indicare, il volley presinaptico della fibra (freccia nera verticale) notevolmente è stato ridotto. Questo è un esempio che indica che processi elettrochimici all'elettrodo stimolazione potrebbero danneggiare le afferenze, causando una depressione che non si basa parzialmente su meccanismi correlati LTD. Riducendo l'intensità di stimolazione al 50% del massimo fEPSP-pendio ha indotto una depressione della trasmissione sinaptica a un grado inferiore, ma senza modificare la fibra presinaptica volley (cerchi grigio-riempito). (B) induzione LTD non ha fatto evocare una depressione duratura di fEPSP-piste negli esperimenti con il serbatoio-carbogenation e il riciclaggio di un serbatoio piccolo aCSF (res.-carb.; grigio-riempito piazze). (C) il deflusso-carbogenation con il riciclaggio di un serbatoio piccolo aCSF ha migliorato il risultato dell'induzione LTD. Gli inserti presentano rappresentante EPSPS prima (tracce nere) e dopo (110th min, rosso tracce) induzione di LTD. Per il rappresentante EPSPS, le barre di scala verticale indicano 1 mV e le barre di scala orizzontale corrispondono a 2 ms. I dati sono stati ottenuti da fettine ippocampali acute (350 µm) di topi C57/BL 6 1 ai 2 mesi di età e sono presentati come la media ± SEM. staffe : confronto statistico dei gruppi al punto di tempo; spaiato T-prova, non assumendo coerente deviazione standard. * p < 0,05, ns: non significativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se Colombo fetta interfaccia esibiscono più robusto Risposte sinaptiche25,26,27,28, alloggiamenti di sommersione forniscono ulteriore comodità per la registrazione di patch-clamp e fluorescenza di imaging. Così, abbiamo descritto diversi aspetti di field recordings potenziali in fettine ippocampali acute utilizzando una camera di fetta di sommersione commerciale che può essere facilmente esteso per l'imaging di fluorescenza sonde in neuroni17,18, 19. Oltre la fetta preparazione25, il mantenimento di un livello di carbogen costante nella camera di registrazione dopo molte ore rappresenta uno degli ostacoli. Poiché il livello di carbogen solo è controllabile tramite la saturazione iniziale del serbatoio aCSF, differenze del livello di ossigeno nel aCSF sono facilmente ottenute in esperimenti giorno per giorno. Così, un misuratore di ossigeno è consigliato per velocizzare la risoluzione dei problemi e per regolare le condizioni (ad esempio, temperatura, portata di carbogen, carbogenation strumenti e tasso di riciclaggio aCSF) per raggiungere almeno 28 mg/L ossigeno nel serbatoio aCSF a stabile livelli. Inoltre, la pratica comune per modificare le dimensioni del contenitore aCSF per applicazione del farmaco può indurre gli effetti sui potenziali di campo a causa delle differenze nei loro livelli di carbogen.
L'uso di deflusso-carbogenation di un piccolo volume di tampone di riciclaggio ha migliorato il risultato degli esperimenti plasticità sinaptica. Migliorata la dissoluzione dell'ossigeno nel liquido si basa sul più grande rapporto tra l'area di contatto del liquido e del carbogen. Inoltre, il deflusso-carbogenation riduce il rifornimento del carbogen-vuotati aCSF nel serbatoio aCSF. La stabilità del carbogenation potrebbe essere ulteriormente migliorata da un venturi specificamente progettato sulla base del principio di prodotti commerciali29.
Anche con la migliore preparazione fetta e condizioni di installazione, è spesso inevitabile che potenziali di campo non possono essere indotta quando vengono utilizzati elettrodi di stimolazione metallo coibentato. Spesso, la ragione è che l'isolamento sia stato danneggiato a causa di piegatura o pulizia. Come abbiamo indicato nei metodi, un semplice approccio consiste nel controllare la formazione di bolle a bassa tensione di CC. Inoltre, questo passaggio consente di pulire la punta e ridurre l'impedenza dell'elettrodo di stimolazione. L'uso di pipette in vetro per la stimolazione è comune e ha il vantaggio di fornire un più ristretto campo di stimolazione della fibra. Spesso, non è possibile trovare una pendenza massima fEPSP quando lo stimolo di pipetta di vetro è usato. L'aspetto del componente positiva fonte di punta della popolazione nella fase fEPSP-decadimento potrebbe quindi essere utilizzato per regolare la forza di stimolazione23.
Può la pubblicazione per quanto riguarda l'induzione di plasticità sinaptica attività-dipendente e il coinvolgimento delle diverse vie di segnalazione dipendente il protocollo di induzione applicata sono disponibili10. Tuttavia, dal punto di vista metodologico, la stimolazione ad alta frequenza potrebbe causare artefatti distinti che potrebbero impedire la riuscita induzione di plasticità sinaptica. Una stimolazione ripetuta di 100 Hz/1 s potrebbe causare polarizzazione di elettrodi di stimolazione o di reazioni elettrochimiche30, conseguente la depressione della trasmissione sinaptica causa danni alle afferenze (per un esempio, vedere Figura 8 ). Per ridurre al minimo i processi elettrochimici, l'uso di impulsi di stimolazione bifasici e una potenza di stimolazione non più di 2 V per le registrazioni della linea di base sono suggeriti.
In sintesi, il deflusso-carbogenation aiuta a stabilizzare il livello di ossigeno negli esperimenti che si basano sul riciclaggio di un serbatoio di buffer di piccole dimensioni, migliorando l'efficienza dei costi degli esperimenti di droga.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
W.W. condotto, analizzato e progettato gli esperimenti e ha scritto il manoscritto. D.X. e C.P. assistito nella preparazione di figura e condotti gli esperimenti. Questo lavoro è stato supportato da NSFC (31320103906) e 111 Project (B16013) a T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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