Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Fluorescens-medierad tomografi för påvisande och kvantifiering av makrofag-relaterade murina tarminflammation

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/55942
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

Summary

Mål-specifika prober representerar ett innovativt verktyg för att analysera molekylära mekanismer, såsom proteinuttryck i olika typer av sjukdom (t.ex. inflammation, infektion och uppkomst). I denna studie beskriver vi en kvantitativ tredimensionella tomografiska bedömning av intestinal makrofag infiltration i en murin modell av kolit med F4/80-specifika fluorescens-medierad tomografi.

Abstract

Murina modeller av sjukdom är oumbärliga för vetenskaplig forskning. Många diagnostiska verktyg såsom endoskopi eller datortomografisk imaging används dock inte rutinmässigt i djurmodeller. Konventionella experimentella utläsningar förlitar sig ofta på besiktning och ex vivo analyser, som förhindra inom enskilda uppföljande undersökningar och öka antalet studie djur behövs. Fluorescens-medierad datortomografi gör det möjligt för icke-invasiv, repetitiva, kvantitativa, tredimensionella bedömningen av fluorescerande sonder. Det är mycket känsliga och tillåter användning av molekylära beslutsfattare, vilket möjliggör specifika identifiering och karakterisering av olika molekylära mål. Särskilt representerar riktade sonder ett innovativt verktyg för att analysera aktivering och protein genuttryck i inflammation, autoimmun sjukdom, infektion, kärlsjukdom, cellmigration, tumourigenesis, etc. I denna artikel tillhandahåller vi stegvisa instruktioner på denna sofistikerade bildteknik för i vivo upptäckt och karakterisering av inflammation (dvs F4/80-positiva makrofag infiltration) i en allmänt använd murina modell av tarminflammation. Denna teknik kan också användas inom andra områden, såsom immun cell eller stem cell tracking.

Introduction

Djurmodeller används allmänt i vetenskaplig forskning och många icke-invasiva förfaranden finns för att övervaka sjukdomsaktivitet och vitalitet, såsom kvantifiering av kroppsvikten eller analys av blod, urin och avföring. Dock är dessa endast indirekt surrogat parametrar som också omfattas av interindividuell variabilitet. De måste ofta kompletteras med obduktion analyser av vävnad exemplar, som förhindrar seriell observation vid repetitiva tidpunkter och direkt observation av fysiologiska eller patologiska processer i vivo. Sofistikerade små djur bildgivande tekniker har dykt upp, inklusive cross sectional imaging, optisk imaging och endoskopi, som möjliggör direkt visualisering av dessa processer och tillåter också för upprepade analyser av samma djur1 , 2 , 3. Dessutom möjligheten att upprepande övervaka olika stadier av sjukdomen på samma djur kan minska antalet djur som behövs, vilket kan vara önskvärt ur ett djuretik synvinkel.

Det finns flera olika optisk imaging tekniker för i vivo fluorescens imaging. Ursprungligen anställdes confocal imaging att studera och under markytan fluorescerande händelser4,5. Nyligen har dock har tomografiska system som möjliggör kvantitativa tredimensionella vävnad bedömningar varit utvecklade6. Detta har åstadkommits genom utveckling av fluorescerande sonder som avger ljus i det nära infraröda (NIR) spektrumet, erbjuder låg absorption, känsliga detektorer och monokromatiskt ljus källor7. Medan traditionella cross-sectioning avbildningstekniker, såsom datortomografi (CT), magnetkamera (MRI) eller ultraljud (USA), främst förlitar sig på fysiska parametrar och visualisera morfologi, kan optisk imaging ge ytterligare information på underliggande molekylära processer sonder med hjälp av endogena eller exogena fluorescerande8.

Framstegen inom molekylärbiologi har bidragit till att underlätta genereringen av smart och riktade fluorescerande molekylära sonder för ett ökande antal mål. Till exempel kan receptormedierad upptag och distribution i en given målområdet visualiseras med hjälp av carbocyanine derivat-märkt antikroppar9. Överflödet av tillgängliga antikroppar, som kan vara märkt för att fungera som specifika spårämnen i annars otillgängliga områden av kroppen, ger oöverträffad insikter molekylära och cellulära processer i modeller av uppkomst och neurodegenerativa, hjärt-, immunologiska och inflammatoriska sjukdomar7.

I denna studie beskriver vi användningen av fluorescens-medierad tomografi i en murin modell av kolit. Dextran natriumsulfat (DSS)-inducerad kolit är en standard kemiskt inducerad musmodell av tarminflammation som liknar upphetsande läkt sjukdom (IBD)10. Det är särskilt användbart för utvärdering av bidraget av det medfödda immunsystemet till utvecklingen av tarm inflammation11. Eftersom den rekrytering, aktivering och infiltration av monocyter och makrofager representerar viktiga steg i patogenesen av IBD, är visualisering av deras rekrytering och kineticsen av infiltration viktigt för övervakning, till exempel effekten av potentiella terapeutiska ämnen i en preklinisk inställning12. Vi beskriva induktion av DSS kolit och Visa tomografi-medierad karakterisering av makrofag infiltration i tarmslemhinnan i med hjälp av fluorescens molekylär tomografi för specifika visualisering av monocyt/makrofag markören F4/80 13. Dessutom kan vi illustrera hjälppersonal och kompletterande förfaranden, såsom antikropp märkning. den experimentella setup; och analys och tolkning av erhållna bilderna, i samband med konventionella utläsningar såsom sjukdom aktivitet index, flöde flödescytometri och histologisk analys och immunohistokemi. Vi diskutera begränsningar av denna teknik och jämförelser till andra avbildningsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen enligt den tyska djur skydd lagen (Tierschutzgesetz).

1. material och experimentellt ställa in

  1. Djurvård.
    1. Använd sex - och åldersmatchade möss av någon DSS-känslig stam (t.ex. C57BL/6) på 20-25 g kroppsvikt.
    2. Planera minst fem eller fler möss per experimentella gruppen och hus möss enligt lokala djurvård riktlinjer.
    3. Ge en standard gnagare chow kost och autoklaveras dricksvatten ad libitum.
    4. Ta bort den standard chow och ersätta det med alfalfa-fri chow minst tre dagar före skanning för att minska endoluminal auto-fluorescens.
  2. Induktion av akut DSS-inducerad kolit.
    1. Lös upp 2 g DSS (molekylvikt ~ 40 000 Da) i 100 mL Ånghärdad dricksvatten att erhålla en 2% (w/v lösning).
    2. Fyll dricka leverans av mössen uteslutande med DSS lösningen och uppskatta 5 mL vätska per mus per dag. Ge samma dricksvattnet utan DSS till kontroll möss10.
      Obs: Övervaka möss dagligen fram till slutet av experimentet. Euthanize mössen att förlora mer än 20% av sin initiala kroppsvikt eller som blir döende (dvs fortsatt böjd hållning, minskad rörlighet, svårigheter att andas, markant upprätt coat) enligt lokala tillämpliga riktlinjer på djur välfärd.
  3. Beredning av fluorescens-medierad tomografi.
    1. Märka den önska antikroppen (t.ex. råtta antimus F4/80) med fluorescens färgämne (t.ex. Cyanine7, λexcitation: 750 nm, λutsläpp: 776 nm) som beskrivs i tillverkarens protokollet. Dialyze renad antikropp i en lämplig dialys membran (porstorlek < 50-100 kDa) mot 1 L 0,15 M natriumklorid för minst 2 tim eller över natten.
      1. Överföra antikroppen till 1 L 0,1 M NaHCO3 och dialyze för minst 2 h.
      2. Upplösa den erforderliga mängden av fluorescerande färgämne i dimetyl sulfoxid (DMSO) (10,8 µL/mg av antikropp) och lägga till antikropp lösningen. Använda den fluorescerande färgämnen i 20-fold molar överskott för att uppnå en dye-till-protein förhållandet 1:3.
      3. Inkubera i mörker vid 4 ° C 1 h. ta bort omärkta antikropp genom dialys mot 1 L 0,15 M natrium eller använda en PD-10 avsaltning kolumn och lösa i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för in vivo application.
      4. Bestämma den slutliga antikroppskoncentrationen och märkning baserat genom spektrofotometri.
      5. Mätning av protein koncentrationen på en absorption av 250-330 nm och överväga ytterligare absorption av färgämnet. Korrigera den maximala absorptionen vid 280 nm (protein) med 11% av maximal absorption vid 750 nm (nästa steg) för Cyanine7 märkning.
      6. Mäta en utspädning av föreningen (vanligtvis 1:10) vid 250-800 nm och extrahera koncentrationen av Cyanine7 vid 750 nm.
      7. Bestämma förhållandet dye-till-protein som: färgämne/antikropp = maximal absorption vid 750 nm / 200.000 / (maximal absorption vid 280 nm - 0,11 x max absorption vid 750 nm) / 170.000.
      8. Hålla den antikropp lösningen vid 4 ° C och skydda den från ljus för att undvika blekning före injektion.
    2. Läsa in nödvändiga antikropp lösning volymen i en steril spruta omedelbart före injektion och sköld från ljus tills det används.
    3. Bestämma den optimala tidpunkten för sonden injektion och skanning förfarandet beroende på tracer farmakokinetik.
    4. Söva möss med 1,5-2,5% inhaleras isofluran i syre eller placera dem säkert i en dedikerad fasthållning för svans ven injektion av märkt antikroppar.
    5. För fullängds antikroppar, injicera märkt antikropp minst 24 h innan skanning, exempelvis antimus F4/80 makrofag visualisering i murina kolit. Injicera möss intravenöst (i.v.) via svansen ven med märkt antikropp med ett belopp som motsvarar 2,0 nmol färgämne.
    6. Användning märkt lika ospecifika antikroppar (t.ex. råtta IgG eller en annan isotypen motsvarar primär antikropp arvet) som ett isotypen kontroll i doser motsvarar specifika sonden.
      Obs: Resultaten av i vivo File efter injektion av kontroll föreningen kan tjäna som referens för tolkningen av specifika sonden imaging data.
    7. Använda en rakapparat raka djurs päls i buken regionen att minimera ljusreflektion och absorption.

2. teknisk utrustning

  1. Använda en veterinärmedicinska fluorescens-medierad tomografi (FMT) enhet för små djur fluorescens ( figur 4).
  2. Skapa en ny studie för varje projekt genom att klicka på den ”nya studien” knappen och inkludera i studiebeskrivning de relevanta spårämnen, inklusive imaging parametrar och doser för framtida referens.
  3. Inom denna studie, skapa studiegrupper enligt respektive studiedesign (t.ex. för viss spårningspil och ospecifikt isotypen kontroll) genom att klicka på ”ny study group” knappen. Utrusta varje studiegrupp med respektive antalet djur.
  4. Kalibrera systemet för tracer konstruktioner.
    1. Utför kalibreringen för varje parti av spårämnen att normalisera för variationen i märkning och aktivera kvantitativ mätning från OI data.
    2. Följ instrumenttillverkarens vägledning för kalibrering av varje enskilt system; vid urval av ”Lägg till ny tracer”, kommer att systemet ge en guide genom stegen. Ge utspädning av tillämpad antikropp lösningen och den beräkna absoluta koncentrationen av spårämne i sonden.
    3. För FMT, använda en vävnad-härma fantom som definieras enligt tjocklek och absorption egenskaper (som liknar vital vävnad) och fyll den med en viss volym av antikropp lösningen används. Mäta detta på FMT enheten.
      Obs: Systemet använder referensmätning av medföljande sonden, tillsammans med viss koncentration, för att beräkna absoluta tracer koncentrationer från framtida i vivo mätningar.
  5. Använda en heatable undersökning kassett med en temperatur på 42 ° C.
    Obs: Detta förhindrar mössen blir nerkylda under prövningen.

3. djur anestesi

  1. Använda ett kontinuerligt flöde av 1,5-2% vol % isofluran ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) och 1,5 L O2/min att söva möss.
Använda specialdesignade inandning system för gnagare anestesi (isofluran spridare) att enkelt styra bedövningsmedel djupet och minimera personalen exponering.
  • Placera musen i täta induktion kammaren och slå på spridare för isofluran leverans (100% (v/v), 5 vol.% syre, 3 L/min). Övervaka musen tills det är recumbent och medvetslös.
  • Placera den i undersökningen kassett för tomografi, med kontinuerlig isofluran inandning via näsan konen med en dos på 100% v/v, 1,5 vol.% syre, 1,5 L/min att minimera rörelse artefakter vid undersökningen. Förfaranden som varar längre än 5 min att gälla mus ögon att förhindra skador på hornhinnan ögonsalva.
  • Bedöma bedövningsmedel djup genom att kontrollera reflexer. Lägga musen på ryggen; om anestesi är tillräcklig, bör musen inte vända. Nyp ihop musen mjukt mellan sina tår; om anestesi är tillräcklig, benet inte återkallat (etapp kirurgiska tolerans).

    • 4. fluorescens-medierad datortomografi Scan

    Obs: Anpassa följande uppgifter som är specifika för det FMT-system som används i denna studie (se Tabell för material) för alternativa fluorescens reflektans bildenheter eller FMT system efter behov.

    1. Placera musen för sövda på ryggen i undersökning kassett.
    2. Utföra scanning procedur.
      1. Sätt in kassetten i imaging systemet och stänga den omedelbart för att säkerställa kontinuerlig anestesi. Välj lämplig provet från studiegruppen skapade tidigare. Välj den administrerade tracer i listmenyn för att se till att värdena för koncentrationen av spårämne beräknas korrekt.
      2. Förvärva fluorescens reflektans bild av lämpliga våglängden (720 nm för Cyanine7) för scan planering och disposition fältet skanna genom att klicka på knappen ”Hämta bild”.
      3. Se att fältet scan visas som överlagring på fluorescens reflektans bilden. Justera det till regionen av intresse (t.ex. kolon eller buken), undvika luft eller områden av återstående päls. Beroende på målet för bild, ange antalet bild datapunkter inom scan genom att välja från den grova till medium och fin scan-fältet upplösning i menyn till höger.
        Obs: Tänk på att en fin scan fältet kan erbjuda bättre rumslig upplösning på bekostnad av en betydligt längre skanning tid.
      4. Starta data/bild förvärvandet av valda våglängden genom att klicka på ”Sök”.
        Obs: Bildläsningstiden för en medium-fin genomsökning av hela buken blir runt 5 min; varje datapunkt belyses separat med excitation lasern i denna tid, och den resulterande fluorescensen registreras.
      5. Ta bort djuret från imaging kassett i slutet av sökningen och låta djuret att återhämta sig helt innan du placerar den tillbaka in i buren.
      6. Upprepa FMT om det anses nödvändigt vid olika tidpunkter under experimentet (t.ex. dagar 0, 5 och 9-10 (slutet av experimentet)), men anser att ansamling av antikropp i kroppen, därför ökar bakgrund fluorescens signalen.

    5. efter scan

    1. Placera musen i en separat bur på en pappershandduk under en värmande rött ljus-lampa och övervaka musen för tecken på obehag eller ångest tills full återhämtning. Placera musen tillbaka i sin respektive bur när fullt vaken.
    2. Avliva de möss i slutet av experimentet genom leverans av CO2 att Frånkopplingsdonet vid en dos på 100% (v/v), 100 vol.% och 3 L/min. Inte före Fyll kammaren med CO2, som en plötslig exponering för höga halter av CO2 kan orsaka lidande. Kontrollera död efter musen har slutat andas genom en efterföljande sekundära läge av dödshjälp såsom snabba cervikal dislokation.
    3. Explant kolon av buken laparotomi och utföra en ex vivo -scan av explanterad tjocktarmen, som förklaras i steg 4.2.1 - 4.2.4. Öppna varje kolon longitudinellt med Metzenbaum kirurgisk sax och skölj med koksaltlösning innan du förbereder den för vidare analys.
    4. Använd en skalpell att skära ett 0,5-cm fragment från distala kolon och placera det omedelbart i en 1,5 mL kryogen slang. Frysa det i flytande kväve och förvaras vid-70 ° C tills vidare användning (t.ex.myeloperoxidas (MPO) mätningar).
    5. Använd en trä pinne och rulla upp de återstående längdriktningen öppnade kolon från den distala till proximala änden, med slemhinna utåt (”Rulltårta technique”), för histologiska analyser. Placera preparatet i ett fixativ (se Tabell av material) och fryser vid-80 ° C14.

    6. data återuppbyggnad och tolkning

    1. Använd verktyget återuppbyggnad av respektive avbildningsprogrammet för att skapa 3D-kartor av fluorescens distribution från imaging rådata; skanningar läggs automatiskt till verktyget återuppbyggnad, när vid skanning, funktionen ”Lägg till återuppbyggnad kö” är markerad.
      1. Annars Välj skanningar i listmenyn under respektive studien och studiegrupp, högerklicka på sökningen och välj ”Lägg till återuppbyggnad”.
    2. För vidare analys, att läsa in en uppsättning data i programvaran analys. Från den nedrullningsbara menyn i det översta fältet, välj respektive studien och välj sedan study group och det enskilda djuret från menyn till höger; Alla skanningar utförs för detta djur visas. Välj rätt genomsökningen och klicka på ”läsa”.
      Obs: Den 3D rekonstruktionen av tracer distributionen visas till vänster som en överlagring av initialt förvärvade fluorescens reflektans bilden. Modellen kan vridas och förstoras för enklare analys.
    3. Identifiera foci av ospecifika etikett ackumulering (t.ex., levern eller urin blåsan) på rekonstruerade 3D kartor och skilja från målvävnaderna (t.ex., tarm eller tarmen).
    4. Det översta fältet, Välj formen ROI lämpligast för målet. Etiketten målvävnaden som områden av intresse (ROI) genom att placera respektive mätverktygen i programvaran analys; programvaran kommer att ge en fluorescensintensiteten för den avkastning, samt (pico-) molar mängder spårämne som genomsökningen har kalibrerats för.
    5. Välj den totala mängden spårämne i den lämpliga ROI, normaliserade för ROI storlek, som det mest lämpliga likvärdigt för utvärdering av sjukdomsaktivitet i korrelation med den inflammatoriska infiltrat (histologi).
      Obs: Andra funktioner av ROI kan väljas om lämpliga som representant för den specifika modellen.

    7.Ex Vivo Analyser

    1. Hematoxylin och eosin färgning och immunofluorescens färgning.
      1. Deparaffinize sektioner genom att placera dem i 70% etanol (EtOH) för 2 min; Skölj med destillerat vatten efteråt. Fläcken med hematoxylin lösning för 5 min och skölj därefter med varmt kranvatten i 10 min.
      2. Skölj med destillerat vatten, motfärg med eosin lösning för 2 min, och igen skölj med destillerat vatten.
      3. Plats i 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH och xylen (2 gånger) i 2 min varje torkar ut och rensa avsnitten. Montera med hartsartade monteringsmedium.
    2. Immunofluorescens färgning.
      1. Använd de tidigare erhållna vävnadssnitt (”Rulltårta”) för immunofluorescens färgning och förbereda cryo-cut sektioner 7 µm.
      2. Blockera aceton-fasta och frysta kolon sektioner i 5,0% råtta serum i 10 min och inkubera över natten med utspädd (1/500 v/v) biotinylerade primära råtta antimus F4/80 antikropp. Tvätta i avsnitt tre gånger i Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) och inkubera med streptividin-FITC (1: 100 v/v) i PBS/BSA (0,1% w/v) över natten vid 4 ° C.
      3. Tvätta avsnitten i TBS och fläcken med 4, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI, 1: 1000 v/v) för att uppnå kontrast. Analysera fluorescens bilderna under confocal Mikroskop (se Tabell för material, 40 x förstoring; filter kub N2.1 med excitationsfilter 515-560) och räkna F4/80-positiva celler per high-power fält.
        Obs: Överväg att använda antikroppar av samma klon och format när du kombinerar i vivo FMT och besiktning histologi analyser såsom immunohistokemi eller immunofluorescens färgning, beroende på det avsedda målet. För detektion av F4/80-positiva makrofager i vivo och ex vivoanvändes olika format.
    3. MPO mätningar i kolon prover.
      1. Använd färska erhållits, PBS-sköljas kolon prover eller tinade förlagan för MPO mätningar. Väger alla prover och homogenisera vävnaden i lyseringsbuffert i ELISA kit (se Tabell för material) på en volym av 20 μl lyseringsbuffert per mg vävnad.
      2. Sonikera för 15 s (ultraljudsbehandling frekvens: 20 kHz, power: 70 W) och centrifugera proverna för 10 min på 200 x g- och 4 ° C.
      3. Använd en kommersiellt tillgänglig ELISA kit (se Tabell för material) enligt tillverkar beskrivningen. Genomföra testet i dubbletter.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Bedömning av koliken:

    DSS-inducerad kolit är en kemiskt inducerad murina modell av tarminflammation som liknar mänskliga IBD och leder till viktminskning, rektal blödning, ytliga sår och slemhinnor skador i känsliga möss15. Det är särskilt användbart för att studera det medfödda immunsystemet till utvecklingen av tarminflammation10,11bidrag. Inducera potent colitic inflammation, möss var kontinuerligt administreras DSS hela experimentet. Minskande kroppsvikt och ockult blod användes som kliniska index av inflammation. Som visas i figur 1A, började möss förlora vikt börjar på dag fyra efter induktion av kolit, medan djuren i kontrollgruppen som fick enbart vatten visade inga betydande förändringar i kroppsvikt. Dessutom colitic djur visade ökad utsöndring av ockult blod med avföring (figur 1B), som utvärderas med hjälp av följande hemoccult poängsystem: 0 (inget blod), 1 (hemoccult positiv), 2 (hemoccult positiva och visuella pellet blödning) och 4 () brutto-blödning, blod runt anus)16. Kolon längd mättes för att utvärdera inflammation-inducerad colonic förkortning, avslöjar betydligt förkortad kolon i colitic möss jämfört med kontroll möss som fick enbart vatten (figur 1 c). Att direkt bedöma kolon skada, utfördes histologiska analysen i slutet av experimentet. En kvantitativ bedömning av histologiska skador utfördes på colonic H & E-färgade sektioner med en övergripande skada core baserat på den grad och omfattning av inflammation, crypt skador och procent inblandning17. Colitic möss visade tecken på svår inflammation, medan kontroll möss som fick ingen DSS visade inga histologiska skador (figur 1 d). Bilderna visar karakteristiska inflammatoriska förändringar i DSS-inducerad kolit, kännetecknas av förstörelsen av epitelial arkitektur, med förlust av bägarceller, crypt skador och slemhinnesår på ytan, i motsats till den till stor del bevarade slemhinnor arkitekturen i kontroll möss18. Statistiska skillnader mellan grupperna (n = 5 per grupp) har beräknats med variansanalys (ANOVA) följt av Student-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc test eller av Welch's test följt av spel-Howell post hoc test vid betydande avvikelse inhomogenitet. Ett p-värde < 0.05 ansågs betydande.

    Bedömning av monocyt och makrofag rekrytering:

    Som DSS-inducerad kolit är associerad med infiltrationen av immunceller, såsom monocyter och makrofager, in i mucosa och submucosa av tjocktarmen, brukade vi Immunofluorescerande färgning för monocyt/makrofag markören F4/80 kvantifiera infiltrera. Colitic möss som fick DSS visade förhöjt antal monocyter infiltrera kolon väggen jämfört med icke-colitic kontroll möss (figur 2A). Leukocytinfiltration kvantifierades dessutom använda Immunofluorescerande färgning för neutrofila markören GR1, avslöjar den betydligt ökade invandringen av neutrofiler i inflammerade tjocktarmen jämfört med kontroll möss (figur 2B). För att bekräfta, MPO var nivåer återspeglar både neutrofila nummer och inflammatorisk aktivitet signifikant förhöjda i kolon vävnaden av colitic möss (figur 2 c). ANOVA och S.N.K. post hoc test användes för att beräkna den statistisk signifikansen mellan grupperna (n = 5 per grupp). Statistisk signifikans var inställd på p < 0,05.

    Systemiska förändringar i makrofag Subpopulation:

    Mus monocyter omfatta en heterogen grupp av skilda subpopulationer som skiljer sig i mognad tillstånd och deras kapacitet att rekryteras till inflammatoriska platser, där de deltar i inleda och vidmakthålla den inflammatoriska respons19 . Därför vi kännetecknas blod monocyter genom att analysera differentiell uttrycket av CD11b och Ly6C med hjälp av flödescytometri. Under inflammatoriska tillstånd av akut DSS kolit observerat vi en betydande ökning av inflammatoriska CD11bhögLy6Chög monocyter jämfört med före experimentet. Denna förändring däremot inte förekommer i icke-colitic kontroll möss utan DSS (figur 3A). Data (n = 5 per grupp) analyserades med hjälp av ANOVA och S.N.K. Som en ytterligare surrogat parameter för systemisk inflammation bedömde vi förekomsten av F4/80-positiva celler i mjälten colitic möss jämfört med icke-colitic kontroller, som visade en signifikant ökning i DSS-behandlade möss (figur 3 c).

    Fluorescens-medierad datortomografi Scan:

    Vi använde fluorescens-medierad datortomografi för att mäta monocyt/makrofag rekrytering och infiltration i tarmslemhinnan i. En fluorescens-märkt antikropp mot murint F4/80 var anställd att direkt visualisera aktiverade makrofager i levande djur. Märkt, ospecifikt råtta IgG-antikroppar användes som isotypen kontroll. För skanning, var möss rakad i buken regionen att minimera ljusreflektion av pälsen, sövd av kontinuerlig isofluran leverans och undersökas i en veterinär FMT-enhet för små djur fluorescens. Som visas i figur 4A, induktion av kolit ledde till en kraftigt förhöjd ackumulation av fluorescerande spårämne i kolon av colitic möss jämfört med icke-colitic kontroller, vilket indikerar en ökning av monocyt infiltration och differentiering till aktiva makrofager i colitic djur. Tillämpningen av en ospecifik fluorescens-märkt IgG omalizumab en detekterbar fluorescens svar i buken och tarmen, vare sig i colitic (DSS) eller gruppen icke colitic (vatten), som visar specificiteten av sonden-målet interaktion av F4/80 antikropp (figur 4A). Representativa bilder av buken regionen visas. Färgkod anger nivån på fluorescensintensiteten, vilket motsvarar omfattningen av inflammatoriska infiltrat()figur 4B och 4 C).Ex vivo mätningar av F4/80-regisserad tracer ackumulering i explanterad kolon verifierade colonic beskärningen av signalen i vivo upptäcks av F4/80 tracer ackumulering (figur 5A och 5B). Beräknade mängder bundna antikroppar korrelerade väl (R2 = 0,52) med histologiskt beslutsamt numrerar av infiltrera makrofager (figur 5 c och 5 D), bekräftar att i vivo imaging med specifika spårämnen kan vara av lokala sjukdomsaktivitet. Data analyserades av ANOVA och S.N.K. post hoc test med en statistisk signifikansnivå på p < 0,05. Korrelationen beräknades som linjär regression.

    Figure 1
    Figur 1 . Kliniska parametrar och histologiska skadan under loppet av akut DSS kolit.
    C57BL/6 möss utmanades med DSS (2% w/v) i dricksvatten i 8 dagar. Kontroll möss fick dricksvatten utan DSS. Djur var euthanized på dag 9. Visas är data från ett experiment (n = 5 per grupp) ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). (A) förändringar i kroppsvikt presenteras i förhållande till den ursprungliga vikten. (B) blod utsöndring i avföring, som bestäms av guaiac papper testet (hemoccult, 0 = negativ, 4 = blod makroskopiskt). (C) efter slakt kolon längd. (D) histologiska skador bedömdes av graden av skada, kryptan och graden av inflammation. Visas är representativa histologiska bilder (hematoxylin/eosin färgning; förstoringar: 10 x (övre panel), 20 x (nedre panelen)) av colitic (vänstra paneler) eller kontroll (rätt panelerna) möss. Notera djup förstörelsen av epitelial arkitektur och inflammatoriska infiltrerar (pilspetsar). Stapeldiagram: skada poäng. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 2
    Figur 2 . Intestinal monocyt och makrofag infiltrera.
    DSS kolit förmåddes i C57BL/6 genom tillämpning av DSS (2% w/v) i dricksvattnet. Kontroll möss fick dricksvatten ensam. Data från n = 5 möss per grupp visas ± SEM. (A) Immunofluorescerande visualisering av makrofag infiltreringar i slemhinnan. Visas är representativa bilder av anti-F4/80 färgning i colitic och kontrollera möss. Stapeldiagram: cell count/high power fältet (HPF). (B) Immunofluorescerande visualisering av slemhinnan neutrofil infiltration. Visas är representativa bilder av anti-Gr-1 färgning i colitic djur och kontroller. Stapeldiagram: cell count/HPF. (C) MPO koncentration i kolon vävnaden i colitic och icke-colitic möss. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 3
    Figur 3 . Monocyt rekrytering till intestinal utrymmet.
    Perifert blod monocyter från colitic möss samt kontroll möss (n = 5 per grupp) analyserades av flödescytometri av uttryck av Ly - 6C på CD11b-positiva celler. Cellerna var sorterade baserat på SSC och CD11b uttryck. Mus monocyter identifierades som SSClågCD11bhög celler och deras Ly6C uttryck analyserades. (A) proportionella förändringar mot inflammatoriska Ly6Chög monocyter skildras i förhållande till före experimentet villkor (% förändring ± SEM). (B) FACS dot tomter Ly6C uttryck på SSClödeCD11bhög celler av colitic djur före och efter kolit induktion (lägre paneler) och kontroller före och efter försöket (övre paneler). (C) Splenocytes från colitic och icke-colitic möss bedömdes av uttryck för F4/80 av flödescytometri (genomsnittlig fluorescens intensitet ± SEM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 4
    Figur 4 . Tomografiska visualisering av makrofag infiltrera i murina kolit.
    FMT File i colitic möss och icke colitic kontroller administreras Cyanine7-konjugerad antikropp mot murint F4/80 (n = 5 per grupp). (A) stapeldiagram: totala fluorescensintensiteten i pmol färgämne bestämdes i ROI och avbildade ± SEM. representativa bilder visas med färgkodade fluorescensintensiteten som motsvarar omfattningen av inflammatoriska infiltrat i möss som injiceras med specifika sond (antimus F4/80) (B) och en ospecifik kontroll (råtta IgG) (C). I båda fallen placerades en ROI av lika storlek tvärgående i övre delen av buken för vidare analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figure 5
    Figur 5 . Ex vivo validering av tracer specificitet i murina kolit.
    In vivo FMT skannar i colitic möss som injicerats med specifika sonden (antimus F4/80) följdes av ex vivo planar fluorescens skanningar av explanterad tarmar att demonstrera colonic ursprung i tracer signal erhålls invivo. Data från två experiment med totalt n = 8 djur visas. Representativa bilder visas som skildrar i vivo FMT skanningar av colitic möss med färgkodade fluorescens intensitet som motsvarar omfattningen av inflammatoriska infiltrat (A).Fluorescens reflektans avbildning av explanterad tarmen möjliggör identifiering av specifika regioner med tracer ackumulering (B). Representativa besiktning Immunofluorescerande färgning för F4/80-positiva makrofager från sådana områden bekräftar resultaten i vivo (C). Antalet infiltrera makrofager, som bestäms av immunofluorescens färgning, var korrelerade med i vivo mätt tracer ackumulering (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Även om medicinska bildgivande tekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren, är vi fortfarande begränsade i vår förmåga att upptäcka inflammatoriska processer eller tumörer, samt andra sjukdomar, i sina tidigaste utvecklingsstadier. Detta är dock viktigt att förstå tumörtillväxt, invasion, eller metastaser utveckling och cellulära processer i utvecklingen av inflammatoriska sjukdomar och degenerativa, kardiovaskulära och immunologiska sjukdomar. Medan traditionella avbildningstekniker förlitar sig på fysiska eller fysiologiska parametrar, möjliggör molekylär avbildning visualisering av specifika molekylära markörer i vivo20.

    För små djur imaging, radionuklid-driven metoder (t.ex. single-photon utsläpp beräknas tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET)), ultraljud och fluorescens-medierad imaging som kan användas för att visualisera specifika Molekylär målstrukturer. Användningen av fullängds antikroppar som mest tillgängliga tracer ryggraden kräver långvarig etiketter, som lång cirkulation gånger och långsam vävnad penetration dröjsmål tidpunkten för bildframställning efter tracer applicering. Typiska imaging radionuklider är därför inte lämplig för den i vivo imaging av antikropp distribution. Användning av långlivade isotoper som Cu64 eller In111 gör antikroppsbaserade spårämnen men kräver en komplex infrastruktur som spänner över isotopen generation, strålsäkerhet före och under förfarandet för märkning, och skärmade djurstallar efter sonden applicering. Den mer kostnadseffektiv och säkrare varianten skulle vara fluorescens-medierad imaging.

    Flera i vivo imaging system för upptäckt, har visualisering samt mätning av fluorescerande färg distribution i levande djur presenterats under de senaste två decennier21. De flesta system möjliggör snabb planar imaging lämplig för ytlig lesion imaging. På grund av ljusabsorption och spridning, signaler djupt i vävnaden undgå planar imaging. Den mest framträdande lösningen för detta problem är fluorescens tomografi22. Baserat på matematisk modellering, bild signalen korrigeras för ytspridning och ljus absorption och en virtuell 3D datamängd beräknas från flera projektion datamängd8. Algoritmen ger fullt kvantitativa data, möjliggör beräkning av koncentrationen av spårämne i specifika regioner representant av målet koncentration/uttryck23. En relevant begränsning av FMT är relaterad till dålig rumslig upplösning jämfört med anatomiska avbildningstekniker, som kan-beroende på önskad mål-kompromiss fördelningen av molekylär information till särskilda anatomiska strukturer. En annan begränsning ligger i begränsad genomträngningsdjupet av ljus i vävnad, som kräver användning av sonder absorberande och fluorescerar i rött till NIR spektralområde23.

    En nyligen introducerad bildgivande modalitet som kombinerar fördelarna med morfologiska ultraljud och möjligheten att erhålla molekylär information från fluorescens imaging är optoacoustic imaging. Preliminära resultat från tidiga studier föreslår att-trots ett behov för ytterligare teknisk förfining-optoacoustic imaging rymmer mycket lovande för molekylär avbildning och potentiella translationella program24.

    Rekrytering av leukocyter till tarmväggen är ett avgörande steg i den inledande och fortbestånd av IBD, som är rekrytering av inflammatoriska celler till platsen för infektion eller inflammation i många immunmedierade sjukdomar såsom autoimmun sjukdom, infektion, kärlsjukdom, tumourigenesis och många fler25. Monocyt aktivering och infiltration i tarmslemhinnan är ett viktigt steg i patogenesen av IBD, är hämning av monocyt infiltration, iscensatt av kemokinerna och integrin-cellulär adhesion molekyl interaktion, en lovande terapeutisk närma sig12,26. Övervakning leukocyt människohandel till platsen för inflammation är därför avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska alternativ att visualisera de studera läkemedel antiinflammatoriska effekter. Detta kan vara av särskilt intresse eftersom agenter inriktning leukocyt människohandel har utvecklats, och vissa anti-integrin antikroppar finns redan tillgängliga för IBD terapi, medan ytterligare komponenter kommer att vara tillgänglig i nära framtida26. Vedolizumab, en humaniserad monoklonal antikropp mot gut-specifika α4β7-integrin subenhet och Etrolizumab, som binder den β7 subuniten av intestinal α4β7 och αEβ7 integrin heterodimerer, har varit godkända27,28. Andra medel (t.ex. den MAdCAM-1 PF-00547659 och sfingosin-1-fosfat-(S1P) receptor modulatorer såsom Ozanimod) genomgår för närvarande utvärdering för behandling av IBD29,30.

    När du utför FMT, inkluderar möjliga ändringar av tekniken val av kombinationer av olika tracer-mål, samt att kombinera FMT med strukturella imaging metoder för att kompensera för dålig rumslig upplösning. Ett brett utbud av sonden-target kombinationer har etablerat och kommersialiseras. För specifika projekt, märkning av anpassade antikroppar kan vara klar med kommersiell märkning kit och ovan beskrivna protokollet. Beroende på den antikropp eller mindre peptid valt som den inriktning biexponentiellt, erbjuder kommersiella leverantörer en mängd olika etiketter. Överväga önskade färgen, beroende på användningsområde: för djup-vävnad imaging, ett färgämne som verkar i det NIR-spektrumet (t.ex. Cy7, λex / em 750/780 nm) kan vara väl lämpad, medan den allmänna ljusstyrkan och effektivt ljus leverans av färgämnen verksamma i området nära-synliga spektrum (t.ex. god Jordbrukarsed analoger) kan vara att föredra. Praktiskt taget alla färgämnen kan fås som en aktiv ester till etiketten lysin-rester av proteiner, liksom med alternativa bindande delarna, såsom maleimides för cystein bindande eller biotin för märkning av proteiner utrustade med särskilda märkning Taggar31 . Valet av etiketten ändrar inte protokollet principen men krävs endast smärre ändringar av förfarandet för märkning och är viktigt för ett bra bildbehandling resultat. En annan attraktiv modifiering för att övervinna begränsningarna i rumslig upplösning är att kombinera FMT med CT eller MRI, aktivera annotering av anatomiska strukturer med molekylär information.Den strukturella informationen kan antingen förvärvas sekventiellt som förhand information eller samtidigt, vilket kräver hybrid imaging instrumentation32,33.

    Vissa steg i protokollet förtjänar särskild uppmärksamhet. Eftersom denna teknik kan anpassas för en mängd fluorescerande photoprobes som är riktade till en mängd specifika molekyler som är representativa för olika molekylära processer, är det viktigt att möjliggöra tillräcklig distribution av sonder och anrikning i den önskat målregionen. Den idealiska tidpunkten för avbildning kan variera beroende kombinationen sond-målet. Exempelvis kan antikropp riktat tumör receptorer påverkas av diffusion hastigheten till tumörer, upptag och metabolism av levern, och eventuella biverkningar immunogent34. Också överväga relevanta kontroller för specifika bildgivande metoder. Specifika spårämnen bör alltid valideras mot isotypen kontroller avspeglar perfusion effekter och ospecifik bindning (t.ex. Fc receptor-medierad bindande). Mål-negativa djur kan fungera som en ytterligare kontroll för tracer specificitet, om sådana knockout modeller finns. Alternativt, blockerar experiment kan utföras för att bevisa att specificiteten av antikropp-target interaktioner35.

    Följande är kritiska steg om praktiska förfarandet: (1) noggrant bestämma de DSS koncentrationer används, som DSS känslighet kan variera mellan olika mus stammar och tillverkar/batchar36. (2) noggrant välja sond-target kombinationer. (3) Låt runt 5 min scan tid för en tillräcklig genomsökning av hela buken. Den optimala tiden peka mellan tracer ansökan och imaging förfarande måste fastställas noggrant att möjliggöra tracer ackumulering i regionen önskat mål. För intestinal F4/80 detektering i murina kolit injiceras märkta antikroppen 24 h innan du börjar skanna. (4) eftersom ospecifikt etikett ackumulering kan uppstå (t.ex. i levern), är det viktigt att märka lämpliga målvävnaden som ROI genom att placera respektive mätverktygen. Dessutom bör tillräckliga kontroller för ospecifikt tracer distribution vara ingår-överväga ospecifikt isotypen kontroller att utesluta perfusion effekter och knockout eller blockerande studier för att validera tracer-target interaktion.

    Typiska felkällor som relaterade till scanning förfarande och data återuppbyggnaden omfatta felaktig djur position, skanna fältet och exponeringstid. När positionering djuret, bör fluorescerande lesionen vara omgiven av vävnad på alla sidor för att minimera återuppbyggnad buller. Luftbubblor som fångade mellan djuret och frontglaset plattan av imaging kassetten kan också öka buller och bör tas bort genom att flytta djuret något. Över- eller underexponering av bilden kan kräva en återlåsning genomsökning med modifierad exponeringsinställningar, som kan hittas i skanningsskärmen (reflektans bild block: justeringar av främre LED intensitet och exponering tiden). När du kombinerar i vivo antikroppsbaserade FMT mätningar med besiktning histologiska analyser, såsom immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning, bör användning av antikroppar i samma klon och formatera övervägas. Också, när du utför repetitiva FMT mått i samma djur, samma format och kloner bör användas för att förhindra möjlig korsreaktivitet eller inriktningen av olika epitoper.

    Fluorescens medierad-molekylär tomografi tillsammans och gör repetitiva övervakning av sjukdomsförloppet och bakomliggande patofysiologiska processer. Det kan tillämpas på en uppsjö av biomedicinska studier och kan vara användbart att påskynda drogtester eller som en objektiv slutpunkt i individualiserade terapier. FMT-inriktning av F4/80-uttryckande makrofager i modeller av inflammation ger ett värdefullt noninvasiv verktyg för att visualisera och kvantifiera infiltration och ansamling av inflammatoriska celler samtidigt som vi också visar god korrelation till konventionella avläsning.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Författarna har något att avslöja.

    Acknowledgments

    Vi tackar Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber och Mrs Klaudia Niepagenkämper med utmärkta tekniska bistånd.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Alfalfa-free diet Harlan Laboritories, Madison, USA 2014
    Bepanthen eye ointment Bayer, Leverkusen, Germany 80469764
    Dextran sulphate sodium (DSS) TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden DB001
    Eosin Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 4382
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)                          Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany E 9884
    Florene 100V/V Abbott, Wiesbaden, Germany B506
    Haematoxylin                                                     Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany HHS32-1L
    O.C.T. Tissue Tek compound                                  Sakura, Zoeterwonde, Netherlands 4583 fixative for histological analyses
    Phosphate buffered saline, PBS Lonza, Verviers, Belgium 4629
    Sodium Chloride 0,9% Braun, Melsungen, Germany 5/12211095/0411
    Sodium bicarbonate powder Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany S5761
    Standard diet Altromin, Lage, Germany 1320
    Tissue-Tek Cryomold Sakura, Leiden, Netherlands 4566
    Hemoccult (guaiac paper test) Beckmann Coulter, Germany 3060
    Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody Serotec, Oxford, UK MCA497B
    Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1  BD Pharmingen, Heidelberg Germany 553125
    Streptavidin-Alexa546 Molecular Probes, Darmstadt, Germany S-11225 excitation/emission maximum:  556/573nm
    Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC Calteg, Burlingame, USA R2b06
    Purified anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123102
    DAPI Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany D9542
    FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 553104
    FACS buffer BD Pharmingen, Heidelberg, Germany 342003
    Cy7 NHS Ester GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany PA17104
    MPO ELISA Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany K 6631B
    Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody BioLegend, London, UK 123127 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 eBioscience, Waltham, USA 45-4801-80 ready to use labelled Antibodies (alternative)
    DMSO (Dimethyl sulfoxide) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 67-68-5
    Isoflurane Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 792632
    Ethanol Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany 64-17-5
    Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany A4612
    Tris Buffered Saline Solution (TBS) Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany SRE0032
    Name Company Catalog Number Comments
    Equipment
    FACS Calibur Flow Cytometry System BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany
    FMT 2000 In Vivo Imaging System PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA FMT2000
    True Quant 3.1 Imaging Analysis Software PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA included in FMT2000
    Leica DMLB Fluorescent Microscope Leica,  35578 Wetzlar, Germany  DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070 Bandelin, 12207 Berlin, Germany HD 2070 ultrasonic homogenizer
    Disposable scalpel No 10 Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z692395-10EA
    Metzenbaum scissors 14cm Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany 22398330
    luer lock syringe 5ml Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z248010
    syringe needles Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany Z192368 
    Falcon Tube 50ml BD Biosciences, Erembodegem, Belgium 352070

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Tags

    Medicin fråga 130 medicin gastroenterologi i vivo imaging bilddiagnostik experimentell kolit dextran sulfat natrium kolit inflammatorisk tarmsjukdom fluorescens imaging
    Fluorescens-medierad tomografi för påvisande och kvantifiering av makrofag-relaterade murina tarminflammation
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D.,… More

    Nowacki, T. M., Bettenworth, D., Brückner, M., Cordes, F., Lenze, F., Becker, A., Wildgruber, M., Eisenblätter, M. Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation. J. Vis. Exp. (130), e55942, doi:10.3791/55942 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter