Summary
Этот протокол описывает стабилизации уровня кислорода в небольшой объем переработанной буфера и методологические аспекты записи активности зависимых синаптической пластичности погруженной острый гиппокампа ломтиками.
Abstract
Даже несмотря на то, что эксперименты на срезах головного мозга были в эксплуатации с 1951 года, сохраняются проблемы, которые снижают вероятность достижения стабильного и успешного анализа синаптической передачи модуляции при выполнении поле потенциальных или внутриклеточных записи. Эта рукопись описывает методологические аспекты, которые могут быть полезны в улучшении экспериментальных условий для поддержания острого мозга ломтиками и записи полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов в камере коммерчески доступных погружения с блоком отток carbogenation. Отток carbogenation помогает стабилизировать уровень кислорода в экспериментах, которые полагаются на рециркуляции небольшой буфер водохранилища для повышения эффективности затрат наркотиков экспериментов. Кроме того рукопись представляет представитель эксперименты, которые изучить последствия различных carbogenation режимы и стимуляции парадигмы на деятельность зависимых синаптической пластичности синаптической передачи.
Introduction
В 1951 году сообщил первый острый мозга срез эксперименты были проведены1. В 1971 году, после успеха в vitro записей от piriform коры2,3 и обнаружения, что Нейроны гиппокампа поперечно взаимосвязаны вдоль оси septotemporal гиппокампа4, один из Первые записи в vitro гиппокампа нейронной активности было достигнуто5. Схожесть нейрофизиологических или neurostructural параметров нейронов в vivo и in vitro условиях по-прежнему являются предметом некоторых прений6, но в 1975 году, Schwartzkroin7 указал, что базальная свойства нейронов поддерживаются в пробирке и что ВЧ-стимуляция (например, тетанизацией) афферентов гиппокампа формирования вызывает длительное облегчение синаптический потенциал8. Электрофизиологические запись активности нейронов в vitro значительно расширил изучение клеточных механизмов деятельности зависимых синаптической пластичности9,10, которая была обнаружена в 1973 году Блисс и др. 11 в в естественных условиях экспериментов с кроликов.
Исследование активности нейронов или сигнальные пути в срезах головного мозга и особенно в острой срезах гиппокампа, теперь является стандартным инструментом. Однако удивительно, в пробирке эксперименты еще быть стандартизированы, что подтверждается несколько подходов, которые все еще существуют для подготовки и ведения острой гиппокампа ломтиками. Рид и др. (1988) 12 обзор методологических проблем для поддержания острого мозга ломтики в различных видов камер срез и выбор купать уровень средний, рН, температуры и кислорода. Эти параметры являются по-прежнему трудно контролировать в зале записи благодаря заказные элементы в vitro фрагментов записи установок. Публикации можно найти, что может помочь преодолеть некоторые из методологических проблем и что описывают новые типы погружения срез камер, например системы интерстициальных 3D microperfusion13, камере с расширенной ламинарного потока и кислорода 14, система с компьютеризированной температуры управления15, поставок и многокамерные записи системы16. Поскольку эти камеры не легко строить, большинство ученых полагаться на срез коммерчески доступных камер. Эти камеры может быть установлен на систему микроскопа, таким образом позволяя для комбинации электрофизиологии и флуоресценции изображений17,18,19. Поскольку эти камеры сохранить срезы мозга, погруженной в искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО), высокий расход потока буфера решения необходимо поддерживать, увеличение за счет применения наркотиков. С этой целью мы включили системы рециркуляции перфузии с отток carbogenation, который обеспечивает достаточную стабильность для длительной записи потенциалов поля в камере фрагментов погружения с помощью относительно небольшого фаго тома. Кроме того мы кратко, как использование этой экспериментальной carbogenation/перфузии системы влияет на результат деятельности зависимых синаптической пластичности10 и как модулирует синаптическую ингибитированием киназы эукариотических удлинение фактор-2 (eEF2K) передачи20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные были сохранены в соответствии с установленными стандартами ухода за животными и процедур институтов мозга науки и государственного ключ лаборатории медицинского нейробиологии из Фудань университета, Шанхай, Китай.
1. решение подготовка
Примечание: Смотрите в таблице материалов.
- Подготовить нарезки буфера (изменение Gey раствор): 92 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 1,25 мм NaH2PO4, 30 мм NaHCO3, глюкоза 25 мм, 20 мм HEPES, 3 мм Na+-пируват, 10 мм MgSO4и 0,5 мм2CaCl.
- Отрегулируйте пэ-аш 7.6, используя 1 M NaOH без carbogenation.
- Магазин буфера при 4 ° C.
Примечание: Титрование разъясняет облачно жидкости. Осмотического давления составляет 305-310 мОсм. Карбоген21 содержит 5% углекислого газа и 95% кислорода. - Подготовьте фаго путем разбавления 10 x Стоковый раствор фаго, которые не содержат бикарбонат и глюкозы, давая окончательный состав: 124 мм NaCl, 2,5 мм KCl, CaCl 2,5 мм2, 2 мм MgCl2и 1,25 мм х2PO4.
- Добавление бикарбоната и глюкозы до 10 мм глюкозы и 26 мм NaHCO3.
- Carbogenate фаго через перфорированные кремния трубку с заблокированных конец сразу после добавления NaHCO3.
- Измерение pH во время carbogenating (рН 7,3-7.4).
Примечание: Емкость буфера может быть отрегулирован слегка изменяя количество NaHCO3. Поскольку результирующая рН зависит от температуры, необходимо проверить полученный pH при carbogenating при рабочей температуре (например, 30 ° C).
2. Подготовка острого гиппокампа фрагментов
Примечание: Смотрите в таблице материалов.
- Место ломтик Холдинг сетки в инкубации камеру для острой мозга ломтиками, заполнить камеры с фаго и carbogenate (4-6 Л/ч) для по крайней мере 30 минут22 на 28-30 ° C.
- Прохладный хирургических инструментов до 2-4 ° C.
- Место стекла стакан, наполненный холодной и carbogenated, нарезка буфера (2-4 ° C), поддерживается в смеси льда и воды, возле vibratome.
- Анестезировать крыс или мышей до роговицы рефлексы исчезают (30-50 s) с помощью изофлюрановая, приняв 500 мкл в стеклянный кувшин емкостью 2 Л или 12,5 мкл в 50 мл трубки.
- Изолировать мозга с помощью метода описано и визуализированы в деталях в публикациях Матис et al. (2011) 23 и Yuanxiang и др. (2014) 24.
- Прохладный мозг до 2-4 ° C в ледяной нарезки буфера (для по крайней мере 2 мин) до рассекает мозжечка и отделяя полушарий.
- Используйте холодную хирургическое лезвие вскрыть кусок спинной коры вдоль наспинная края каждого полушария25 получить поперечных срезов от вентральной и промежуточной части гиппокампа, под углом 70°, как показано на рисунке 1C и E.
- Шпателем холодной стоматологического цемента передать полушария кусок фильтровальной бумаги кратко сухой поверхности созданной (1-2 сек).
- Подключить два полушария с свежесрезанных поверхностей на платформе ледяной нарезки, используя быстродействующий клей клей; у хвостовой конец полушарий лица лезвие бритвы (рис. 1D).
- Место среза платформы в камеру охлаждения vibratome и заполнить эту камеру с нарезки буфера (2-4 ° C). Carbogenate с помощью перфорированных силиконовой трубки.
- Вырезать 350 мкм фрагментов с помощью адекватных vibratome параметров (например, лезвием вперед скорость: 1,2 мм/с, амплитуда Клинок: 1 мм).
- Изолировать гиппокампа формирования от subiculum и entorhinal коре, с использованием двух инъекций канюли (> 28 G) как ножницы.
- Удалите пузырьки из сетки срез Холдинг ранее подготовленных инкубации камеры с помощью пипетки Пастера.
- Передача фрагментов, которые имеют некоторые прозрачности на пласт pyramidale от платформы нарезки на сетке палаты инкубации. Избегайте любой складные, растяжения, перекрытия и плавающие, аспирационных фаго и срез в пипетку Pasteur большой рот.
Примечание: Вся процедура (шаг 2,5-2.14) может занять 5-10 мин; Таким образом важно проверить температуру буферного раствора с течением времени поддерживать его на 4 ° C. - Инкубации срезов при 30 ° C для по крайней мере в 1,5-2 ч в камере инкубации и обеспечивают Карбоген на 4-6 Л/ч.
Примечание: Отрегулируйте скорость потока Карбоген распространить буфер в инкубаторе, но запретить плавающие фрагменты.
3. изменения Carbogenation для фаго переработки небольших водохранилищ
- Добавьте соединитель 3-полосная трубки к оттоку системы рециркуляции (рис. 2B).
- Подключите средней руки соединитель 3-полосная трубки с Карбоген питания трубки и регулирования скорости потока воздуха метр (3-4 Л/ч, Рисунок 2D и рис. 4C).
- Добавьте второй соединитель 3-полосная трубки приток системы рециркуляции. Подключите средней руки к трубка, обращенная Встроенный нагреватель, плеча для тонких кремниевых трубки (длина 10 см) и нижнего рычага на трубу притока из водохранилища (НЧ-фильтр; Рисунок 4 C).
- Место для тюбиков на тонких кремниевых трубки (OD: 2 мм) на позиции вдоль трубы где пульсации фаго в зале срез, порожденных Перистальтический насос, минимален.
Примечание: Отток carbogenation (отток-карбюратора.) модификация уменьшает чувствительность на carbogenation уровне объем фаго водохранилища, фаго, показатель, переработки и относительной трубки позиций в рамках небольших фаго водохранилищ (< 50 мл; Рисунок 3). Что касается НЧ-фильтр определенное количество воздуха в тонких кремниевых трубки уменьшает пульсации потока фаго; Таким образом трубки должен быть заполнены основном с воздухом.
4.Запись синаптических ответы в камере фрагментов погружения
Примечание: Смотрите в таблице материалов.
- Предварительно теплой фаго решение на водяной бане до около 28-30 ° C (это предотвратит формирование пузырь в зале записи).
- Запуск системы рециркуляции (4-5 мл/мин) и активировать встроенный обогреватель для макроэкономическую систему для по крайней мере 1 час.
- Замачивают небольшой кусок объектив очистки бумаги и нейлоновые сетки фиксированной на U-образный провод платины в зале фрагментов погружения на несколько минут (рис. 4).
- Выньте провод платины U-образный.
- Выключить рециркуляции и Поместите кусочек на объектив, салфетки.
- Сразу же место срез Холдинг сетки поверх фрагмента, включите насос и пусть срез сбалансировать 30 мин без погружения в фаго цель.
- Заполните микропипеткой боросиликатное (т.е., запись электрода) с Фаго (совет сопротивления: 1-2 MΩ, заполнены 1/3 с фаго) и смонтировать его в держатель пипеткой.
- Проверка изоляции электрода металлический стимуляции, поместив его в NaHCO3 раствор (> 40 мм). Подключить электрод отрицательный полюс напряжения генератора постоянного тока (1-2 V, положительный полюс: серебра или платины проволока) и наблюдать образование пузырьков на кончике под микроскопом диссекции (> 60 x увеличением).
- Место испытания эпоксидной изоляцией вольфрама электрод стимуляции в держателе манипулятор и ссылка провода в зале срез.
- Добавьте второй электрод сравнения в камеру и подключите его к разъему ссылка headstage электрода записи (Рисунок 4A).
- В программном обеспечении управления усилитель нажмите на поле «нулевой режим зажим» и продолжить, дважды щелкнув поле «выходной получить список». Выберите получить «100», дважды «высокий перевал поле списка фильтров (Бесселя),» выбрать «0,1 Гц» и дважды щелкните «low pass фильтр список (AC)» выбрать «3 кГц.»
- В программное обеспечение для записи, нажмите на «получить | Открытый протокол». Выберите протокол, который имеет параметры, позволяющие эпизодических стимуляцию и оцифровка усиливается потенциалов на 10-20 кГц для 50-100 мс и что автоматически запускает стимул изолятор 10 мс после начала записи эпизодические.
- Место стимуляции и записи электродов в линии и параллельно pyramidale пласта, например (Рисунок 4B и 5).
- Нажмите кнопку «приобрести | Протокол» и затем выберите вкладку «триггер» (во всплывающем окне). Нажмите на поле «триггере источник» и выбрать «пробел», как источник триггер. Нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку «запись», чтобы начать приобретение и отмечаем всплывающее окно с кнопкой триггера.
- В программном обеспечении изолятор стимул нажмите на поле «контроля напряжения» и введите «0». Нажмите на кнопку «Загрузить». Нажмите в окне «записи программного обеспечения» и нажмите клавишу пробела. Повторяйте этот цикл, последовательно вводить значения от 1 до 8, например, на 1 mV шаги в поле «контроля напряжения».
- Коррелируют стимуляции силой с fEPSP склона значения и определяют прочность стимуляции, обязаны получить максимум 40% fEPSP-склона. Нажмите поле «управления напряжения» и введите значение определяется. Нажмите на кнопку «Загрузить».
Примечание: Стимул используется для применения краткого напряжения или импульсов тока к мозговой ткани. Двухфазные импульсы могут иметь 100 МКС на фазу. - В программное обеспечение для записи нажмите кнопку Остановить, а затем в меню «Получить». Нажмите на «Редактировать протокол» и выберите вкладку «триггер» во всплывающем окне. Нажмите на поле Источник триггер и выбрал «внутреннего таймера» как источник триггер. Нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку записи, которая запускает автоматическую запись потенциалов поля каждые 30 сек, например. Нажмите кнопку «Стоп», после 30-60 мин.
- Нажмите кнопку «Приобрести» меню, нажмите на «Открытый протокол,» выбрать желаемый индукции протокол синаптической пластичности и нажмите кнопку «ОК». Нажмите кнопку «запись» для того чтобы автоматически активировать высокой частоты стимуляции и записи. Нажмите кнопку «Стоп».
Примечание: В случае исследования, связанные с синаптической пластичности, примените один из стандартных индукции парадигмы для долгосрочного потенцирование или долгосрочной депрессии после длительного базовой записи. Типичные примеры результате модуляции синаптической передачи изображены на рис. 7 и 8 цифра. - В программное обеспечение для записи, нажмите кнопку «получить | Откройте протокол» и выберите тот же протокол как шаг 4.12. Нажмите кнопку «OK» и затем нажмите кнопку «запись». Держите автоматически работает поле потенциальных записей для 2-4 ч, например. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы прекратить запись.
- В случае фармацевтических исследований, применять соединения непосредственно к фаго водохранилище, если постоянное соединение администрация желаемого (рис. 6).
5. Очистка установки и подсказки
Примечание: Ниже приведены общие советы.
- Чистая системы каждую неделю путем переработки 10% H2O2 не более 20 мин, после стирки с дейонизированной H2O.
Примечание: Этанола не рекомендуется для очистки. Также не рекомендуется погружать ссылка провода и цель в H2O2. - Удаления осажденного соли на поверхности объектива или камеры окрестности с 0,1 N HCl, а затем водой.
- Вымойте Карбоген барботер в дистиллированной воде или 0,1 N HCl.
- Погружать зале инкубации фрагмента в 10% H2O2 для 5 мин один раз в неделю и затем тщательно промойте отсек для инкубации с дейонизированной H2O.
- В случае металлических стимуляция электродов промойте стимулирования электрода с дейонизированной водой после каждого эксперимента и осторожно протрите стимулирования электрода ватный тампон, пропитанный этанола для удаления остаточной ткани.
- Уменьшите сопротивление электродов коммерческих металлический стимуляции, удалив изоляцию на кончике через тщательно проведите с наждачной бумагой.
- Снизить потери Карбоген от фаго при рециркуляции через трубы, заменив силиконовой трубки политетрафторэтилен трубок.
- Держите серебряные провода записи электрода и электрод сравнения в отбеливатель на несколько дней в форме AgCl на поверхности проволоки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В разделе протокол мы описали подготовку острого гиппокампа фрагменты из брюшной и промежуточной части гиппокампа формирования (рис. 1) самцов мышей C57BL/6 и самцов крыс Wistar (5-8 недель). Положение полушарий на платформе среза помогает держать их стабильными и устраняет необходимость стабилизации с агар или агарозы. Сама система перфузии основана на Перистальтический насос работает на высокой ротации дать требуемый расход жидкости. Таким образом, быстрое старение стандартных труб в насос создан существенная проблема, что мы преодолели с помощью трубки-кремний (ID: 1.02 мм). Отрицательное давление для оттока также создается два подключенных параллельно трубы, имеющие внутренний диаметр 2.79 мм. Эти две трубки подключены к канюли в зале записи для аспирации жидкости (рис. 4A). Carbogenation скорость фаго в резервуаре должен быть стабильным в течение многих часов, которые могут быть трудно достичь с помощью вентиляции камни или трубы с мелкие поры. Так как отток carbogenation не полагаться на мелкие поры, скорость потока Карбоген течение времени остается стабильной (рис. 2). Если эксперименты проводятся с небольшой фаго водохранилище, отток carbogenation позволяет достигнуть равновесия растворенного кислорода (рис. 3). Кроме того он минимизирует вариабельность уровня кислорода между экспериментов на основе измененных приток/отток трубки позиции, количество активных поры на трубы Карбоген пузырь и жидкой рециркуляции.
Срез помещается на бумаге объектив, чтобы разрешить некоторые жидкие обмен снизу (рис. 4A). Поскольку фрагмент камеры может быть установлен на вертикальном Микроскоп, который оснащен 40 X цели, положение электродов может быть хорошо контролируемых (Рисунок 4B и 5). Это дополнительно уменьшает изменчивость экспериментов в повседневной работе.
Для определения прочности стимуляции, необходимых для базовой записи поля потенциал, зависимость потенциальный размер поля после стимуляции прочность должна определяться путем записи fEPSPs на сильные стороны различных стимуляции (Рисунок 5 ). Измерение характеристик ввода вывода создает некоторые стресса на срез на более сильные стимуляции. Таким образом еще один подход заключается в поиске стимуляции силой, что просто вызывает компонент всплеска положительных населения в fEPSP распад (черные стрелки на рис. 5)26.
После записи стабильной основы для по крайней мере 30 минут, можно начать лекарствами. Здесь мы представили пример эффектов ингибитор eEF2K на синаптической передачи. Торможение eEF2K способствует синаптической передачи(рис. 6),эффект, который был аттенуированных ингибирование p38 MAPK (Рисунок 6B)20.
Деятельность зависимых синаптической пластичности может быть вызвана различных парадигм стимуляции10. Здесь мы представили представитель эксперименты синаптической пластичности, которые основаны на непрерывной последовательности раздражителей на 100 Гц и на неоднократные стимуляцию на 1 Гц в течение 15 мин. Результате модуляции синаптической передачи был изображен Рисунок 7 и 8 цифра. Кроме того показано на рисунке 7 и 8 цифра стабилизации уровня кислорода небольшой буфер водохранилищ, отток carbogenation (белые кружки, уровень относительной кислорода в 24-40 мин на рис. 3) улучшение LTP и ООО индукции по сравнению с эксперименты с водохранилище carbogenation только (серые круги, уровень кислорода в 7-24 мин). Мы не проверить сочетание оттока carbogenation и водохранилище carbogenation (7-24 мин), потому что мы были заинтересованы в создании экспериментальной системы с использованием Карбоген меньше и проще. Водохранилище carbogenation с без рециркуляции (до 7 мин) представляет базовый уровень кислорода в фаго водохранилище.
Рисунок 1: Позиционирования полушарий мозга получать поперечные срезы гиппокампа, используя vibratome. (A) формирование гиппокампа указывается в боковой вид правого полушария, в зеленом, в рамках модели реконструированной мыши мозга. (B) брюшной вид формирования гиппокампа. (C) ростральной в хвостовой мнение демонстрирует раздел вентральной и промежуточной части гиппокампа формирования для правого полушария в горизонтальной плоскости. Поскольку различные регионы вдоль оси septotemporal гиппокампа имеют различные степени иннервации и функции в31,32, угол резки различных требуется для поперечных срезов спинной гиппокампа, для Пример. Шкалы бар = 3 мм (горизонтальные белые линии). (D) на снимке полушарий мозга крысы, наклеенных на платформу vibratome. Шкалы бар = 6 мм. (E) эскиз изображает угол для утески края спинной коры (Верхняя схема) разделенных правого полушария (пунктирная черная линия) и вращение (красная стрелка) клей мозг на поверхности созданный на платформе нарезки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Элементы carbogenation системы для фаго водохранилища ниже 50 мл. (A) стандартные carbogenation систем с использованием () перфорированные трубы как устройство пузырь Карбоген; трубка была перфорированный, несколько проколов с 250 мкм диаметр проволоки из нержавеющей стали. Отток carbogenation (B), (b) соединитель 3-полосная трубки (внутренний диаметр: 2 мм) или (C) Вентиляционные единицы, которая предотвращает жидкости обратного потока с гидрофобным фильтром.Средней руки соединитель 3-полосная трубка подключена к Карбоген танк после манометр (давление газа: < 1 атм) и расходомер. Остальные руки связаны в пределах фаго отток трубки. Скорость потока (D) Карбоген контролируется расходомерами. В ходе экспериментов фаго водохранилищ находятся на 28-30 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Уровень кислорода в 40 мл фаго в различных условиях. Уровень кислорода в водохранилище carbogenation (res.-карбюратора.) и рециркуляции фаго снизилась постоянно (серый заполнены круги, n = 3). Однако отток carbogenation (отток-карбюратора.) во время фаго рециркуляции уменьшить падение уровня кислорода, которая достигла равновесия на базовых уровнях (заполнены белые круги, n = 3). Базовые уровни были измерены с res. карбюратора. без фаго рециркуляции. Вертикальные пунктирные серые линии показывают переключиться в различных carbogenation протоколы. Эффекты res.-carb с утилизацией (7-24 мин) и отток карбюратора. с утилизацией (белые кружки, 24-40 мин.) на индукции LTP и LTD изображены на рис. 7 и 8 цифра. Данные представлены как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Компоненты отток carbogenation для экспериментов в камере фрагментов погружения. (A) Презентация палаты фрагментов погружения. U-образный провод платины с волокнами нейлона, холдинг ломтиком гиппокампа изображен. Серебряные провода были обернуты вокруг небольшой канюля, создавая катушки для увеличения площади окончание серебряной проволоки. Стимуляции ссылка провод был помещен в камеру отток, и ссылки на записи в основной камеры. Чтобы сохранить электрод сравнения потенциальных стабильной на различных уровнях жидкость, проволока ссылку запись можно изолировать в пластиковую трубку, оставив только «подводный» часть провода, подвергаются в буфер. (B) ярко поле изображение показывает представитель острый срез гиппокампа и электродов. СА1, CA3: Ammonis Cornu-1, 3; ДГ: зубчатой извилины; Sub: subiculum; ЕК: entorhinal коры. (C) схема освещаются основные компоненты отток carbogenation, без указания Расходомеры для Карбоген и Перистальтический насос. Фильтр низких частот могут быть размещены только в передней части встроенный обогреватель для уменьшения пульсации потока фаго. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Зависимость поля потенциальных форму после стимуляции силой и положение электродов. (A) представитель примеры поля потенциалов, вызывали на различных расстояниях от пласт pyramidale (ул. pyr.) и стимуляции сильные изображены. Горизонтальные черные стрелки указывают положительный исходный компонент населения Спайк в поле потенциальных распада. Положительный исходный компонент Спайк населения оставался примерно на середине первоначального fEPSP подъем этапа на всех протестированных электрод «in-line» позиций, за исключением одной, очень близко к тела клетки слоя (e). (Б) положение положительный исходный компонент Спайк населения различны из-за смещения электродов стимуляции и записи. Лак.: слое stratum lacunosum moleculare; RAD.: radiatum слой; Pyr.: pyramidale слой; Рекомендация: запись электрода; Stim.: электрод стимуляции. Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Пример эффектов ингибитор eEF2K на гиппокампа синаптической передачи с помощью отток carbogenation, с утилизацией небольшой фаго водохранилища20 . После записи fEPSPs интервалом 1 мин для 20 минут, eEF2K ингибитор A-484954 был добавлен непосредственно в водохранилище Фаго (горизонтальная линия). Быстрое увеличение синаптической передачи было обнаружено (заполнены белые кружки). Если препарат не был применен, fEPSP склон за время записи (серый заполнены круги) оставалась стабильной. (B) применения ингибитора p38 MAPK (серая горизонтальная линия) помешали eEF2K inhibito-индуцированной укрепление потенциалов поля. Данные представлены как среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: Представитель записи активности зависимых потенцирования синаптической передачи с помощью оттока carbogenation (отток-карбюратора.; белые кружки) и водохранилища carbogenation (res.-карбюратора.; черные круги), с утилизацией небольшой фаго водохранилище. Потенцирование была индуцированных после того, как время точка 0 по три раза 100 Гц/s поезда (тет.: тетанизацией, высокой частоты стимуляции). Данные представлены как среднее ± SEM. кронштейн: Статистическое сопоставление групп на момент времени; непарные T-теста, не предполагая последовательно стандартное отклонение. * p < 0,05.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8 : Зависимость активности зависимых депрессии синаптической передачи после стимуляции силой и carbogenation. (A) с помощью водохранилище carbogenation (res.-карбюратора.) с утилизацией большого фаго тома, 1 Гц стимуляции для 15 мин на 80% максимальной fEPSP-склона вызвали сильную депрессию синаптической передачи (кружки). Однако как представитель fEPSP следы до (черный след) и после (красный след на 110й мин) LTD индукции указывают, волейбол Пресинаптический волокна (вертикальная чёрная стрелка) значительно сократилось. Это пример, указывающий, что электрохимических процессов на электрод стимуляции может нанести вред афферентов, вызывая депрессию, которая частично не полагаться на механизмы, связанные с ООО. Снижение прочности стимуляции до 50% от максимальной fEPSP склон индуцированной депрессии синаптической передачи в меньше степени, но без изменения Пресинаптический волокна волейбол (серый заполнены круги). (B) LTD индукции не вызывает прочного депрессии fEPSP склоны в экспериментах с водохранилище carbogenation и переработка небольшой фаго водохранилище (res.-карбюратора.; Грей заполнить квадраты). (C) отток carbogenation с утилизацией небольшой фаго водохранилища улучшить результаты ООО индукции. Вставки в настоящее время представитель fEPSPs перед (черные следы) и после (110й мин, красные следы) LTD индукции. Для представителя fEPSPs, вертикальный масштаб бары указывают 1 МВ и горизонтальный масштаб баров соответствуют 2 г-жа данные были получены из острой гиппокампа ломтиками (350 мкм) от 1 до 2 месяцев старых мышей C57/BL 6 и представлены как среднее ± скобки SEM. : Статистическое сопоставление групп на момент времени; непарные T-теста, не предполагая последовательно стандартное отклонение. * p < 0,05, НС: незначимая. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя интерфейс ломтик камеры более надежные синаптических ответы25,26,27,28, погружения камеры обеспечивают дополнительное удобство для записи патч зажим и флуоресценции обработки изображений. Таким образом мы описали несколько аспектов потенциальных записей поля в острой гиппокампа ломтики с использованием коммерческих погружения ломтик палаты, который может быть легко расширен для визуализации флуоресценции зондов в нейроны17,18, 19. Помимо подготовки срез25поддержание постоянной Карбоген уровня в зале записи после многих часов представляет собой одно из препятствий. Поскольку уровень Карбоген контролируется только первоначального насыщенностью фаго водохранилища, различия в уровне кислорода в фаго легко получаются в повседневной экспериментов. Таким образом, кислорода метр рекомендуется ускорить устранение неполадок и настроить условия (например, температуры, скорости потока Карбоген, carbogenation инструменты и фаго рециркуляции) для достижения по меньшей мере 28 мг/Л кислорода в фаго водохранилище в конюшне уровнях. Кроме того обычной практикой, чтобы изменить размер контейнера фаго для применения препарата может вызвать эффекты на потенциалов поля из-за различия в уровнях их Карбоген.
Использование отток carbogenation небольшого объема переработки буфера улучшить результаты экспериментов синаптической пластичности. Улучшенная растворении кислорода в жидкости основана на большие соотношения между площадь контакта жидкости и Карбоген. Кроме того отток carbogenation сокращает поставки истощены Карбоген фаго фаго водохранилище. Стабильность carbogenation может усовершенствовать на специально Вентури, основанный на принципе коммерческих продуктов29.
Даже с лучший кусочек подготовки и условий установки часто бывает неизбежным, что потенциалов поля не может быть наведено, когда используются электроды изолированные металлический стимуляции. Часто причина, что изоляция повреждена из-за изгиба или очистки. Как мы указали в методах, простой подход заключается в проверке формирования пузыря на низкое напряжение. Кроме того этот шаг помогает очистить кончик и уменьшить импеданс электродов стимуляции. Использование пипетки стеклянные для стимуляции является общим и имеет преимущество, обеспечивая более узкий поле волокна стимуляции. Часто это не можно найти максимальное fEPSP склона, когда стеклянной пипетки стимуляции используется. Появление позитивных исходного компонента населения Спайк в фазе fEPSP распада может затем использоваться для регулировки силы стимуляции23.
Может публикации в отношении индукции активности зависимых синаптической пластичности и участия различных сигнальных путей, зависит от протокола прикладной индукции, доступны10. Однако с методологической точки зрения, высокой частоты стимуляции могут вызвать различные артефакты, которые могут предотвратить успешное индукции синаптической пластичности. Повторные 100 Гц/1 s стимуляции может привести к поляризации электродов стимуляции или электрохимические реакции30, что приводит к депрессии синаптической передачи из-за повреждения афферентов (см. рис. 8 для примера). Чтобы свести к минимуму электрохимических процессов, рекомендуется использовать двухфазные импульсы стимуляции и стимуляции мощности не более чем 2 V для базовых записей.
В целом отток carbogenation помогает стабилизировать уровень кислорода в экспериментах, которые полагаются на рециркуляции небольшой буфер водохранилища, повышение затрат эффективности препарата экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
W.W. провела, проанализированы и разработали экспериментов и написал рукопись. D.X. и К.П. помощь в подготовке рисунок и экспериментов. Эта работа была поддержана NSFC (31320103906) и 111 проекта (B16013) т.б.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
