Summary
Este protocolo descreve a estabilização do nível de oxigênio em um pequeno volume de tampão reciclado e aspectos metodológicos da plasticidade sináptica dependente de atividade de gravação em fatias hippocampal agudas submersas.
Abstract
Apesar de experiências com fatias do cérebro têm sido utilizados desde 1951, subsistem problemas que reduzem a probabilidade de alcançar uma análise estável e bem sucedida da modulação da transmissão sináptica ao realizar gravações de campo potencial ou intracelular. Este manuscrito descreve aspectos metodológicos que podem ser úteis na melhoria das condições experimentais para a manutenção de fatias cerebral aguda e para gravação de potenciais pós-sinápticos excitatórios do campo em uma câmara de submersão comercialmente disponível com uma unidade de saída-carbogenation. O efluxo-carbogenation ajuda a estabilizar o nível de oxigênio em experimentos que contam com a reciclagem de um reservatório pequeno buffer para melhorar o custo-eficácia das experiências de drogas. Além disso, o manuscrito apresenta experimentos representativos que examinam os efeitos da estimulação paradigmas e modos diferentes de carbogenation sobre a plasticidade sináptica dependente da atividade de transmissão sináptica.
Introduction
Em 1951, os experimentos de fatia cerebral aguda primeiro-relatado foram realizados1. Em 1971, após a bem sucedida em vitro gravações da piriform córtex2,3 e a descoberta de que os neurônios hippocampal estão interligados transversalmente ao longo do eixo septotemporal do hipocampo4, dentre as primeiras gravações em vitro da atividade neuronal hippocampal foi alcançado5. A similaridade de parâmetros neurofisiológicos ou neurostructural de neurônios sob condições in vivo e in vitro são ainda objecto de algum debate6, mas em 1975, Schwartzkroin7 , indicou que o basal Propriedades dos neurônios são mantidas em vitro e que a estimulação de alta-frequência (ou seja, Tetanização) de afferents na formação hippocampal induz uma facilitação de longa duração dos potenciais sinápticos8. Eletrofisiológicos de gravação de atividade neuronal em vitro , expandiu o estudo dos mecanismos celulares de plasticidade sináptica dependente de atividade9,10, que havia sido descoberto em 1973 por Bliss et al. 11 no in vivo de experiências com coelhos.
O estudo da atividade neuronal ou sinalização de percursos em fatias do cérebro e especialmente em fatias hippocampal agudas, é agora uma ferramenta padrão. No entanto, surpreendentemente, experimentos em vitro ainda precisam ser padronizada, como evidenciado por várias abordagens que ainda existem para a preparação e manutenção de fatias hippocampal agudas. Reid et al . (1988) 12 revista os desafios metodológicos para a manutenção de fatias de cérebro aguda em diferentes tipos de câmaras de fatia e as escolhas de banhar o nível médio, pH, temperatura e oxigênio. Esses parâmetros são ainda difíceis de controlar na câmara devido aos elementos feitos sob medidas na vitro fatia-gravação configurações de gravação. Publicações podem ser encontradas que pode ajuda para superar alguns dos desafios metodológicos e que descrevem novos tipos de câmaras de fatia de submersão, tais como um sistema de microperfusion 3D intersticial13, uma câmara com maior fluxo laminar e oxigênio fornecer um sistema de gravação multi-câmara16, um sistema com controle de temperatura computadorizado15e14. Uma vez que estas câmaras não são fáceis de construir, a maioria dos cientistas dependem de câmaras fatia comercialmente disponível. Estas câmaras podem ser montadas em um sistema do microscópio, permitindo assim a combinação de eletrofisiologia e fluorescência de imagem17,18,19. Uma vez que estas câmaras mantém as fatias de cérebro submergidas no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF), uma taxa de fluxo elevada da solução-tampão precisa ser mantida, aumentando a despesa da aplicação da droga. Para este fim, nós incorporamos um sistema de reciclagem da perfusão com vazão-carbogenation que fornece a estabilidade suficiente para a gravação de longo prazo dos potenciais de campo em uma câmara de fatia de submersão usando um volume relativamente pequeno aCSF. Além disso, estamos resumidos como o uso deste sistema experimental carbogenation/perfusão afeta o resultado de plasticidade sináptica dependente de atividade10 e como inibição da quinase de 2-fator de alongamento eucariótico (eEF2K) modula sináptica transmissão de20.
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Protocol
Os animais foram mantidos em conformidade com os padrões estabelecidos de cuidados com animais e procedimentos dos institutos de ciência do cérebro e estado chave laboratório de médicos neurobiologia da Fudan University, Shanghai, China.
1. preparação da solução
Nota: Consulte a tabela de materiais.
- Preparar o fatiamento buffer (solução do Gey modificado): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30mm NaHCO3, glicose de 25 mM, 20 mM HEPES, 3mm at+-piruvato, 10 mM de MgSO4e 0,5 mM CaCl2.
- Ajuste o pH para 7,6 usando 1 M NaOH, sem carbogenation.
- Loja reserva em 4 ° C.
Nota: A titulação esclarece o líquido turvo. A osmolalidade é 305-310 mOsm. A carbogen21 contém 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio. - Preparar a aCSF diluindo um 10 x solução stock de aCSF que não contém bicarbonato e glicose, dando uma composição final de: 124 mM NaCl, KCl de 2,5 mM, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2e 1,25 mM KH2PO4.
- Adicione o bicarbonato e glicose para atingir 10 mM glicose e 26 mM NaHCO3.
- Carbogenate a aCSF através de um tubo de silicone perfurado com um fim bloqueado imediatamente após a adição do NaHCO3.
- Medir o pH enquanto carbogenating (pH 7.3-7.4).
Nota: A capacidade do buffer pode ser ajustada ligeiramente alterando a quantidade de NaHCO3. Desde que o pH resultante é dependente da temperatura, é necessário verificar o pH resultante enquanto carbogenating à temperatura de trabalho (por exemplo, 30 ° C).
2. preparação de fatias Hippocampal agudas
Nota: Consulte a tabela de materiais.
- Coloque uma fatia-exploração malha em uma câmara de incubação para fatias de cérebro aguda, encha a câmara com aCSF e carbogenate (4-6 L/h) pelo menos 30 min22 a 28-30 ° C.
- Legal os instrumentos cirúrgicos até 2-4 ° C.
- Coloque num copo de vidro cheio de frio e carbogenated cortar o tampão (2-4 ° C), mantido em uma mistura de gelo/água, perto do vibratome.
- ANESTHETIZE ratos ou camundongos, até os reflexos da córnea desaparecerem (30-50 s) utilizando isoflurano tendo 500 µ l em um frasco de vidro de 2 L ou 12,5 µ l em um tubo de 50 mL.
- Isolar o cérebro usando um método descrito e visualizadas em detalhe nas publicações de Mathis et al . (2011) 23 e Yuanxiang et al . (2014) 24.
- Esfrie o cérebro até 2-4 ° C em um buffer de fatiamento gelado (pelo menos 2 min) antes de dissecar o cerebelo e separar os hemisférios.
- Use uma lâmina fria para dissecar um pedaço do córtex dorsal em um ângulo de 70° ao longo da borda dorsal de cada hemisfério25 para obter fatias transversais do ventral e a parte intermediária do hipocampo, como mostrado na Figura 1C e E.
- Com uma espátula de frio cimento dental, transferi um hemisfério para um pedaço de papel de filtro para secar rapidamente a superfície criada (1-2 s).
- Montar os dois hemisférios com superfícies recém cortadas na plataforma gelada fatia usando colagem adesiva de ação rápida; tem extremidade caudal da face hemisférios a lâmina de barbear (Figura 1D).
- Coloque a plataforma de corte na câmara de resfriamento de um vibratome e encher a câmara com o buffer de corte (2-4 ° C). Carbogenate usando um tubo de silicone perfurado.
- Corte 350 µm fatias usando configurações de vibratome adequada (por exemplo, a velocidade para a frente da lâmina: 1,2 mm/s, amplitude da lâmina: 1 mm).
- Isolar a formação hippocampal do subiculum e os córtices entorhinal usando duas cânulas de injeção (> 28 G) como uma tesoura.
- Remova as bolhas de malha fatia-exploração da câmara de incubação previamente preparada com uma pipeta Pasteur.
- Transfira as fatias que têm alguma transparência para o estrato pyramidale da plataforma de corte sobre a malha de câmara úmida. Evite qualquer dobradura, alongamento, sobreposição e flutuante por aspiração aCSF e a fatia para uma pipeta de Pasteur de boca grande.
Nota: Todo o procedimento (etapa 2.5-2.14) pode levar 5-10 min; Portanto, é importante verificar a temperatura da solução-tampão ao longo do tempo para mantê-la a 4 ° C. - Incubar as fatias a 30 ° C, durante pelo menos 1,5 a 2 h em câmara úmida e fornecer carbogen a 4-6 L/h.
Nota: Ajuste a taxa de fluxo da carbogen para circular o buffer na incubadora, mas impedir que as fatias flutuante.
3. modificações do Carbogenation para a aCSF reciclagem de pequenos reservatórios
- Adicione um conector de 3 vias do tubo a saída do sistema de reciclagem (Figura 2B).
- Una o braço meio do conector do tubo de 3 vias com um tubo de alimentação de carbogênio e regular a vazão com um medidor de fluxo de ar (3-4 L/h, Figura 2D e Figura 4C).
- Adicione um segundo conector de tubo de 3 vias para a entrada do sistema de reciclagem. Una o braço médio ao tubo enfrentando o aquecedor embutido, parte superior do braço para um tubo de silicone fino (10 cm de comprimento) e o braço inferior para o tubo de entrada do reservatório (filtro passa-baixas; Figura 4 C).
- Coloque um espremedor de tubo em um tubo de silicone fino (OD: 2 mm) em uma posição ao longo do tubo onde a pulsação da aCSF na câmara de fatia, gerada pela bomba peristáltica, é no seu mínimo.
Nota: A vazão-carbogenation (saída-carb.) modificação reduz a sensibilidade do nível carbogenation para o volume do reservatório de aCSF, a aCSF taxa, de reciclagem e tubo relativo posições dentro aCSF pequenos reservatórios (< 50 mL; A Figura 3). Sobre o filtro passa-baixas, uma certa quantidade de ar no tubo de silicone fino reduz a pulsação do fluxo aCSF; assim, o tubo deve ser preenchido principalmente com ar.
4.Gravação de resposta sináptica em uma câmara de fatia de submersão
Nota: Consulte a tabela de materiais.
- Pré-aquecer a solução aCSF num banho de água a cerca de 28-30 ° C (isto irá prevenir a formação de bolhas na câmara de gravação).
- Inicie o sistema de reciclagem (4-5 mL/min) e ativar o aquecedor embutido para equilibrar o sistema pelo menos 1 h.
- Limpou um pequeno pedaço de papel e uma malha de nylon fixada em um fio de platina em forma de U na câmara de fatia de submersão por alguns minutos (Figura 4) de limpeza da lente.
- Retire o fio de platina em forma de U.
- Desligue a reciclagem e coloque uma fatia sobre a papel da limpeza da lente.
- Imediatamente, coloque a fatia-exploração malha em cima da fatia, ligar a bomba e deixe a fatia equilibrar por 30 min sem mergulhando a aCSF o objetivo.
- Encha a micropipeta de borosilicato (ou seja, o eletrodo de gravação) com aCSF (resistência de ponta: cheio de 1-2 MΩ, 1/3 com aCSF) e montá-lo no suporte da pipeta.
- Verifique a isolação do eletrodo estimulação metal, colocando-o em solução de NaHCO3 (> 40 milímetros). Ligar o eletrodo ao polo negativo de um gerador de tensão DC (V 1-2, o polo positivo: fio de prata ou platina) e observar a formação de bolhas na ponta de um microscópio de dissecação (> 60 x ampliação).
- Coloque o eletrodo de tungstênio de epóxi-isolados testados de estimulação no suporte de manipulador e a referência de fios da câmara de fatia.
- Adicionar um segundo eletrodo de referência para a câmara e ligue-o à tomada de referência do headstage do eletrodo gravação(Figura 4).
- No software de controle do amplificador, clique na caixa "modo zero braçadeira" e prossiga clicando duas vezes a caixa "lista de ganho de saída". Escolher um ganho de "100", clique duas vezes em "high pass filtro caixa de listagem (Bessel)," escolher "0,1 Hz" e clique duas vezes em "low pass filtro caixa de listagem (AC)" para escolher "3 kHz."
- No software de gravação, clique em "adquirir | Abrir protocolo." Escolha um protocolo que possui configurações permitindo estímulos episódicos e a digitalização dos potenciais amplificados em 10-20 kHz para 50-100 ms e que automaticamente aciona um isolador de estímulo 10 ms após o início de uma gravação de episódica.
- Coloque a estimulação e eletrodos de gravação em linha e em paralelo para o estrato pyramidale, por exemplo (Figura 4B e Figura 5).
- Clique em "adquirir | Editar o protocolo"e escolha o separador"gatilho"(na janela pop-up). Clique sobre a caixa "fonte de gatilho" e escolha "barra de espaço", como a fonte de gatilho. Clique no botão "Okey". Clique no botão "gravar" para iniciar a aquisição e observe a janela pop-up com um botão de disparo.
- No software do isolador de estímulo, clique na caixa "controle de tensão" e digite "0". Clique no botão "download". Clique na janela do "software de gravação" e pressione a barra de espaço. Repita este ciclo por sequencialmente inserindo valores de 1 a 8, por exemplo, em etapas de mV 1 na caixa "controle de tensão".
- Correlacionar a força de estimulação com valores fEPSP-inclinação e determinar a intensidade do estímulo necessária para chegar a 40% da fEPSP-inclinação máxima. Clique na caixa de controle"tensão" e digite o valor determinado. Clique no botão "download".
Nota: Um isolador de estímulo é usado para aplicar tensão breve ou pulsos de corrente ao tecido cerebral. Os pulsos de bifásico podem ter 100 µs por fase. - O software de gravação, clique no botão parar e, em seguida, no menu de "Adquirir". Clique em "Editar o protocolo" e escolhe a aba de "gatilho" na janela pop-up. Clique na caixa fonte de gatilho e escolheu o "timer interno" como fonte de gatilho. Clique no botão "Okey". Clique no botão gravar que inicia a gravação automática dos potenciais de campo cada 30 s, por exemplo. Clique no botão "stop" após 30-60 min.
- Clique no menu "Adquirir", clique em "Protocolo aberto", escolha o protocolo de indução desejada de plasticidade sináptica e clique no botão "Okey". Clique no botão "gravar" para ativar automaticamente a estimulação de alta frequência e gravação. Clique no botão "stop".
Nota: No caso de estudos relativos a plasticidade sináptica, aplica um dos paradigmas para a potenciação de longa duração ou depressão a longo prazo após a gravação de base prolongada indução padrão. Exemplos representativos de modulação resultante da transmissão sináptica estão representados na Figura 7 e Figura 8. - O software de gravação, clique em "adquirir | Abra o protocolo"e escolha o mesmo protocolo como na etapa 4.12. Clique no botão "Okey" e clique em "record". Mantenha automaticamente executando as gravações de campo potencial para 2-4 h, por exemplo. Clique no botão "stop" para finalizar a gravação.
- No caso de estudos farmacêuticos, aplicar o composto diretamente para a aCSF reservatório se permanente administração composta é desejado (Figura 6).
5. a instalação e dicas de limpeza
Nota: Veja abaixo dicas gerais.
- Limpar o sistema semanalmente por reciclagem 10% H2O2 por não mais de 20 min, seguido por lavagem com desionizada H2O.
Nota: O etanol não é recomendado para a limpeza. Da mesma forma não é recomendável para imergir os fios de referência e o objetivo em H2O2. - Remova o sal precipitado na superfície da lente objetiva ou arredores de câmara com 0.1 N HCl e, em seguida, a água.
- Lave o borbulhador carbogen em água destilada ou 0.1 N HCl.
- Mergulhe a câmara de incubação fatia em 10% H2O2 por 5 min uma vez por semana e em seguida, enxaguar cuidadosamente a incubadora com desionizada H2O.
- No caso de eletrodos de estimulação metal, lave a ponta do eletrodo estimulante com água desionizada após cada experimento e Limpe suavemente a ponta do eletrodo estimulante com uma bola de algodão embebida em álcool para remover o tecido residual.
- Reduza a resistência de eletrodos de estimulação metal comercial removendo o isolamento na ponta através de um golpe cuidado com lixa.
- Reduza a perda de carbogênio do aCSF enquanto reciclagem através dos tubos, substituindo os tubos de silicone com tubos de politetrafluoretileno.
- Mantenha os fios de prata da gravação de eletrodo e eletrodo de referência em lixívia por vários dias para formar AgCl na superfície do fio.
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Representative Results
Na seção de protocolo, descrevemos a preparação de fatias hippocampal agudas da parte ventral e intermediário da formação hippocampal (Figura 1) de camundongos C57BL/6 machos e ratos machos Wistar (5-8 semanas). A posição dos hemisférios na plataforma de segmentação de dados ajuda a mantê-los estáveis e remove a necessidade de estabilização com ágar-ágar ou agarose. O próprio sistema de perfusão é baseado em uma bomba peristáltica, operada em alta rotação para dar a vazão necessária do líquido. Assim, o envelhecimento dos tubos padrão dentro da bomba criou um problema substancial que ultrapassámos usando tubos não-silicone (ID: 1,02 mm). A pressão negativa para a saída também é criada por dois tubos paralelos conectados que têm um diâmetro interno de 2,79 mm. Estes dois tubos estão ligados a uma cânula na câmara de gravação para permitir a aspiração do líquido(Figura 4). A taxa de carbogenation do aCSF no reservatório deve ser estável ao longo de muitas horas, que podem ser difícil conseguir usando pedras de ventilação ou tubos com pequenos poros. Desde que o carbogenation de saída não depende de pequenos poros, a taxa de fluxo de carbogênio ao longo do tempo permanece estável (Figura 2). Se os experimentos são realizados com um reservatório pequeno aCSF, a vazão-carbogenation ajuda a alcançar um equilíbrio do oxigênio dissolvido (Figura 3). Além disso, minimiza a variabilidade do nível de oxigênio entre os experimentos com base em uma posição do tubo de entrada/saída alterada, o número de poros ativos em tubos de bolha de carbogênio e a taxa de reciclagem de líquidos.
A fatia é colocada no papel de lente para permitir alguma troca de líquido abaixo(Figura 4). Desde que a câmara de fatia pode ser montada em um microscópio vertical que é equipado com um objetivo X 40, a posição dos eléctrodos pode ser bem controlada (Figura 4B e Figura 5). Isso reduz ainda mais a variabilidade das experiências no trabalho quotidiano.
Para determinar a intensidade do estímulo necessária para a gravação de linha de base do campo potencial, que a dependência do tamanho potencial do campo sobre a força de estimulação deve ser determinada pela gravação do fEPSPs na estimulação diferentes pontos fortes (Figura 5 ). A medição da característica de entrada-saída cria um estresse na fatia na maior pontos fortes de estimulação. Assim, uma outra abordagem é a busca para uma força de estimulação que apenas evoca um componente de pico positivo da população na fEPSP-decadência (setas pretas na Figura 5)26.
Após a gravação de uma linha de base estável durante pelo menos 30 min, pode começar a administração de drogas. Aqui, apresentamos um exemplo dos efeitos de um inibidor de eEF2K na transmissão sináptica. Inibição do eEF2K promove a transmissão sináptica (Figura 6A), um efeito que foi atenuado pela inibição de p38 MAPK (Figura 6B)20.
Plasticidade sináptica dependente de atividade pode ser induzida por uma variedade de estimulação paradigmas10. Aqui, apresentamos experiências representativas de plasticidade sináptica que baseiam-se em uma sequência contínua de estímulos a 100 Hz e estimulações repetidas a 1 Hz mais 15 min. A modulação resultante da transmissão sináptica tem sido retratada na Figura 7 e Figura 8. Além disso, é mostrado na Figura 7 e Figura 8 que a estabilização do nível de oxigênio de reservatórios de buffer pequeno pelo efluxo-carbogenation (círculos brancos, nível de oxigênio relativo às 24-40 min na Figura 3) melhorou a LTP e indução LTD em comparação com experimentos com reservatório-carbogenation apenas (círculos cinzento, nível de oxigênio no min 7-24). Nós não testar a combinação de vazão-carbogenation e reservatório-carbogenation (7-24 min) porque estávamos interessados na criação de um sistema experimental com o uso do carbogênio menor e mais simples. O reservatório-carbogenation com n reciclagem (até 7 min) representa o nível de base de oxigénio no reservatório aCSF.
Figura 1: Posicionamento os hemisférios do cérebro para obter fatias transversais do hipocampo usando um vibratome. (A), a formação do hipocampo é indicado em uma vista lateral do hemisfério direito, em verde, dentro de um modelo de cérebro de rato reconstruído. (B) uma vista ventral da formação hippocampal. (C) a visão rostral e caudal demonstra uma seção da parte ventral e intermediário da formação hippocampal para o hemisfério direito no plano horizontal. Desde regiões diferentes ao longo do eixo septotemporal do hipocampo têm diferentes graus de inervação e função31,32, um ângulo de corte diferente é necessário para fatias transversais do hipocampo dorsal, para exemplo. Barra de escala = 3 mm (linhas horizontais brancas). (D) a foto mostra os hemisférios de um cérebro de rato colado em uma plataforma de vibratome. Barra de escala = 6 mm. (E) o desenho retrata o ângulo para aparar a borda dorsal do córtex (esquema superior) do hemisfério direito separado (linha preta pontilhada) e a rotação (seta vermelha) para colar o cérebro na superfície criado na plataforma de corte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Elementos do sistema de carbogenation para aCSF reservatórios abaixo de 50 mL. (A) carbogenation padrão sistemas usando (a) tubos perfurados como um dispositivo de bolha carbogen; um tubo foi perfurado por múltiplas punções com um fio de aço inoxidável 250 µm de diâmetro. (B) vazão-carbogenation por (b) um conector de 3 vias do tubo (diâmetro interno: 2 mm) ou unidade (C) um respiradouro que impede o fluxo líquido de volta com um filtro hidrofóbico.O braço do meio do conector do tubo de 3 vias está conectado a um tanque de carbogênio após um manómetro (pressão do gás: < 1 atm) e um medidor de fluxo. Os braços restantes estão ligados no interior do tubo de saída de aCSF. Taxa de fluxo (D) a carbogen é controlada por medidores de vazão. Durante os experimentos, os reservatórios de aCSF são mantidos em 28-30 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os níveis de oxigênio em 40 mL de aCSF em diferentes condições. O nível de oxigênio durante o reservatório-carbogenation (res.-carb...) e aCSF reciclagem diminuiu constantemente (círculos com preenchimento cinza, n = 3). No entanto, a vazão-carbogenation (saída-carb.) aCSF reciclagem reduziu-se a queda do nível de oxigênio, que alcançou o equilíbrio a basais (círculos com preenchimento branco, n = 3). Basais foram medidos com res-carb. sem aCSF reciclagem. As linhas verticais de pontilhado cinza indicam o interruptor para carbogenation diferentes protocolos. Os efeitos da res-carb com reciclagem (7-24 min) e vazão-carb. com a reciclagem (círculos brancos, 24-40 min) sobre a indução de LTP e LTD são representados na Figura 7 e Figura 8. Os dados são apresentados como a média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Componentes de vazão-carbogenation para experimentos em uma câmara de fatia de submersão. (A) apresentação da câmara de fatia de submersão. O fio de platina em forma de U com as fibras de nylon segurando uma fatia hippocampal é retratado. Os fios de prata estavam embrulhados em torno de uma pequena cânula, criando uma bobina para aumentar a área do fim do fio de prata. O fio de referência de estimulação foi colocado na câmara de saída, e a referência de gravação foi na câmara principal. Para manter o eletrodo de referência potencial que estável em diferentes níveis de líquido, o fio de referência de gravação pode ser isolado por um tubo de plástico, deixando apenas a parte "subaquática" do fio exposto para o buffer. (B) campo brilhante imagem mostra uma representativa fatia hippocampal aguda e os eletrodos. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: giro pectínea; sub: subiculum; CE: o córtex entorhinal. (C) o esquema destaca os principais componentes do efluxo-carbogenation, sem indicação de medidores de vazão para a carbogen e a bomba peristáltica. Um filtro low-pass pode ser colocado em frente do aquecedor embutido para reduzir a pulsação do fluxo aCSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Dependência de forma potencial de campo em cima de força de estimulação e a posição dos eléctrodos. (A) exemplos representativos do campo potenciais, evocadas a diferentes distâncias do estrato pyramidale (Str. pyr.) e estimulação pontos fortes são retratados. As horizontais setas pretas indicam que o componente de origem positiva do aumento de população na deterioração potencial do campo. O componente de origem positiva de spike a população manteve-se aproximadamente no meio das posições fEPSP-ascensão inicial fase em tudo testado eletrodo "em linha", exceto o único muito perto da camada do corpo celular (e). (B) a posição da fonte positiva de componente de spike a população variava enormemente devido ao desalinhamento dos eléctrodos de estimulação e gravação. ALC.: estrato lacunosum moleculare; Ramos: estrato radiatum; Pyr.: estrato pyramidale; Rec.: gravação eletrodo; Stim.: eletrodo de estimulação. Barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Exemplo representativo dos efeitos de um inibidor de eEF2K na transmissão sináptica hippocampal usando a vazão-carbogenation, com a reciclagem de um reservatório de pequena aCSF20 . Após a gravação de fEPSPs em intervalos de 1 min por 20 min, o inibidor de eEF2K A-484954 foi adicionado diretamente para o reservatório de aCSF (linha horizontal). Um rápido aumento da transmissão sináptica foi detectáveis (círculos com preenchimento branco). Se a droga não foi aplicada, a fEPSP-inclinação manteve-se estável ao longo do tempo da gravação (círculos com preenchimento cinza). (B) aplicação do inibidor p38 MAPK (linha horizontal cinza) impediu o eEF2K inhibito-induzida do realce dos potenciais de campo. Os dados são apresentados como a média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Representante gravações de potenciação de atividade dependente da transmissão sináptica usando vazão-carbogenation (saída-carb.; círculos brancos) e reservatório-carbogenation (res.-carb.; círculos pretos), com a reciclagem de um pequeno aCSF reservatório. A potenciação foi induzida após 0 hora do ponto por três vezes trens de 100 Hz/s (Tet.: Tetanização, estimulação de alta frequência). Os dados são apresentados como a média ± SEM. Bracket: comparação estatística de grupos por ponto de tempo; Não emparelhada teste-T, não assumindo o desvio-padrão consistente. * p < 0,05.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Dependência da depressão de atividade dependente da transmissão sináptica após estimulação força e carbogenation. (A) usando o reservatório-carbogenation (res.-carb.) com a reciclagem de um volume grande de aCSF, uma estimulação de 1 Hz por 15 min a 80% de inclinação máxima fEPSP evocou uma forte depressão da transmissão sináptica (círculos brancos). No entanto, como o representante fEPSP traços antes (traço preto) e após indução LTD (traço vermelho no 110 minth ) indicar, o vôlei de fibra pré-sináptica (seta preta vertical) foi reduzido. Este é um exemplo indicando que processos eletroquímicos no eléctrodo de estimulação podem prejudicar as afferents, causando uma depressão que não depende parcialmente mecanismos LTD-relacionados. Reduzindo a força de estimulação de 50% do máximo fEPSP-ladeira induzida uma depressão da transmissão sináptica em menor grau, mas sem alterar a fibra pré-sináptica vôlei (círculos com preenchimento cinza). (B) indução LTD não evocar uma depressão duradoura de fEPSP-encostas nos experimentos com o reservatório-carbogenation e a reciclagem de um reservatório pequeno aCSF (res-carb.; praças cheias de cinza). (C) a vazão-carbogenation com a reciclagem de um reservatório pequeno aCSF melhorou o resultado da indução LTD. As inserções do presente fEPSPs representante antes (traços pretos) e depois (110th min, vermelho vestígios) indução LTD. Para o representante fEPSPs, as barras de escala vertical indicam 1 mV e as escala horizontal barras correspondem a 2 ms. os dados foram obtidos de fatias hippocampal agudas (350 µm) de 1 a 2 meses de idade camundongos C57/BL 6 e são apresentados como a média ± SEM. suportes : uma comparação estatística de grupos por ponto de tempo; Não emparelhada teste-T, não assumindo o desvio-padrão consistente. * p < 0,05, ns: não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Apesar de câmaras de fatia de interface apresentam mais robusta resposta sináptica25,26,,27,28, câmaras de submersão fornecem conveniência adicional para gravação de remendo-braçadeira e fluorescência imagem latente. Assim, descrevemos vários aspectos potenciais de gravações de campo em fatias hippocampal agudas utilizando uma câmara de fatia de submersão comercial que pode ser facilmente estendida para a imagem latente de sondas de fluorescência em neurônios17,18, 19. Além da preparação de fatia25, a manutenção de um nível constante de carbogênio na câmara depois de muitas horas de gravação representa um dos obstáculos. Desde o nível do carbogênio só é controlável pela saturação inicial do reservatório aCSF, diferenças no nível de oxigênio no aCSF são facilmente obtidas em experiências do dia a dia. Assim, um medidor de oxigênio é recomendado para acelerar a resolução de problemas e para ajustar as condições (por exemplo, temperatura, taxa de fluxo de carbogênio, carbogenation ferramentas e aCSF taxa de reciclagem) para alcançar pelo menos 28 mg/L oxigénio no reservatório aCSF no estábulo níveis. Além disso, a prática comum para alterar o tamanho do recipiente aCSF para aplicação da droga pode induzir efeitos nos potenciais de campo devido a diferenças nos níveis de carbogênio.
O uso da vazão-carbogenation de um pequeno volume de tampão reciclagem melhorou o resultado dos experimentos plasticidade sináptica. Melhorada a dissolução de oxigênio no líquido baseia-se na maior relação entre a área de contato do líquido e carbogênio. Além disso, a vazão-carbogenation reduz o fornecimento da aCSF carbogen empobrecido no reservatório aCSF. A estabilidade do carbogenation pode ser melhorada por um venturi especificamente projetado com base no princípio de produtos comerciais29.
Mesmo com a melhor fatia de preparação e as condições de instalação, muitas vezes é inevitável que potenciais de campo não podem ser induzidas quando são utilizados eletrodos de estimulação metal isolado. Muitas vezes, a razão é que o isolamento tenha sido danificado devido a dobra ou limpeza. Como já foi mencionado nos métodos, uma abordagem simples é verificar a formação de bolhas na baixa tensão DC. Além disso, essa etapa ajuda a limpar a ponta e para reduzir a impedância do eléctrodo de estimulação. O uso de pipetas de vidro para estimulação é comum e tem a vantagem de fornecer um campo mais estreito da estimulação da fibra. Muitas vezes, não é possível encontrar uma inclinação máxima fEPSP quando a estimulação de uma pipeta de vidro é usada. A aparência do componente fonte positiva do aumento de população na fase fEPSP-decadência pode ser usada para ajustar a força de estimulação23.
Pode publicação relativa a indução de plasticidade sináptica dependente de atividade e o envolvimento de diferentes vias de sinalização dependentes do protocolo de indução aplicada estão disponíveis10. No entanto, do ponto de vista metodológico, a estimulação de alta frequência pode causar artefatos distintos que poderiam evitar a indução bem-sucedida de plasticidade sináptica. Uma repetida estimulação de s 100 Hz/1 poderia causar polarização dos eletrodos de estimulação ou reações eletroquímicas30, resultando na depressão da transmissão sináptica devido a danos a afferents (consulte a Figura 8 , por exemplo). Para minimizar os processos eletroquímicos, recomenda-se o uso de pulsos de estimulação bifásica e um poder de estimulação não mais de 2 V para gravações de base.
Em resumo, a vazão-carbogenation ajuda a estabilizar o nível de oxigênio em experimentos que contam com a reciclagem de um reservatório de buffer pequeno, aumentando o custo-eficácia das experiências de drogas.
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Disclosures
Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que poderia ser interpretado como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
W.W. conduzida, analisados e projetou os experimentos e escreveu o manuscrito. D.X. e C.P. auxiliou na preparação de figura e realizaram os experimentos. Este trabalho foi financiado pelo NSFC (31320103906) e 111 projeto (B16013) para tuberculose.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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