Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

الأسفار بوساطة التصوير المقطعي للكشف والتحديد الكمي لالتهاب الأمعاء مورين المتصلة بلعم

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/55942
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

Summary

تحقيقات محددة الهدف تمثل أداة مبتكرة لتحليل الآليات الجزيئية، مثل تعبير البروتين في أنواع مختلفة من الأمراض (مثل التهاب وعدوى توموريجينيسيس). في هذه الدراسة، يصف لنا إجراء تقييم كمي تمجربهك ثلاثي الأبعاد لتسلل بلعم المعوية في نموذج مورين من التهاب القولون باستخدام التصوير المقطعي الأسفار بوساطة خاصة-F4/80.

Abstract

نماذج مورين من المرض لا غنى عنها للبحث العلمي. ومع ذلك، لا تستخدم العديد من الأدوات التشخيصية مثل التنظير أو تصوير تمجربهك بشكل روتيني في نماذج حيوانية. قراءات التجريبية التقليدية غالباً ما يعتمدون على التحليلات بعد الوفاة و السابقين فيفو ، الذي منع فحوص المتابعة داخل الفرد وزيادة عدد الحيوانات الدراسة المطلوبة. الأسفار بوساطة التصوير المقطعي يمكن التقييم غير الغازية، المتكررة، والكمية، وثلاثي الأبعاد من المسابر الفلورسنت. وهي حساسة للغاية ويسمح باستخدام صانعي الجزيئية، مما يسمح بكشف محددة ووصف أهداف جزيئية متميزة. على وجه الخصوص، والمسابير المستهدفة تمثل أداة مبتكرة لتحليل التعبير الجيني التنشيط والبروتين في التهاب، أمراض المناعة الذاتية، والعدوى، وأمراض الأوعية الدموية، الهجرة الخلية، توموريجينيسيس، إلخ. في هذه المقالة، نقدم إرشادات خطوة بخطوة على هذا تكنولوجيا التصوير المتطورة للكشف في فيفو وتوصيف لالتهاب (أي تسلل بلعم F4/80-إيجابي) في نموذج مورين مستخدمة على نطاق واسع من التهاب الأمعاء. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية في مجالات البحث الأخرى، مثل تتبع الخلية أو الخلايا الجذعية محصنة.

Introduction

نماذج حيوانية تستخدم على نطاق واسع في البحوث العلمية، ووجود العديد من الإجراءات غير الغازية لرصد المرض النشاط والحيوية، مثل التحديد الكمي لتغيرات وزن الجسم أو تحليل الدم والبول والبراز. ومع ذلك، هذه هي فقط المعلمات البديلات غير المباشرة التي تخضع أيضا للتباين بين الأفراد. أنهم كثيرا ما يجب أن تكملها بعد الوفاة من تحاليل لعينات الأنسجة، مما يمنع المسلسل من المراقبة في نقاط زمنية متكررة ومباشرة عمليات المراقبة الفسيولوجية أو المرضية في فيفو. ظهرت تقنيات التصوير المتطورة في الحيوانات الصغيرة، بما في ذلك عبر التصوير المقطعية والتصوير الضوئي، والتنظير، التي تمكن من التصور مباشرة لهذه العمليات ويسمح أيضا لإجراء تحاليل متكررة ل الحيوانات نفس1 , 2 , 3. بالإضافة إلى ذلك، إمكانية رصد متكررة الولايات المختلفة للمرض في الحيوان نفسه قد يخفض عدد الحيوانات اللازمة، والتي قد يكون من المستصوب من وجهة نظر أخلاق حيوانية.

توجد عدة تقنيات التصوير الضوئي مختلفة للتصوير في فيفو الأسفار. في الأصل، كان يعمل تصوير [كنفوكل] لدراسة الأحداث الفلورسنت السطحية والجوفية4،5. ، ومع ذلك، تمجربهك الأنظمة التي تسمح لتقييمات كمية الأنسجة ثلاثية الأبعاد في الآونة الأخيرة نمواً6. وقد تحقق من خلال وضع المسابر الفلورسنت التي ينبعث منها الضوء في الطيف (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، تقدم الاستيعاب منخفضة وأجهزة حساسة للكشف عن مصادر الضوء أحادي اللون7. بينما تقنيات التصوير كروسسيكتيونينج التقليدية، مثل التصوير المقطعي (CT) أو التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة)، يعتمد معظمها على البارامترات الفيزيائية وتصور مورفولوجيا، يمكن توفير تصوير بصري معلومات إضافية على العمليات الجزيئية الكامنة وراء استخدام الفلورية داخلية أو خارجية يسبر8.

التقدم في علم الأحياء الجزيئي ساعدت على تسهيل توليد المسابر الجزيئية الفلورسنت ذكية وهادفة لعدد متزايد من الأهداف. على سبيل المثال، بوساطة مستقبلات الامتصاص والتوزيع في منطقة مستهدفة معينة يمكن تصور استخدام الأجسام المضادة المسمى مشتق كاربوسيانيني9. الوفرة من الأجسام المضادة المتاحة، التي يمكن أن يكون المسمى لتؤدي وظيفة معينة تتبع في مناطق لا يمكن الوصول إليها إلا من الجسم، ويقدم أفكاراً لم يسبق له مثيل في العمليات الجزيئية والخلوية في نماذج توموريجينيسيس والأعصاب، 7من أمراض القلب والأوعية الدموية والمناعية والالتهابات.

في هذه الدراسة، يصف لنا استخدام التصوير المقطعي بوساطة fluorescence في نموذج مورين من التهاب القولون. كبريتات الصوديوم ديكستران (DSS)-التهاب القولون المحرض هو نموذج مستحث كيميائيا ماوس قياسية لالتهاب الأمعاء يشبه التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين)10. أنها مفيدة بشكل خاص لتقييم مساهمة نظام المناعة الفطرية لتطوير التهاب الأمعاء11. منذ تعيين والتنشيط، وتسلل وحيدات والضامة تمثل خطوات حاسمة في الآلية المرضية لبنك التنمية بين الأمريكتين، التصور لتجنيدهم والحركية من تسلل ضرورية للرصد، على سبيل المثال، أثر المواد العلاجية المحتملة في إعداد السريري12. ونحن تصف تنظيم دورات تعريفية لالتهاب القولون DSS وإثبات وصف التصوير المقطعي بوساطة بلعم تسلل إلى الغشاء المخاطي للقناة الهضمية استخدام التصوير المقطعي fluorescence الجزيئية لتصور محدد لعلامة الوحيدات/بلعم F4/80 13-وبالإضافة إلى ذلك، نحن لتوضيح الإجراءات الإضافية والتكميلية، مثل وضع العلامات جسم؛ الإعداد التجريبية؛ وتحليل وتفسير الصور التي تم الحصول عليها، وفي ترابط مع قراءات التقليدية مثل مؤشرات نشاط المرض، التدفق الخلوي والتحليل النسيجي، وإيمونوهيستوتشيميستري. نحن مناقشة القيود المفروضة على هذا الأسلوب ومقارنات بطرائق أخرى للتصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ووافق جميع التجارب على الحيوانات für لانديسامت Natur، أومويلت und فيربراوتشيرشوتز (لانوف) نوردراين-فيستفالن وفقا "قانون حماية الحيوانات الألمانية" (تيرشوتزجيسيتز).

1-المواد والإعداد التجريبية

  1. رعاية الحيوان.
    1. استخدام الفئران مطابقة الجنس والسن من أي سلالة DSS عرضه (مثلاً، C57BL/6) في وزن الجسم ز 20-25.
    2. خطة الفئران على الأقل خمسة أو أكثر من كل مجموعة تجريبية وبيت الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية للرعاية الحيوانية المحلية.
    3. تقدم تشو القوارض قياسية النظام الغذائي ومياه الشرب يعقم libitum الإعلانية.
    4. إزالة تشاو القياسية واستبدله تشاو خالية من البرسيم قبل ثلاثة أيام على الأقل من قبل المسح الضوئي للحد من اندولومينال السيارات-الأسفار.
  2. التعريفي لالتهاب القولون الحاد الناجم عن مفاجآت.
    1. حل ز 2 من مفاجآت صيف دبي (الوزن الجزيئي ~ 40,000 دا) في 100 مل يعقم مياه الشرب للحصول على نسبة 2% (w/v الحل).
    2. تعبئة إمدادات مياه الشرب للفئران حصرا بحل إدارة السلامة والأمن وتقدير 5 مل سائل كل الماوس لليوم الواحد. توفير مياه الشرب نفسه دون مفاجآت ل الفئران التحكم10.
      ملاحظة: رصد الفئران يوميا حتى نهاية التجربة. Euthanize الفئران التي تفقد أكثر من 20% وزن الجسم الأولية أو التي أصبحت تحتضر (أي، إصرار متحدب الموقف، وانخفاض حركة، احتملت التنفس، نصب ملحوظ معطف) وفقا للمبادئ التوجيهية المطبقة المحلية على الحيوان الرعاية.
  3. إعداد الأسفار بوساطة التصوير المقطعي.
    1. تسمية جسم المطلوب (مثل الفئران المضادة الماوس F4/80) مع صبغ الفلورية (مثلاً، Cyanine7، λالإثارة: 750 nm, λالانبعاثات: 776 nm) كما هو موضح في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. دياليزي جسم المنقاة في غشاء الديال مناسبة (حجم المسام < كاتشين 50-100) ضد 1 لتر كلوريد الصوديوم 0.15 متر على الأقل 2 ح أو بين عشية وضحاها.
      1. نقل الجسم إلى 1 لتر من 0.1 م ناكو3 ودياليزي على الأقل ح 2.
      2. يحل المبلغ المطلوب من صبغة الفلورسنت في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) (10.8 ميليلتر/مغ من الأجسام المضادة) وإضافتها إلى الحل الأجسام المضادة. استخدام صبغة الفلورسنت في برنامج الزائدة المولى لتحقيق نسبة الصبغة للبروتين من 1:3.
      3. احتضان في الظلام عند 4 درجة مئوية حاء 1 إزالة الأجسام المضادة غير مسمى بالغسيل الكلوي ضد 1 ل م 0.15 الصوديوم أو باستخدام عمود desalting PD-10 وحل في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) للتطبيق في فيفو .
      4. تحديد تركيز الأجسام المضادة النهائية ونسبة وضع العلامات التي كانت.
      5. قياس تركيز البروتين في استيعاب 250-330 نانومتر والنظر في امتصاص إضافية بواسطة الصبغة. تصحيح امتصاص الحد الأقصى في 280 نانومتر (البروتين) بنسبة 11% لاستيعاب الحد الأقصى في 750 نانومتر (الخطوة التالية) لوصف Cyanine7.
      6. قياس إضعاف المجمع (عادة 01:10) في 250-800 نانومتر واستخراج تركيز Cyanine7 في 750 نانومتر.
      7. تحديد نسبة الصبغة للبروتين ك: صبغ/جسم = استيعاب الحد الأقصى في 750 nm/200,000/(استيعاب الحد الأقصى في 280 nm-0.11 × امتصاص ماكس في 750 nm)/170,000.
      8. يبقى الحل جسم عند 4 درجة مئوية وأبعادها عن الضوء لتجنب تبيض قبل الحقن.
    2. تحميل حجم الحل الأجسام المضادة اللازمة في المحاقن معقمة مباشرة قبل الحقن ودرع من الضوء حتى يتم استخدامه.
    3. تحديد التوقيت الأمثل لحقن التحقيق وإجراءات المسح، اعتماداً على الراسم الدوائية.
    4. تخدير الفئران استخدام isoflurane 1.5-2.5% استنشاق الأوكسجين أو وضعها بشكل أمن في ريسترينير مخصصة لحقن الوريد الذيل من الأجسام المضادة المسماة.
    5. لأجسام كاملة الطول، حقن ح جسم المسمى مالا يقل عن 24 قبل المسح، مثل الماوس المضادة F4/80 بلعم التصور في القولون مورين. حقن الفئران عن طريق الوريد (رابعا) عن طريق الذيل الوريد مع الأجسام المضادة المسماة بمبلغ مماثل نمول 2.0 لصبغ.
    6. استخدام نفس القدر المسمى الأجسام المضادة غير محدد (مثل الفئران مفتش أو آخر ايستب المقابلة لتراث جسم الابتدائي) كعنصر تحكم ايستب في جرعات مساوية لتلك التحقيقات الخاصة.
      ملاحظة: تفحص النتائج في فيفو بعد الحقن في عنصر التحكم المجمع يمكن أن تخدم كمرجع لتفسير المسبار محددة تصوير البيانات.
    7. استخدام حلاقة الكهربائية حلق فرو الحيوانات في منطقة البطن للتقليل من انعكاس الضوء والاستيعاب.

2-المعدات

  1. استخدام جهاز التصوير المقطعي بيطرية بوساطة الفلورية (FMT) للأسفار الحيوانات الصغيرة ( الشكل 4).
  2. إنشاء إجراء دراسة جديدة لكل مشروع عن طريق النقر فوق "دراسة جديدة" زر، وتشمل في وصف الدراسة تتبع ذات الصلة، بما في ذلك تصوير المعلمات وجرعات للرجوع إليها في المستقبل.
  3. ضمن هذه الدراسة، إنشاء مجموعات الدراسة وفقا لتصميم الدراسة الخاصة بكل منها (مثلاً، للتتبع محددة ومراقبة ايستب غير محدد) بواسطة النقر فوق "فريق الدراسة الجديدة" الزر. تجهيز كل فريق الدراسة بعدد كل من الحيوانات.
  4. معايرة نظام بنيات الراسم.
    1. إجراء المعايرة لكل دفعة من تتبع لتطبيع للتباين في وضع العلامات والتمكين من قياس كمية من البيانات منظمة أوكسفام الدولية.
    2. اتبع إرشادات الشركة المصنعة أداة لمعايرة كل نظام الفردية؛ عند اختيار "إضافة جديدة التتبع"، سيوفر هذا النظام دليل من خلال الخطوات. توفير تمييع الحل جسم التطبيقية وتركيز المطلق المحسوبة للتتبع في التحقيق.
    3. لإنتاج المواد الانشطارية، استخدام الوهمية محاكاة الأنسجة لمعرفة خصائص سمك والاستيعاب (تشبه الأنسجة الحيوية) وملئه بحجم معين من الحل جسم المستخدم. هذا التدبير على الجهاز معاهدة المواد الانشطارية.
      ملاحظة: النظام سيستخدم قياس مرجعية التحقيق المقدمة، إلى جانب تركيز معين، لحساب تركيزات الراسم المطلقة من المستقبل في فيفو القياسات.
  5. استخدام شريط فحص هياتابل مع درجة حرارة 42 درجة مئوية.
    ملاحظة: وهذا ما يمنع الفئران من أن يصبح باردا أثناء الفحص.

3-الحيوان التخدير

  1. استخدام دفق مستمر من 1.5-2% المجلد % إيسوفلوراني ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) و 1.5 L O2دور/دقيقة تخدير الفئران.
استخدام أنظمة استنشاق المصممة خصيصا للقوارض التخدير (isoflurane المبخر) بسهولة التحكم في عمق التخدير والتقليل من التعرض للموظفين.
  • ضع الماوس في قاعة تعريفية مانعة للتسرب وقم بتشغيل المرذاذ لتوريد إيسوفلوراني (100% (v/v)، المجلد 5% في الأوكسجين، 3 لتر في الدقيقة). رصد الماوس حتى وراقد وفاقد الوعي.
  • وضعه في كاسيت الفحص للتصوير المقطعي، مع استنشاق isoflurane المستمر عبر مخروط الآنف بجرعة 100% v/v، 1.5% المجلد في الأوكسجين، 1.5 لتر في الدقيقة لتقليل حركة المصنوعات اليدوية أثناء الفحص. إجراءات تدوم فترة أطول من مدة 5 دقائق، لتطبيق مرهم العين لعيون الماوس لمنع تلف القرنية.
  • تقييم عمق التخدير عن طريق التحقق من ردود الفعل. وضع الماوس على ظهرها؛ إذا كان التخدير كافية، يجب عدم تشغيل الماوس. قرصه الماوس بهدوء بين أصابع لها؛ إذا كان التخدير كافية، لن تكون الساق سحب (مرحلة التسامح الجراحية).

    • 4-الأسفار بوساطة التصوير المقطعي المسح الضوئي

    ملاحظة: التكيف مع التفاصيل التالية، وخاصة بنظام معاهدة المواد الانشطارية المستخدمة في هذه الدراسة (انظر الجدول للمواد) لأجهزة التصوير الانعكاس fluorescence بديلة أو نظم معاهدة المواد الانشطارية، حسب الحاجة.

    1. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على ظهرها في كاسيت الفحص.
    2. إجراء المسح الضوئي.
      1. إدراج الكاسيت في نظام التصوير وإغلاقه فورا لضمان استمرار التخدير. حدد عينة مناسبة من فريق الدراسة التي تم إنشاؤها مسبقاً. حدد التتبع التي تدار من القائمة المنسدلة التأكد من أنه يتم حساب قيم تركيز التتبع بشكل صحيح.
      2. الحصول على صورة الانعكاس fluorescence في الطول الموجي المناسب (720 نانومتر ل Cyanine7) لمسح التخطيط ومخطط الحقل المسح الضوئي عن طريق النقر فوق الزر "الحصول على الصورة".
      3. نرى أن يظهر الحقل المسح الضوئي كتراكب في صورة الانعكاس الأسفار. ضبطه في المنطقة لمصلحة (مثل القولون أو البطن)، تجنب الهواء أو مجالات الفراء المتبقية. اعتماداً على الصورة المستهدفة، تعيين عدد الصورة نقاط البيانات في مجال المسح الضوئي باختيار من الخشنة قرار المسح الميداني المتوسطة وغرامة في القائمة على اليمين.
        ملاحظة: الاحتفاظ في الاعتبار أن حقل مسح غرامة قد توفر أفضل المكانية القرار على حساب وقت مسح لم يعد إلى حد كبير.
      4. بدء الحصول على البيانات/الصور في الطول الموجي المحدد بواسطة النقر فوق "مسح".
        ملاحظة: سيتم وقت المسح الضوئي لمسح المتوسطة-غرامة من البطن كله حوالي 5 دقيقة؛ في هذا الوقت، كل نقطة بيانات مضاءة بشكل منفصل بالليزر الإثارة، وتسجل الأسفار الناتجة عن ذلك.
      5. إزالة الحيوان من الكاسيت التصوير في نهاية المسح الضوئي والسماح للحيوان للتعافي تماما قبل وضعه مرة أخرى إلى القفص.
      6. كرر معاهدة المواد الانشطارية إذا اقتضت الضرورة في نقاط زمنية مختلفة خلال التجربة (مثلاً، أيام 0، 5، و 9-10 (نهاية التجربة))، ولكن النظر في تراكم الأجسام المضادة في الجسم، وبالتالي زيادة إشارة fluorescence الخلفية.

    5-بعد انتهاء المسح الضوئي

    1. ضع الماوس في قفص منفصل على منشفة ورقية تحت مصباح الضوء الأحمر الاحترار ورصد الماوس لعلامات عدم الراحة أو الشدة حتى الشفاء التام. ضع الماوس مرة أخرى إلى قفصة كل منهما عند مستيقظا تماما.
    2. Euthanize الفئران في نهاية التجربة بتسليم CO2 إلى المعزل بجرعة 100% (v/v) و 100 المجلد %، و 3 لتر في الدقيقة. لا قبل ملء الدائرة مع شركة2، كما قد تسبب تعرض مفاجئ لتركيزات عالية من أول أكسيد الكربون2 الشدة. التحقق من الوفاة بعد توقف الماوس التنفس واسطة ثانوية لاحقة من القتل الرحيم مثل التفكك السريع عنق الرحم.
    3. Explant القولون بفتح البطن البطن وإجراء فحص السابقين فيفو القولون اكسبلانتيد، كما هو موضح في الخطوات 4.2.1-4-2-4. فتح كل القولون طوليا باستخدام مقص جراحي ميتزينبوم وشطف جيدا بالمحلول الملحي قبل إعدادها لمزيد من التحليل.
    4. استخدام مشرط لقطع جزء من 0.5 سم من القولون القاصي ثم ضعه مباشرة في أنبوب 1.5 مل مبردة. تجميد في النتروجين السائل ومخزن في-70 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى (مثلاً،القياسات ميلوبيروكسيداسي (الخطة الرئيسية للعمليات)).
    5. استخدام عصا خشبية والإظهار المتبقية طوليا فتح نقطتين من القاصي إلى نهاية الدانية، مع الخارج الغشاء المخاطي ("تقنية رول السويسرية")، لإجراء تحاليل نسيجية. مكان الإعداد في مثبت (انظر الجدول للمواد)، وتجميد في-80 درجة مئوية14.

    6-الإعمار البيانات وتفسيرها

    1. استخدم أداة إعادة الإعمار من برامج التصوير الخاصة بكل منها لإنشاء خرائط ثلاثية الأبعاد لتوزيع الأسفار من البيانات الخام التصوير؛ يتم تحديد مسح يتم إضافتها تلقائياً إلى أداة إعادة الإعمار، عند بناء على المسح، الوظيفة "إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار".
      1. خلاف ذلك، حدد التفحص من القائمة المنسدلة تحت الدراسة الخاصة بكل منها ودراسة مجموعة، انقر بالزر الأيمن المسح الضوئي، وحدد "إضافة إلى إعادة الإعمار".
    2. لمزيد من التحليل، تحميل مجموعة البيانات إلى برمجيات التحليل. من القائمة المنسدلة في الشريط العلوي، حدد الدراسة الخاصة بكل منها وحدد فريق الدراسة والحيوان الفردية من القائمة على اليمين؛ سيظهر كل مسح أجرى لهذا الحيوان. حدد التفحص الصحيح ثم انقر فوق "تحميل".
      ملاحظة: سوف تظهر إعادة توزيع الراسم 3D على اليسار كتراكب الصورة الانعكاس fluorescence المكتسبة في البداية. يمكن استدارة الطراز وتضخيم لتحليل أسهل.
    3. تحديد بؤر تراكم التسمية غير محدد (مثلاً المثانة الكبد أو البول) في مخططات ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها وتمييزها عن الأنسجة المستهدفة (مثل الأمعاء أو الأمعاء).
    4. من الشريط العلوي، قم بتحديد الشكل عائد الاستثمار الأكثر ملاءمة لهذا الهدف. التسمية الأنسجة المستهدفة كمناطق للفائدة (ROI) بوضع أدوات القياس الخاصة بكل منها في تحليل البرمجيات؛ سيوفر البرنامج شدة الأسفار للعائد على الاستثمار، فضلا عن (بيكو-) المبالغ المولى للتتبع التي قد تم معايرة الفحص ل.
    5. تحديد المبلغ الإجمالي للتتبع في العائد على الاستثمار المناسبة، تطبيع لحجم العائد على الاستثمار، بما يعادل الأكثر مناسبة لتقييم نشاط المرض في ترابط مع ارتشاح التهابي (علم الأنسجة).
      ملاحظة: يمكن اختيار الميزات الأخرى من العائد على الاستثمار إذا كان ذلك مناسباً كممثل لنموذج معين.

    7.السابقين فيفو تحليلات

    1. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ وتلطيخ الفلورة.
      1. ديبارافينيزي المقاطع بوضعها في الإيثانول 70% (EtOH) لمدة 2 دقيقة؛ شطف مع الماء المقطر بعد ذلك. وصمة عار مع الحل توضع لمدة 5 دقائق وبعد ذلك الشطف بماء الصنبور الحار لمدة 10 دقائق.
      2. شطف مع الماء المقطر، كونتيرستين مع الحل ثم لمدة 2 دقيقة، ويشطف مرة أخرى بالماء المقطر.
      3. مكان في 70% EtOH، 96% EtOH 99% EtOH وزيلين نفط (2 مرات) لكل يذوي ومسح المقاطع 2 دقيقة. جبل مع تصاعد راتنجية المتوسطة.
    2. تلوين الفلورة.
      1. استخدام مقاطع الأنسجة التي تم الحصول عليها سابقا ("رول السويسرية") لتلطيخ الفلورة وإعداد أقسام قطع البرد من 7 ميكرومتر.
      2. كتلة أقسام القولون ثابتة الأسيتون والمجمدة في مصل الجرذان 5.0 في المائة لمدة 10 دقائق، واحتضان بين عشية وضحاها مع (1/500 v/v) المخفف بيوتينيلاتيد الفئران الابتدائي الماوس المضادة F4/80 جسم. تغسل الأجزاء ثلاث مرات في تريس مخزنة المالحة (تبس) واحتضان مع ستريبتافيدين-فيتك (1: 100 v/v) في برنامج تلفزيوني/جيش صرب البوسنة (0.1% w/v) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      3. أغسل المقاطع في تبس ووصمة عار مع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1: 1000 v/v) لتحقيق التباين. تحليل الصور الأسفار تحت مجهر [كنفوكل] (انظر الجدول للمواد؛ 40 x التكبير؛ تصفية مكعب N2.1 مع تصفية الإثارة 515-560) وحساب الخلايا F4/80-الإيجابية في كل حقل عالية الطاقة.
        ملاحظة: حاول استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ نفسه وتنسيق عند الجمع في فيفو معاهدة المواد الانشطارية و بعد الوفاة علم الأنسجة التحليلات مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو تلطيخ الفلورة، تبعاً للهدف المقصود. واستخدمت للكشف عن F4/80-إيجابية الضامة في فيفو و السابقين فيفو، بأشكال مختلفة.
    3. الخطة الرئيسية للعمليات القياسات في عينات القولون.
      1. استخدام الحصول عليها طازجة، برنامج تلفزيوني تشطف العينات القولون أو العينة المذابة للقياسات الخطة الرئيسية للعمليات. وزن جميع العينات ومجانسة الأنسجة في تحلل المخزن المؤقت المنصوص عليه في ELISA كيت (انظر الجدول للمواد) في وحدة تخزين من 20 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل كل مغ أنسجة.
      2. Sonicate لمدة 15 ق (التردد سونيكيشن: 20 كيلوهرتز، السلطة: 70 ث) والطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 200 × ز و 4 درجة مئوية.
      3. استخدام طقم أليسا متاحة تجارياً (انظر الجدول للمواد) وفقا لوصف السلع المصنعة. القيام بالاختبار في التكرارات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    تقييم التهاب القولون:

    التهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي هو نموذج موريني مستحث كيميائيا من التهاب الأمعاء الذي يشبه الإنسان بنك التنمية بين الأمريكتين ويؤدي إلى فقدان الوزن ونزيف المستقيم وتقرح سطحي وتلف الأغشية المخاطية في الفئران المعرضة15. أنها مفيدة بشكل خاص لدراسة مساهمة نظام المناعة الفطرية لتطوير التهاب الأمعاء10،11. أظهرت حمل التهاب كوليتيك، كانت الفئران باستمرار التي تديرها إدارة السلامة والأمن في جميع أنحاء هذه التجربة. واستخدمت كالمؤشرات السريرية لالتهاب تناقص وزن الجسم والدم الخفي في البراز. كما هو موضح في الشكل 1A، بدأت الفئران فقدان الوزن ابتداء من اليوم الرابع بعد تقلد التهاب القولون، بينما الحيوانات التحكم تلقي المياه وحدها لم تظهر أي تغييرات كبيرة في وزن الجسم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الحيوانات كوليتيك زيادة إفراز الدم الخفي بالبراز (الشكل 1B)، وفقا لتقييم استخدام hemoccult التالية في سجل النظام: 0 (لا الدم)، 1 (إيجابية hemoccult) و 2 (نزيف بيليه الإيجابية والبصرية hemoccult) 4 ( الإجمالي لنزيف الدم حول فتحه الشرج)16. وتم قياس طول القولون لتقييم تقصير colonic الناجمة عن التهاب، الكشف عن نقطتين مختصرة إلى حد كبير في الفئران كوليتيك مقارنة بالفئران التحكم تلقي المياه وحدها (الشكل 1). لتقييم الأضرار colonic مباشرة، أجرى التحليل النسيجي في نهاية التجربة. وأجرى تقييم كمي للأضرار غذائها على ح colonic & الملون ه الأقسام أساسية إصابة الإجمالية استخدام استناداً إلى درجة ومدى الالتهاب، والضرر سرداب ومشاركة نسبة17. الفئران كوليتيك علامات الالتهاب الحاد، في حين أظهرت الفئران التحكم تلقي لا مفاجآت أية أضرار نسيجية (الشكل 1). إظهار الصور المميزة التغييرات المثيرة في القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي، تتميز بتدمير بنية الظهارية، مع فقدان خلايا قدح وسرداب الأضرار وتقرح الأغشية المخاطية، عكس إلى حد كبير الحفاظ على الأغشية المخاطية الهندسة المعمارية في مكافحة الفئران18. الفروق الإحصائية بين المجموعات (n = 5 كل مجموعة) حسبت بتحليل التباين (ANOVA) يتبع بالطالب-نيومان-كولس (S.N.K.) الوظيفة المخصصة اختبار أو اختبار وولش تليها هويل ألعاب اختبار وظيفة المخصص في حالة إينهوموجينيتي الفرق كبير. فقيمه < 0.05 اعتبرت هامة.

    تقييم الوحيدات وتجنيد بلعم:

    كما يرتبط التهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي مع تسلل الخلايا المناعية، مثل وحيدات والضامة، إلى أن الغشاء المخاطي وسوبموكوسا من القولون، استخدمنا تلطيخ إيمونوفلوريسسينت لعلامة الوحيدات/بلعم F4/80 للتحديد الكمي التغلغل. وأظهرت الفئران كوليتيك تلقي DSS أرقام مرتفعة إلى حد كبير من وحيدات اختراق جدار القولون بالمقارنة مع الفئران التحكم غير كوليتيك (الشكل 2A). وكان كمياً تسلل الكريات البيض بالإضافة إلى ذلك استخدام صبغة إيمونوفلوريسسينت لعلامة العَدلات GR1، يكشف عن هجرة العَدلات زيادة كبيرة في القولون ملتهبة بالمقارنة مع مكافحة الفئران (الشكل 2). لتأكيد، الخطة الرئيسية للعمليات كانت المستويات التي تعكس كل نشاط التحريضية وعدد العَدلات مرتفعة إلى حد كبير في أنسجة القولون من الفئران كوليتيك (الشكل 2). ANOVA واختبار الوظيفة المخصصة S.N.K. استخدمت لحساب الدلالة الإحصائية بين المجموعتين (n = 5 كل مجموعة). تم تعيين دلالة إحصائية في ف < 0.05.

    تغييرات منهجية في يتدنى بلعم:

    وحيدات الماوس تشمل مجموعة غير متجانسة من الفئات السكانية الفرعية المميزة التي تختلف في حالة نضج وقدرتها على تجنيد للمواقع الملتهبة، حيث يشاركون في استهلال وإدامة استجابة التحريضية19 . ولذلك، نحن تتميز وحيدات الدم عن طريق تحليل التعبير التفاضلية من CD11b و Ly6C باستخدام التدفق الخلوي. ظل الحاد التهاب القولون DSS التحريضية، لاحظنا زيادة كبيرة في التهابات CD11bعاليةLy6C وحيداتعالية بالمقارنة مع ظروف ما قبل التجربة. وفي المقابل، لم يحدث هذا التحول في الفئران التحكم غير كوليتيك دون مفاجآت (الشكل 3A). البيانات (n = 5 كل مجموعة) تم تحليلها باستخدام ANOVA و S.N.K. كمعلمة بديلة إضافية لالتهاب النظامية، قمنا بتقييم وجود خلايا F4/80-الإيجابية في طحال الفئران كوليتيك مقارنة بالضوابط غير كوليتيك، والتي كشفت عن زيادة كبيرة في الفئران المعالجة بمفاجآت صيف دبي (الشكل 3).

    الأسفار بوساطة التصوير المقطعي المسح الضوئي:

    كنا الأسفار بوساطة التصوير المقطعي لقياس تجنيد الوحيدات/بلعم وتسلل إلى الغشاء المخاطي للقناة الهضمية. كان يعمل في جسم المسمى fluorescence ضد موريني F4/80 مباشرة تصور الضامة تفعيلها في الحيوانات الحية. واستخدمت كعنصر التحكم ايستب الأجسام المضادة مفتش الفئران المسمى، وغير محدد. للمسح الضوئي، الفئران كانت حلق في منطقة البطن لتقليل انعكاس الضوء بالفراء وتخديره بالإمداد المستمر إيسوفلوراني وبحثت في جهاز FMT بيطرية للحيوانات الصغيرة الأسفار. كما هو موضح في الشكل 4A، تقلد التهاب القولون أدى تراكم مرتفعة إلى حد كبير للتتبع الفلورسنت في النقطتين الفئران كوليتيك بالمقارنة مع عناصر التحكم غير كوليتيك، مما يشير إلى زيادة في تسلل الوحيدات والتمايز في نشاط الضامة في الحيوانات كوليتيك. تطبيق مفتش المسمى الأسفار غير محدد لم تثر استجابة الأسفار يمكن اكتشافها في البطن والأمعاء، لا في كوليتيك (DSS) ولا المجموعة غير كوليتيك (المياه)، مما يدل على الطابع الخاص للمسبار-الهدف التفاعل بين جسم F4/80 (الشكل 4 أ). تظهر الصور التمثيلية لمنطقة البطن. يشير رمز اللون إلى مستوى كثافة الأسفار، مما يتوافق مع مدى ارتشاح التهابي(الشكل 4 باء و جيم 4).السابقين فيفو القياسات F4/80-توجه تراكم الراسم في نقطتين اكسبلانتيد التحقق من منشأ colonic إشارة في فيفو الكشف عن تراكم الراسم F4/80 (الشكل 5A و 5B). المبالغ المحسوبة لجسم منضم ارتباطاً جيدا (ص2 = 0.52) مع أرقام الأشيع مصممة للتسلل إلى الضامة (الشكل 5 و 5 د)، مما يؤكد أن التصوير في فيفو مع تتبع محددة يمكن تشير إلى نشاط المرض المحلية. تم تحليل المعطيات باختبار ANOVA و S.N.K. وظيفة المخصص مع مستوى الأهمية إحصائية في ف < 0.05. وتم حساب الارتباط الانحدار الخطي.

    Figure 1
    الشكل 1 . المعلمات السريرية وإصابة نسيجية على مدى DSS التهاب القولون الحاد.
    طعن الفئران C57BL/6 مع إدارة السلامة والأمن (2% w/v) في مياه الشرب لمدة 8 أيام. وأعطيت الفئران مراقبة مياه الشرب دون مفاجآت. وقد euthanized الحيوانات في يوم 9. يظهر هي البيانات المستمدة من تجربة واحدة (n = 5 كل مجموعة) ± الخطأ المعياري للوسط (SEM). (أ) تعرض التغيرات في وزن الجسم بالنسبة للوزن الأولى. (ب) في الدم إفراز في البراز، كما يحدده الاختبار ورقة جواياك (هيموككولت، 0 = السلبية، 4 = الدم الميكروسكوب). (ج) بعد الوفاة القولون طول. (د) إصابة نسيجية المقررة حسب درجة الضرر سرداب ومدى الالتهاب. سيظهر صور النسيجي الممثل (تلطيخ haematoxylin/ويوزين؛ وتكبير: 10 × (اللوحة العلوية)، 20 x (أسفل اللوحة)) كوليتيك (لوحات اليسار) أو الفئران التحكم (لوحات الحق). ملاحظة عميقة تدمير بنية الظهارية وتتسرب التحريضية (رؤوس الأسهم). رسم بياني شريطي: درجة الإصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    الشكل 2 . بلعم التسلل والوحيدات المعوية.
    حملت مفاجآت التهاب القولون في C57BL/6 بتطبيق إدارة السلامة والأمن (2% w/v) في مياه الشرب. وتلقت الفئران مراقبة مياه الشرب وحدها. البيانات من n = 5 الفئران كل مجموعة تظهر ± sem. (أ) التصور إيمونوفلوريسسينت من تسلل بلعم في الغشاء المخاطي. سيظهر بالصور التمثيلية لتلطيخ المضادة-F4/80 في كوليتيك والتحكم في الفئران. رسم بياني شريطي: خلية العد/عالية الطاقة الميدانية (HPF). (ب) التصور إيمونوفلوريسسينت للغشاء المخاطي تسلل العَدلات. يظهر هي الصور التمثيلية لتلطيخ المضادة-غرام-1 في الحيوانات كوليتيك وعناصر التحكم. رسم بياني شريطي: خلية العد/هبف. (ج) تركيز الخطة الرئيسية للعمليات في الأنسجة colonic الفئران كوليتيك وغير كوليتيك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3 . تجنيد الوحيدات إلى حجرة المعوية.
    الدم المحيطية وحيدات من الفئران كوليتيك، فضلا عن مراقبة الفئران (n = 5 كل مجموعة) تم تحليلها بواسطة التدفق الخلوي للتعبير من 6 ج-Ly في الخلايا CD11b إيجابية. تم فرز الخلايا استناداً إلى تعبير SSC و CD11b. وحيدات الماوس واعتبرت SSCمنخفضةCD11bارتفاع الخلايا، وقد تم تحليل التعبير عنها Ly6C. النسبي (أ) التغييرات نحو Ly6C تحريضية يصور وحيداتعالية بالنسبة لظروف ما قبل التجربة (تغيير % ± SEM). (ب) نظام مراقبة الأصول الميدانية المؤامرات دوت Ly6C التعبير على سكلآهCD11bارتفاع الخلايا من الحيوانات كوليتيك قبل وبعد التهاب القولون التعريفي (أفرقة أقل) وعناصر ما قبل وما بعد التجربة (لوحات العلوي). (ج) قيمت سبلينوسيتيس من الفئران كوليتيك وغير كوليتيك للتعبير عن F4/80 بالتدفق الخلوي (الأسفار متوسط كثافة ± SEM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4 . التصور تمجربهك من بلعم التغلغل في القولون مورين.
    فحص المواد الانشطارية في الفئران كوليتيك والضوابط غير كوليتيك التي تديرها مترافق Cyanine7 الأجسام المضادة ضد مورين F4/80 (n = 5 كل مجموعة). (أ) رسم بياني شريطي: تم تحديد كثافة مجموع الأسفار في بمول لصبغ في العائد على الاستثمار ويصور ± sem. الممثل الصور تظهر مع كثافة fluorescence المرمزة المقابلة لمدى ارتشاح التهابي في حقن الفئران في بحث محددة (المضادة الماوس F4/80) (ب) وعنصر تحكم غير محدد (الفئران مفتش) (ج). وفي كلتا الحالتين، انصب عائد الاستثمار متساوية في الحجم عرضية في الجزء العلوي من البطن لمزيد من التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الشكل 5 . السابقين فيفو التحقق خصوصية الراسم في القولون مورين.
    في فيفو فحص المواد الانشطارية في الفئران كوليتيك حقن في بحث محددة (المضادة الماوس F4/80) وقد أعقب السابقين فيفو الأشعة الفلورية مستو للامعاء اكسبلانتيد لإثبات أصل colonic إشارة التتبع التي تم الحصول عليها المجراة في. بيانات من تجربتين مع مجموعة n = 8 تظهر الحيوانات. تظهر الصور الممثل يصور في فيفو فحص المواد الانشطارية من الفئران كوليتيك مع الأسفار مرمزة كثافة تناظر مدى ارتشاح التهابي (A)-تصوير الانعكاس الأسفار من الأمعاء اكسبلانتيد يسمح للتعرف على مناطق محددة مع تراكم الراسم (ب)- الممثل بعد الوفاة إيممونوفلوريسسينت تلطيخ الضامة F4/80-إيجابية من هذه المناطق وتؤكد النتائج في فيفو (ج)- العدد من التسلل إلى الضامة، كما يحددها تلطيخ الفلورة، كانت يرتبط بتراكم في فيفو قياس الراسم (د)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    على الرغم من أن تقنيات التصوير الطبية قد تطورت بسرعة في السنوات الأخيرة، ونحن لا تزال محدودة في قدرتنا على الكشف عن عمليات التهابات أو الأورام، فضلا عن الأمراض الأخرى، وفي هذه المراحل الأولى من التنمية. ومع ذلك، وهذا بالغ الأهمية لفهم نمو الورم والغزو، أو الانبثاث التنمية والعمليات الخلوية في تطوير اضطرابات الالتهابات والأمراض التنكسية والقلب والأوعية الدموية والمناعية. في حين تعتمد تقنيات التصوير التقليدي على البارامترات الفيزيائية أو الفسيولوجية، يتيح التصوير الجزيئي التصور من المؤشرات الجزيئية المحددة في فيفو20.

    لتصوير الحيوانات الصغيرة، يمكن استخدام نهج يحركها النويدات المشعة (مثلاً sأنجل-فوتون الانبعاثات المحسوبة التصوير المقطعي بالبوزيترون (PET) والتصوير المقطعي (SPECT)) والموجات فوق الصوتية، والأسفار بوساطة التصوير لتصور محدد الهياكل الجزيئية المستهدفة. يتطلب استخدام الأجسام المضادة كامل طول العمود الفقري الراسم الأكثر توفرا تسميات طويلة الأمد، كأوقات طويلة الدورة الدموية والأنسجة بطء تغلغل تأخير وقت التصوير بعد تطبيق التتبع. ولذلك النويدات المشعة التصوير نموذجية غير مناسبة للتصوير في فيفو جسم التوزيع. استخدام النظائر المشعة طويلة الحية مثل Cu64 أو In111 يتيح تتبع المستندة إلى جسم ولكن تتطلب بنية تحتية معقدة تمتد توليد النظائر، والسلامة من الإشعاع قبل وأثناء عملية وضع العلامات، ومحمية الإسكان الحيوانية بعد طلب التحقيق. البديل أكثر فعالية من حيث التكلفة وأكثر أمنا وسوف تكون الأسفار بوساطة التصوير.

    عدة في فيفو نظم للكشف عن التصوير، وقد عرضت التصور، وقياس توزيع صبغة الفلورسنت في الحيوانات التي تعيش على مدى العقدين الماضيين الماضية21. تمكين معظم النظم السريعة مناسبة لتصوير الآفة سطحية سطحية. نتيجة لامتصاص الضوء ونثر إشارات عميقة في التهرب من الأنسجة سطحية. أن الحل الأكثر بروزا لهذه المشكلة هو التصوير المقطعي الفلورية22. بناء على النمذجة الرياضية، يتم تصحيح إشارة الصورة لامتصاص الضوء وبعثرة ويحسب dataset 3D ظاهري من dataset الإسقاط المتعدد8. الخوارزمية يوفر البيانات الكمية تماما، مما يتيح تقدير تركيز التتبع في مناطق محددة ممثلة تركيز/التعبير الهدف23. القيد ذات صلة من المواد الانشطارية تتصل بالقرار المكانية الفقراء مقارنة بتقنيات التصوير التشريحية، التي قد يعتمد على المطلوب المستهدفة-وسط توزيع المعلومات الجزيئية لهياكل تشريحية محددة. قيد آخر يكمن في عمق تغلغل المقيدة الضوء في الأنسجة، والتي تتطلب استخدام المسابير امتصاص والاستشعاع في الحمراء نير النطاق الطيفي23.

    طريقة تصوير أدخل مؤخرا الذي يجمع بين مزايا المورفولوجية بالموجات فوق الصوتية، وإمكانية الحصول على المعلومات الجزيئية من الأسفار التصوير تصوير أوبتواكوستيك. تشير النتائج الأولية من أوائل الدراسات إلى أنه-وعلى الرغم من حاجة إلى مزيد الصقل التقني-أوبتواكوستيك تصوير يحمل وعدا كبيرا للتصوير الجزيئي و متعدية التطبيقات المحتملة24.

    توظيف الكريات البيضاء بجدار الأمعاء خطوة حاسمة في بدء واستمرار لبنك التنمية بين الأمريكتين، كما يتم تجنيد الخلايا التحريضية إلى موقع الإصابة أو التهاب في العديد من الأمراض المناعية بوساطة، مثل أمراض المناعة الذاتية، عدوى وأمراض الأوعية الدموية وتوموريجينيسيس والعديد من أكثر من25. تفعيل الوحيدات وتسلل إلى داخل الغشاء المخاطي للامعاء خطوة أساسية في الآلية المرضية لبنك التنمية بين الأمريكتين، تثبيط التسلل الوحيدات وتنسقها المستقطبات والتفاعل جزيء الالتصاق الخلوي إنتغرين، واعدة العلاجية نهج12،26. ولذلك، رصد الكريات البيض الاتجار إلى موقع الالتهاب أمر حاسم في تطوير خيارات علاجية جديدة تصور الآثار المضادة للالتهابات المخدرات درس. قد يكون هذا الاهتمام الخاص لوكلاء استهداف الاتجار الكريات البيض قد وضعت، وبعض الأجسام المضادة-إنتغرين متاحة بالفعل لبنك التنمية بين الأمريكتين والعلاج، بينما عناصر أخرى ستكون متاحة في المستقبل القريب26. جسم [مونوكلونل] أنسنة ضد وحدة فرعية إنتغرين α4β7 الخاصة بالقناة الهضمية، واتروليزوماب، الذي يربط فرعية β7 α4β7 المعوية و heterodimers إنتغرين αEβ7، فيدوليزوماب، وقد تمت الموافقة عليها27،28. عوامل أخرى (مثلاً، مادكام-1 PF-00547659 وجهري مستقبلات (S1P) سفينجوسيني-1-فوسفات مثل أوزانيمود) يخضع حاليا لتقييم للمعالجة لبنك التنمية بين الأمريكتين29،30.

    عند تنفيذ معاهدة المواد الانشطارية، وإمكانية إدخال تعديلات تقنية تشمل اختيار توليفات مختلفة الراسم المستهدفة، فضلا عن الجمع بين معاهدة المواد الانشطارية والهيكلية التصوير النهج للتعويض عن ضعف القرار المكانية. وقد أنشئت طائفة واسعة من المجموعات المستهدفة التحقيق وتجاريا. يمكن القيام به باستخدام تجاري وسم لمشاريع محددة، وصفها بأجسام مضادة مخصصة يمكن مجموعات والبروتوكول المذكور أعلاه. اعتماداً على جسم أو الببتيد صغيرة اختيرت مجموعة الاستهداف، الموردين التجارية تقدم مجموعة واسعة من تسميات مختلفة. تنظر الصبغة المطلوبة، اعتماداً على التطبيق: للتصوير، وصبغة تعمل في الطيف نير الأنسجة العميقة (مثلاً، Cy7، λالسابقين/م 750/780 نانومتر) قد يكون مناسباً تماما، بينما السطوع الشاملة والفعالة الخفيفة توريد الأصباغ قد يكون من الأفضل تعمل في النطاق المرئي بالقرب من الطيف (مثلاً، نظائر للتجارة والنقل). ويمكن الحصول على الأصباغ كلها تقريبا إستر نشطة لتسمية يسين-المخلفات من البروتينات، وكذلك مع مويتيس ملزم البديلة، مثل ماليميديس لربط سيستين أو البيوتين لوسم البروتينات مزودة ببطاقات التوسيم محددة31 . اختيار التسمية لا يغير البروتوكول في المبدأ ولكن يتطلب مجرد تعديلات طفيفة لإجراءات وضع العلامات ومهم لنتيجة تصوير جيدة. آخر تعديل جذابة للتغلب على القيود الواردة في القرار المكانية الجمع بين معاهدة المواد الانشطارية بالأشعة المقطعية أو التصوير بالرنين المغناطيسي، تمكين التعليق التوضيحي للهياكل التشريحية مع المعلومات الجزيئية.المعلومات الهيكلية يمكن أما الحصول على التتابع كمعلومات مسبقة أو في وقت واحد، الأمر الذي يتطلب الهجين التصوير الأجهزة32،33.

    بعض الخطوات للبروتوكول وتستحق اهتماما خاصا. بهذا الأسلوب يمكن تكييفها للعديد من فوتوبروبيس الفلورية التي تستهدف مجموعة متنوعة من جزيئات معينة ممثلة لمختلف العمليات الجزيئية، من الضروري السماح لتوزيع كافية لتحقيقات والإثراء في المنطقة الهدف المنشود. قد تختلف هذه النقطة الوقت المثالي للتصوير وفقا للجمع بين تحقيق الهدف. على سبيل المثال، يحتمل أن تتأثر جسم استهداف مستقبلات الورم بمعدل انتشار الأورام وامتصاص والتمثيل الغذائي بالكبد، وردود الفعل المحتملة مكسبه الضارة34. أيضا النظر في عناصر التحكم ذات الصلة للنهج التصوير المحددة. يجب دائماً التحقق من تتبع محددة ضد عناصر ايستب مما يعكس آثار نضح وملزمة غير محدد (مثلاً، ملزمة بوساطة مستقبلات Fc). يمكن أن تخدم الحيوانات المستهدفة-السلبية كعنصر إضافي لخصوصية الراسم، في حالة وجود مثل هذه النماذج بالضربة القاضية. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء حظر التجارب لإثبات خصوصية جسم المستهدفة التفاعلات35.

    فيما يلي خطوات حاسمة بشأن الجوانب العملية للإجراءات: (1) بعناية تحديد تركيزات DSS تستخدم، كما قد تختلف قابلية DSS بين الماوس المختلفة سلالات والمصنوعات/دفعات36. (2) بعناية تحديد المجموعات المستهدفة التحقيق. (3) السماح لحوالي 5 دقائق من وقت المسح الضوئي لمسح كافية من البطن كله. نقطة الوقت الأمثل بين تطبيق التتبع وإجراء تصوير الاحتياجات يتحدد بعناية للسماح بتراكم الراسم في منطقة الهدف المنشود. للكشف عن F4/80 المعوية في القولون موريني، ينبغي حقن جسم المسمى ح 24 قبل المسح الضوئي. (4) كما قد يحدث تراكم التسمية غير محدد (مثلاً في الكبد)، من الأهمية بمكان لتسمية الأنسجة المستهدفة المناسبة كعائد الاستثمار عن طريق وضع أدوات القياس الخاصة بكل منها. وعلاوة على ذلك، ضوابط كافية للتوزيع الراسم غير محدد ينبغي أن تكون شملت-النظر في ضوابط ايستب غير محدد لاستبعاد آثار نضح وخروج المغلوب أو حظر دراسات للتحقق من صحة التفاعل الراسم-الهدف.

    مصادر نموذجية من الخطأ المتعلقة بإعادة البناء الداخلي وبيانات المسح تشمل موقف الحيوان غير لائق، والمسح الميداني، ومدة التعرض. عند تحديد المواضع الحيوان، الآفة فلوريسسينج يجب أن تكون محاطة بالانسجة على كل الأطراف لتقليل الضوضاء التعمير. فقاعات الهواء محاصرين بين الحيوان وصفيحة الزجاج الأمامي للكاسيت التصوير قد يزيد أيضا من الضوضاء، وينبغي إزالتها بتحريك الحيوان قليلاً. أكثر-أو ناقص للصورة يمكن أن تتطلب تفحص اكتسابها مع إعدادات التعرض المعدلة، التي يمكن العثور عليها في شاشة المسح الضوئي (كتلة صورة الانعكاس: تعديلات لوقت الشدة والتعرض الجبهة الصمام). عند الجمع في فيفو المستندة إلى جسم القياسات FMT بتحليلات النسيجي بعد الوفاة ، مثل إيمونوهيستوتشيميستري أو تلطيخ إيمونوفلوريسسينت، ينبغي النظر في استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ نفسه وتنسيق. أيضا، عند إجراء قياسات FMT المتكررة في الحيوانات نفسها، ينبغي أن تستخدم نفس الأشكال والحيوانات المستنسخة لمنع ه ممكنة أو استهداف مختلف [ابيتوبس].

    أخذت معا، تمكن fluorescence الجزيئية بوساطة التصوير المقطعي رصد مسار المرض المتكررة، والكامنة وراء العمليات الفيزيولوجية المرضية. أنه يمكن تطبيقها على عدد كبير دراسات الطبية الحيوية وقد يكون من المفيد للتعجيل باختبار المخدرات أو كنقطة نهاية هدف في العلاج الفردي. استهداف FMT F4/80-وإذ يعرب عن الضامة في نماذج التهاب يوفر أداة موسع قيماً لتصور وتحديد عمليات التسلل وتراكم الخلايا الملتهبة حين يدل أيضا العلاقة الجيدة التقليدية قراءات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgments

    ونشكر السيدة سونيا دوفينتيستير، والسيدة الكه فيبر، والسيدة كلاوديا Niepagenkämper للمساعدة التقنية الممتازة.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Alfalfa-free diet Harlan Laboritories, Madison, USA 2014
    Bepanthen eye ointment Bayer, Leverkusen, Germany 80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
    Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                          Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
    Florene 100V/V Abbott, Wiesbaden, Germany B506
    Haematoxylin                                                     Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany HHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583 fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
    Sodium Chloride 0,9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powder Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany S5761
    Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
    Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
    Hemoccult (guaiac paper test) Beckmann Coulter, Germany 3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody Serotec, Oxford, UK MCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1  BD Pharmingen, Heidelberg Germany 553125
    Streptavidin-Alexa546 Molecular Probes, Darmstadt, Germany S-11225 excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC Calteg, Burlingame, USA R2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123102
    DAPI Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany D9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 553104
    FACS buffer BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 342003
    Cy7 NHS Ester GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany PA17104
    MPO ELISA Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany K 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123127 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 eBioscience, Waltham, USA 45-4801-80 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 67-68-5
    Isoflurane Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 792632
    Ethanol Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany A4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany SRE0032
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry System BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging System PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA FMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis Software PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA included in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent Microscope Leica,  35578 Wetzlar, Germany  DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070 Bandelin, 12207 Berlin, Germany HD 2070 ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10 Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cm Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany 22398330
    luer lock syringe 5ml Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z248010
    syringe needles Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z192368 
    Falcon Tube 50ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Tags

    الطب، 130 قضية، الطب، وأمراض الجهاز الهضمي، في فيفو التصوير، التصوير التشخيصي، التهاب القولون التجريبية، ديكستران كبريتات الصوديوم التهاب القولون، مرض التهاب الأمعاء، تصوير الأسفار
    الأسفار بوساطة التصوير المقطعي للكشف والتحديد الكمي لالتهاب الأمعاء مورين المتصلة بلعم
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D.,… More

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D., Brückner, M., Cordes, F., Lenze, F., Becker, A., Wildgruber, M., Eisenblätter, M. Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation. J. Vis. Exp. (130), e55942, doi:10.3791/55942 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter