Summary
Specifica della destinazione sonde rappresenta uno strumento innovativo per l'analisi dei meccanismi molecolari, come espressione della proteina in vari tipi di malattia (ad es., infiammazione, infezione e tumorigenesi). In questo studio, descriviamo una valutazione tomografica tridimensionale quantitativa di infiltrazione del macrofago intestinale in un modello murino di colite usando la tomografia di fluorescenza-mediata specifica per F4/80.
Abstract
Modelli murini di malattia sono indispensabili alla ricerca scientifica. Tuttavia, molti strumenti diagnostici quali l'endoscopia o formazione immagine tomografica non sono abitualmente impiegati nei modelli animali. Letture sperimentali convenzionali spesso si basano su analisi post-mortem ed ex vivo , che impediscono gli esami di follow-up intra-individuali e aumentano il numero di animali di studio necessari. Fluorescenza-mediata tomografia consente la valutazione non invasiva, ripetitiva, quantitativa e tridimensionale di sonde fluorescenti. È altamente sensibile e consente l'utilizzo di produttori di molecolare, che permette la rilevazione specifica e caratterizzazione di bersagli molecolari distinte. In particolare, sonde mirate rappresentano uno strumento innovativo per l'analisi di espressione genica della proteina e l'attivazione in infiammazione, malattia autoimmune, infezione, malattia vascolare, migrazione cellulare, tumorigenesi, ecc. In questo articolo, forniamo istruzioni dettagliate su questa sofisticata tecnologia di imaging per la rilevazione in vivo e la caratterizzazione di infiammazione (cioè, l'infiltrazione del macrofago di F4/80-positivo) in un modello murino ampiamente usato di infiammazione intestinale. Questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche in altre aree di ricerca, quali il rilevamento delle cellule o cellule staminali immune.
Introduction
Modelli animali sono ampiamente utilizzati nella ricerca scientifica, ed esistono molte procedure non invasive per monitorare l'attività della malattia e vitalità, come la quantificazione delle variazioni di peso corporeo o l'analisi del sangue, delle urine e le feci. Tuttavia, questi sono solo i parametri di surrogati indiretti che sono anche soggetti a variabilità inter-individuale. Essi frequentemente devono essere accompagnate da analisi post-mortem del campione di tessuto, che impedisce l'osservazione seriale in momenti ripetitivi e diretta osservazione del fisiologico o patologico elabora in vivo. Sofisticate tecniche di imaging di piccoli animali sono emersi, tra cui croce componibile imaging, imaging ottico e l'endoscopia, che consente la visualizzazione diretta di questi processi e consente anche analisi ripetitivi della stessa animali1 , 2 , 3. Inoltre, la possibilità di monitorare in modo ripetitivo vari Stati di malattia nello stesso animale potrebbe diminuire il numero di animali necessari, che potrebbe essere desiderabile da un punto di vista etico degli animali.
Diverse tecniche di imaging ottici differenti esistono per in vivo imaging di fluorescenza. Originariamente, imaging confocale è stata impiegata per studiare la superficie e di sottosuolo eventi fluorescente4,5. Recentemente, tuttavia, tomografiche sistemi che consentono per le valutazioni quantitative del tessuto tridimensionale sono stati sviluppati6. Questo è stato compiuto attraverso lo sviluppo di sonde fluorescenti che emettono luce nello spettro infrarosso vicino (NIR), che offre a basso assorbimento, rivelatori sensibili e sorgenti di luce monocromatica7. Mentre le tecniche di imaging cross-sectioning tradizionali, come la tomografia computata (CT), la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI) o ecografia (US), si basano principalmente su parametri fisici e visualizzare la morfologia, imaging ottico può fornire ulteriori informazioni sui processi molecolari sottostanti utilizzando endogene o esogene fluorescenti sonde8.
Progressi della biologia molecolare hanno contribuito a facilitare la generazione di sonde molecolari fluorescenti e mirate per un crescente numero di bersagli. Ad esempio, ricevitore-ha mediato l'assorbimento e la distribuzione in una zona di destinazione specificata può essere visualizzati utilizzando carbocyanine derivato-etichettato anticorpi9. L'abbondanza di anticorpi disponibili, che possono essere etichettati come elementi traccianti specifici in zone altrimenti inaccessibili del corpo, fornisce approfondimenti senza precedenti di processi cellulari e molecolari in modelli di tumorigenesi e neurodegenerative, malattie cardiovascolari, immunologica e infiammatoria7.
In questo studio, descriviamo l'uso di tomografia fluorescenza-mediata in un modello murino di colite. Destrano solfato di sodio (DSS)-colite indotta è un modello standard del mouse chimicamente indotta di infiammazione intestinale simile infiammatorie intestinali (IBD) la malattia10. È particolarmente utile valutare il contributo del sistema immunitario innato allo sviluppo dell'intestino infiammazione11. Poiché il reclutamento, l'attivazione e infiltrazione di monociti e macrofagi rappresentano passaggi cruciali nella patogenesi delle IBD, visualizzazione della loro assunzione e la cinetica di infiltrazione sono essenziali per monitoraggio, ad esempio, l'effetto di sostanze terapeutiche potenziali in un' impostazione preclinici12. Descriviamo l'induzione di colite DSS e dimostrare la caratterizzazione tomografia-mediata di infiltrazione dei macrofagi nella mucosa dell'intestino usando la fluorescenza molecolare tomografia per la visualizzazione di specifica del marcatore del monocito/macrofago F4/80 13. Inoltre, ci illustrano le procedure ausiliari e supplementari, come l'etichettatura dell'anticorpo; la messa a punto sperimentale; e analisi e interpretazione delle immagini ottenute, in correlazione con le letture convenzionali quali gli indici di attività di malattia, flusso cytometry e l'analisi istologica e immunoistochimica. Discutiamo le limitazioni di questa tecnica e i confronti con altre modalità di formazione immagine.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen secondo la legge di protezione animale tedesco (Tierschutzgesetz).
1. materiali e messa a punto sperimentale
- Cura degli animali.
- Utilizzare topi di pari età e del sesso di qualsiasi ceppo DSS-sensibili (ad es., C57BL/6) a 20-25 g di peso corporeo.
- Pianificare almeno cinque o più topi per ogni gruppo sperimentale e casa i topi secondo linee guida locale cura degli animali.
- Fornire un cibo del roditore standard dieta e sterilizzato nell'autoclave acqua potabile ad libitum.
- Rimuovere il cibo standard e sostituirlo con chow privo di erba medica, almeno tre giorni prima della scansione per ridurre endoluminal auto-fluorescenza.
- Induzione di colite acuta indotta da DSS.
- Sciogliere 2 g di DSS (peso molecolare ~ 40.000 Da) in 100 mL di acqua potabile in autoclave per ottenere un 2% (p/v soluzione).
- Riempire il potabile dei topi esclusivamente con la soluzione DSS e stimare 5 mL di liquido per topo al giorno. Fornire la stessa acqua potabile senza DSS per i topi di controllo10.
Nota: Monitorare i topi al giorno fino alla fine dell'esperimento. I topi che perdono più del 20% del loro peso corporeo iniziale o che diventano moribondi di eutanasia (vale a dire, con insistenza postura, riduzione del movimento curvo, lavorarono respirazione, marcatamente erigere cappotto) secondo le linee guida locali applicabili su animale benessere degli animali.
- Preparazione di tomografia fluorescenza-mediata.
- Etichettare l'anticorpo desiderato (ad es., ratto anti-topo F4/80) con la tintura di fluorescenza (ad es., Cyanine7, λeccitazione: 750 nm, λemissione: 776 nm) come descritto nel protocollo del produttore. Dializzare anticorpo purificato in una membrana di dialisi appropriato (dimensione dei pori < 50-100 kDa) contro 1 L di cloruro di sodio 0,15 M per almeno 2 ore o durante la notte.
- Trasferire l'anticorpo a 1 L di 0.1 M NaHCO3 e Dializzare per almeno 2 h.
- Sciogliere la quantità necessaria di tintura fluorescente in dimetilsolfossido (DMSO) (10,8 µ l/mg di anticorpo) e aggiungerlo alla soluzione di anticorpo. Utilizzare il colorante fluorescente in eccesso molare di 20 volte per ottenere un tintura / proteine in rapporto di 1:3.
- Incubare al buio a 4 ° C per 1 h. rimuovere anticorpo adenoide dialisi contro 1 L di sodio 0,15 M o utilizzando una colonna di dissalazione PD-10 e risolvere in tampone fosfato salino (PBS) per applicazione in vivo .
- Determinare la concentrazione di anticorpi finale e il rapporto d'etichettatura mediante spettrofotometria.
- Misurare la concentrazione di proteina ad un assorbimento di 250-330 nm e prendere in considerazione ulteriore assorbimento dal colorante. Correggere il massimo assorbimento a 280 nm (proteina) dell'11% dell'assorbimento massimo a 750 nm (passo successivo) per l'etichettatura di Cyanine7.
- Misurare una diluizione del composto (in genere 01:10) a 250-800 nm ed estrarre la concentrazione di Cyanine7 a 750 nm.
- Determinare il rapporto di tintura / proteine come: tintura/anticorpo = assorbimento massimo a 750 nm / 200.000 / (massimo assorbimento a 280 nm - 0,11 x max assorbimento a 750 nm) / 170.000.
- Mantenere la soluzione di anticorpo a 4 ° C e protetto da luce per evitare di imbianchimento prima dell'iniezione.
- Caricare il volume di soluzione di anticorpo necessarie in una siringa sterile immediatamente prima dell'iniezione e scudo dalla luce fino a quando non viene utilizzato.
- Determinare la tempistica ottima dell'iniezione di sonda e la procedura di scansione, a seconda della farmacocinetica di tracciante.
- Anestetizzare i topi utilizzando isoflurane 1.5-2.5% per inalazione di ossigeno o metterli in modo sicuro in un dispositivo di ritenuta dedicato per l'iniezione della vena della coda degli anticorpi con etichettati.
- Per gli anticorpi del full-length, iniettare l'anticorpo marcato almeno 24 h prima della scansione, ad esempio per visualizzazione di macrofago F4/80 anti-topo nella colite murina. Iniettare topi per via endovenosa (i.v.) tramite la coda della vena con anticorpo marcato in un importo corrispondente a 2,0 nmol di colorante.
- Uso ugualmente etichettato anticorpi non specifici (ad es., IgG di topo o un altro isotipo corrispondente al patrimonio anticorpo primario) come un controllo di isotipo in dosi equivalenti a quelle della sonda specifica.
Nota: I risultati in vivo di scansioni dopo iniezione del controllo composto può servire come riferimento per l'interpretazione della sonda specifica dati di imaging. - Utilizzare un rasoio elettrico per radere il pelo animale nella regione addominale per ridurre al minimo assorbimento e riflessione della luce.
- Etichettare l'anticorpo desiderato (ad es., ratto anti-topo F4/80) con la tintura di fluorescenza (ad es., Cyanine7, λeccitazione: 750 nm, λemissione: 776 nm) come descritto nel protocollo del produttore. Dializzare anticorpo purificato in una membrana di dialisi appropriato (dimensione dei pori < 50-100 kDa) contro 1 L di cloruro di sodio 0,15 M per almeno 2 ore o durante la notte.
2. technical Equipment
- Utilizzare un dispositivo di veterinaria fluorescenza-mediata tomografia (FMT) per piccoli animali fluorescenza ( Figura 4).
- Creare un nuovo studio per ogni progetto facendo clic su "nuovo studio" pulsante e includere nella descrizione studio i traccianti pertinenti, compresi i parametri di imaging e dosi per riferimento futuro.
- All'interno di questo studio, creare gruppi di studio secondo il disegno di studio rispettivo (ad es., per il tracer specifico e non specifico isotipo controllo) facendo clic su "nuovo gruppo di studio" pulsante. Dotare ogni gruppo di studio con il rispettivo numero di animali.
- Calibrazione del sistema per i costrutti di tracciante.
- Eseguire la calibrazione per ogni batch di traccianti per normalizzare la variazione nell'etichettatura e consentono una misurazione quantitativa da dati OI.
- Seguire le indicazioni del produttore dello strumento per la calibrazione di ogni singolo impianto; Se si seleziona "Aggiungi nuovo elemento tracciante", il sistema fornirà una guida attraverso i passi. Fornire la diluizione della soluzione applicata dell'anticorpo e la concentrazione assoluta calcolata dell'elemento tracciante nella sonda.
- Per FMT, utilizzare un fantasma che imita il tessuto delle caratteristiche definite di spessore e assorbimento (simile a tessuto vitale) e riempirlo con un volume specifico della soluzione anticorpo utilizzato. Misurare questo sul dispositivo FMT.
Nota: Il sistema utilizzerà la misura di riferimento della sonda fornita, insieme con la data concentrazione, per calcolare le concentrazioni di tracciante assoluta da futuri in vivo misure.
- Utilizzare una cassetta di esame riscaldabile con una temperatura di 42 ° C.
Nota: Questo impedisce i topi di diventare ipotermica durante l'esame.
3. animale anestesia
- Utilizzare un flusso continuo di 1.5-2% vol % isoflurane ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) e 1,5 L O2/min per anestetizzare i topi.
4. fluorescenza-mediata di tomografia
Nota: Adattare i seguenti dettagli, che sono specifici del sistema FMT utilizzato in questo studio (Vedi la Tabella materiali) per dispositivi di imaging di fluorescenza alternativi riflettanza o sistemi di FMT, come necessario.
- Posizionare il mouse anestetizzato sul dorso nel cassetto l'esame.
- Eseguire la procedura di scansione.
- Inserire la cassetta nel sistema di formazione immagine e chiudere immediatamente per garantire l'anestesia continua. Selezionare l'esempio appropriato dal gruppo di studio creato in precedenza. Selezionare il tracer amministrato dal menu a discesa per garantire che i valori di concentrazione del tracciante vengono calcolati correttamente.
- Acquisire l'immagine di riflettanza di fluorescenza alla lunghezza d'onda appropriata (720 nm per Cyanine7) per la pianificazione di scansione e muta il campo di scansione facendo clic sul pulsante "acquisizione immagine".
- Vedere che il campo di scansione viene visualizzata come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza di fluorescenza. Regolarlo nella regione di interesse (ad esempio, due punti o addome), evitando di aria o aree di pelliccia resto. A seconda del target di immagine, impostare il numero di immagine punti dati all'interno del campo di scansione scegliendo tra la grossa media e fine campo di scansione risoluzione nel menu sulla destra.
Nota: Tenere presente che un campo di scansione potrebbe offrire la migliore risoluzione spaziale al costo di un tempo significativamente più lungamente scansione. - Avviare l'acquisizione di dati/immagini alla lunghezza d'onda selezionata facendo clic su "scansione".
Nota: Il tempo di scansione per una scansione medio-fine dell'intero addome sarà circa 5 min; in questo tempo, ogni punto di dati separatamente è illuminato dal laser di eccitazione, e la fluorescenza risultante viene registrata. - Rimuovere l'animale dal cassetto imaging alla fine della scansione e permettere all'animale di recuperare completamente prima di inserirlo nuovamente dentro la gabbia.
- Se ritenuto necessario in vari momenti durante l'esperimento, ripetere il FMT (ad es., i giorni 0, 5 e 9-10 (fine dell'esperimento)), ma considera l'accumulo di anticorpi nel corpo, perciò aumentando il segnale di fluorescenza di fondo.
5. post-scansione
- Posizionare il mouse in una gabbia separata su un tovagliolo di carta sotto una lampada riscaldante a luci rosse e monitorare il mouse per i segni di disagio o di difficoltà fino al completo recupero. Posizionare il mouse indietro nella sua gabbia rispettivo quando completamente sveglio.
- Eutanasia il mouse alla fine dell'esperimento per la consegna di CO2 per l'isolatore ad una dose di 100% (v/v), 100% in volume e 3 L/min. Non pre-riempire la camera con CO2, come un improvviso esposizione ad alte concentrazioni di CO2 potrebbe causare angoscia. Verificare la morte dopo che il mouse ha smesso di respirare da una modalità secondaria successiva dell'eutanasia come rapida dislocazione cervicale.
- Explant colon tramite la laparotomia addominale ed eseguire una scansione ex vivo del colon espiantato, come spiegato nella procedura 4.2.1 - 4.2.4. Aprire ogni colon longitudinalmente usando forbici chirurgiche Metzenbaum e sciacquare abbondantemente con soluzione salina prima di prepararlo per ulteriori analisi.
- Utilizzare un bisturi per tagliare un frammento di 0,5 cm dal colon distale e metterlo immediatamente in un tubo criogenico di 1,5 mL. Congelamento in azoto liquido e conservare a-70 ° C fino all'ulteriore utilizzo (ad es.,myeloperoxidase (MPO) misure).
- Utilizzare un bastoncino di legno e arrotolare il restante colon longitudinalmente aperto dal distale alla estremità prossimale, con il verso l'esterno di mucosa "(tecnica Swiss roll"), per le analisi istologiche. Posizionare la preparazione in un fissativo (Vedi la Tabella materiali) e congelare a-80 ° C14.
6. interpretazione e ricostruzione di dati
- Utilizzare lo strumento di ricostruzione del rispettivo software di imaging per creare mappe 3D della distribuzione fluorescenza dai dati grezzi di imaging; scansioni vengono aggiunti automaticamente per lo strumento di ricostruzione, quando dopo la scansione, la funzione "Aggiungi alla coda di ricostruzione" è selezionata.
- In caso contrario, selezionare le scansioni dal menu a discesa sotto il rispettivo studio e gruppo di studio, pulsante destro del mouse la scansione e selezionare "Aggiungi alla ricostruzione".
- Per ulteriori analisi, è possibile caricare un set di dati nel software di analisi. Dal menu a discesa nella barra in alto, selezionare il rispettivo studio e quindi selezionare il gruppo di studio e il singolo animale dal menu sulla destra; tutte le scansioni eseguite per questo animale verranno mostrate. Selezionare la corretta scansione e fare clic su "carica".
Nota: La ricostruzione 3D della distribuzione dell'elemento tracciante apparirà sulla sinistra come una sovrapposizione dell'immagine di riflettanza di fluorescenza inizialmente acquistata. Il modello può essere ruotato e ingrandito per semplificarne l'analisi. - I fuochi di accumulazione di etichetta non specifico (ad es., fegato o urina vescica) su mappe 3D ricostruite di identificare e differenziare da tessuti bersaglio (ad es., intestino o intestino).
- Dalla barra in alto, selezionare la forma ROI più appropriata per il target. Etichetta tessuto bersaglio come regioni di interesse (ROI) inserendo i rispettivi strumenti di misurazione del software di analisi; il software fornirà un'intensità di fluorescenza per il ROI, come pure (pico-) quantità molare del tracciante che la scansione è stata calibrata per.
- Selezionare l'importo totale dell'elemento tracciante nel ROI appropriato, normalizzato per la dimensione ROI, come l'equivalente più adatto per la valutazione dell'attività di malattia in correlazione con l'infiltrato infiammatorio (istologia).
Nota: Altre caratteristiche del ROI possono essere scelto se appropriato come rappresentante del modello particolare.
7.Ex Vivo Analisi
- Ematossilina ed eosina e colorazione di immunofluorescenza.
- Deparaffinizzare sezioni ponendoli in 70% di etanolo (EtOH) per 2 min; Sciacquare con acqua distillata. Macchia con la soluzione di ematossilina per 5 min e successivamente risciacquare con acqua calda di rubinetto per 10 min.
- Sciacquare con acqua distillata, colorante di contrasto con soluzione di eosina per 2 minuti e sciacquare nuovamente con acqua distillata.
- Posto in 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH e xilene (2 volte) per 2 minuti ciascuno per disidratare e deselezionare le sezioni. Montare con mezzo di montaggio resinoso.
- Colorazione di immunofluorescenza.
- Utilizzare le sezioni di tessuto ottenuti in precedenza ("Swiss roll") per la colorazione di immunofluorescenza e preparare sezioni cryo-taglio di 7 µm.
- Bloccare le sezioni del colon acetone-fisso e congelato nel siero di ratto 5,0% per 10 min e incubare per una notte con anticorpo diluito (1/500 v/v) biotinylated del ratto primario anti-topo F4/80. Lavare le sezioni tre volte in soluzione fisiologica tamponata (TBS) ed incubare con Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) in PBS/BSA (0,1% p/v) overnight a 4 ° C.
- Lavare le sezioni in TBS e macchia con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v) per ottenere il contrasto. Analizzare le immagini di fluorescenza sotto un microscopio confocale (Vedi la Tabella materiali; ingrandimento 40x; cubo filtro N2.1 con filtro di eccitazione 515-560) e contare le celle F4/80-positivo per campo ad alta potenza.
Nota: È consigliabile utilizzare gli anticorpi dello stesso clone e formato quando si combinano in vivo FMT e post-mortem istologia analisi quali immunoistochimica o colorazione di immunofluorescenza, a seconda del target previsto. Per la rilevazione di F4/80-positivi macrofagi in vivo ed ex vivo, sono stati utilizzati diversi formati.
- Misurazioni di MPO in campioni di due punti.
- Uso appena ottenuto, PBS-è risciacquata del colon campioni o campioni scongelati per misurazioni di MPO. Pesare tutti i campioni e omogeneizzare il tessuto in tampone di lisi fornito nell'ELISA kit (Vedi la Tabella materiali) ad un volume di 20 µ l di tampone di lisi per mg di tessuto.
- Sonicare per 15 s (frequenza di sonicazione: 20 kHz, potenza: 70 W) e centrifugare i campioni per 10 min a 200 x g e a 4 ° C.
- Uso una ELISA disponibile in commercio kit (vedere la Tabella materiali) secondo la descrizione di manufatti. Eseguire il test in duplicati.
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Representative Results
Valutazione di colite:
Colite DSS indotta è un modello murino chimicamente indotto di infiammazione intestinale che assomiglia a IBD umana e conduce alla perdita di peso, sanguinamento rettale, ulcerazione superficiale e danno mucoso in topi suscettibili15. È particolarmente utile studiare il contributo del sistema immunitario innato per lo sviluppo di infiammazione intestinale10,11. Per potente inducono infiammazione colitic, topi erano continuamente somministrato DSS in tutto l'esperimento. Diminuzione del peso corporeo e l'anima occulta fecale sono stati usati come indici clinici di infiammazione. Come mostrato in Figura 1A, topi cominciarono a perdere peso a partire da quattro giorni dopo l'induzione di colite, mentre animali di controllo che ricevono acqua da sola ha mostrato nessun cambiamento significativo nel peso corporeo. Inoltre, colitic animali hanno mostrato escrezione aumentata di sangue occulto con le feci (Figura 1B), come valutato facendo uso del hemoccult seguente sistema di Punteggio: 0 (senza sangue), 1 (hemoccult positivo), 2 (hemoccult positivo e visual pellet sanguinamento) e 4 ( lordo di sanguinamento, sangue intorno ano)16. Lunghezza del colon è stata misurata per valutare accorciamento colica indotta da infiammazione, rivelando due punti significativamente ridotti nei topi colitic rispetto ai topi di controllo che ricevono acqua da sola (Figura 1). Per valutare direttamente il danno colico, analisi istologica è stata effettuata alla fine dell'esperimento. Una valutazione quantitativa del danno istologico è stata effettuata su colica H & sezioni colorate con EE utilizzando un nucleo di pregiudizio globale basato sul grado e le dimensioni di infiammazione, danno cripta e partecipazione percentuale17. Colitic topi ha mostrato segni di infiammazione severa, mentre topi di controllo che ricevono nessun DSS ha mostrato nessun danno istologico (Figura 1). Le immagini mostrano cambiamenti infiammatori caratteristici nella colite DSS indotta, caratterizzata dalla distruzione dell'architettura epiteliale, con la perdita di cellule caliciformi, cripta danni e ulcerazione mucosa, al contrario di quella in gran parte conservata della mucosa architettura in topi di controllo18. Le differenze statistiche fra i gruppi (n = 5 per gruppo) sono stati calcolati da analisi della varianza (ANOVA) seguita da Student-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc test o test di Welch seguita da giochi-Howell post hoc test in caso di disomogeneità di varianza significativa. Un p-valore di < 0,05 è stato considerato significativo.
Valutazione di monociti e macrofagi reclutamento:
Come colite DSS indotta è associata con l'infiltrazione di cellule immunitarie, come i monociti e macrofagi, in mucosa e sottomucosa del colon, abbiamo utilizzato la macchiatura immunofluorescente per il marcatore del monocito/macrofago F4/80 per quantificare l'infiltrato. Colitic topi che ricevono DSS ha mostrato un numero significativamente elevato di monociti infiltrante la parete del colon rispetto ai topi di controllo non-colitic (Figura 2A). L'infiltrazione del leucocita inoltre è stata quantificata usando la macchiatura immunofluorescente per il marcatore dei neutrofili GR1, rivelando l'immigrazione significativamente aumentato dei neutrofili nel colon infiammato rispetto ai topi di controllo (Figura 2B). Per confermare, MPO livelli che riflettono entrambi attività infiammatoria e numero dei neutrofili erano significativamente elevati nel tessuto del colon dei topi colitic (Figura 2). ANOVA e test post hoc S.N.K. sono stati utilizzati per calcolare la significatività statistica fra i gruppi (n = 5 per gruppo). Significatività statistica è stata fissata a p < 0.05.
Cambiamenti sistematici nel macrofago sottopopolazione:
I monociti mouse comprendono un gruppo eterogeneo di distinte sottopopolazioni che differiscono in stato di maturazione e la loro capacità di essere reclutati per siti infiammatori, dove partecipano nell'inizio e nel perpetuare la risposta infiammatoria19 . Di conseguenza, abbiamo caratterizzato i monociti del sangue analizzando l'espressione differenziale di CD11b e Ly6C mediante citometria a flusso. In condizioni infiammatorie di colite acuta DSS, abbiamo osservato un aumento significativo in infiammatorio CD11baltaLy6C monocitialta rispetto alle condizioni pre-esperimento. Al contrario, questo cambiamento non avvenne nei topi di controllo non colitic senza DSS (Figura 3A). I dati (n = 5 per gruppo) sono stati analizzati mediante ANOVA e S.N.K. Come parametro aggiuntivo surrogato per infiammazione sistemica, abbiamo valutato la presenza di cellule di F4/80-positive nella milza dei topi colitic rispetto ai controlli non colitic, che ha rivelato un aumento significativo in topi DSS-trattati (Figura 3).
Esplorazione di tomografia fluorescenza-mediata:
Abbiamo usato la tomografia di fluorescenza-mediata per misurare reclutamento di monociti/macrofagi e infiltrazione nella mucosa dell'intestino. Un anticorpo marcato con fluorescenza contro murino F4/80 è stato impiegato per visualizzare direttamente i macrofagi attivati in animali vivi. Gli anticorpi di IgG di topo etichettati, aspecifici sono stati utilizzati come il controllo di isotipo. Per la scansione, topi sono stati rasati nella regione addominale per ridurre al minimo la riflessione della luce dalla pelliccia, anestetizzati da isoflurane continuo rifornimento ed esaminati in un dispositivo FMT veterinario per piccoli animali fluorescenza. Come mostrato in Figura 4A, l'induzione di colite hanno portata a un significativamente elevato accumulo del tracciante fluorescente in due punti dei topi colitic rispetto ai comandi non colitic, che indica un aumento del monocito infiltrazione e differenziazione nei macrofagi attivi negli animali colitic. L'applicazione di un IgG etichettato fluorescenza aspecifica non ha provocato una risposta rilevabili fluorescenza nell'addome e intestino, né il colitic (DSS) né il gruppo non colitic (acqua), dimostrando la specificità dell'obiettivo sonda interazione dell'anticorpo F4/80 (Figura 4A). Immagini rappresentative della regione addominale sono mostrati. Il codice di colore indica il livello di intensità di fluorescenza, che corrisponde alla misura dell'infiltrato infiammatorio(Figura 4B e 4C).Ex vivo misurazioni di F4/80-regia di accumulazione dell'elemento tracciante in punti espiantati e verificato l'origine colica del segnale in vivo rilevato di accumulo del tracciante F4/80 (Figura 5A e 5B). Importi calcolati dell'anticorpo associato correlato bene (R2 = 0,52) con istologicamente determinati numeri di infiltrazione macrofagi (Figura 5 e 5D), confermando che in vivo la formazione immagine con traccianti specifici possa essere indicativo di attività di malattia locale. I dati sono stati analizzati mediante test ANOVA e S.N.K. post hoc, con un livello di significatività statistico a p < 0.05. La correlazione è stata calcolata come regressione lineare.
Figura 1 . I parametri clinici e istologico ferita nel corso di colite acuta DSS.
Topi C57BL/6 sono stati sfidati con DSS (2% p/v) in acqua potabile per 8 giorni. Topi di controllo sono stati dati l'acqua potabile senza DSS. Gli animali sono stati sacrificati il giorno 9. Vengono mostrati i dati di un esperimento (n = 5 per gruppo) ± errore standard della media (SEM). (A) cambiamenti nel peso corporeo sono presentati rispetto al peso iniziale. (B) sangue escrezione nelle feci, come determinato dal test di carta guaiaco (hemoccult, 0 = negativo, 4 = sangue macroscopicamente). (C) lunghezza Post-mortem del colon. (D) lesioni istologiche come valutato tramite il grado di danno della cripta e il grado di infiammazione. Vengono riportate le immagini istologiche rappresentative (ematossilina/eosina; ingrandimenti: (pannello superiore): 10x, 20x (pannello inferiore)) di colitic (pannelli a sinistra) o topi di controllo (pannelli di destra). Nota la profonda distruzione dell'architettura epiteliale e infiltrati infiammatori (frecce). Grafico a barre: segno di ferita. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Intestinali monociti e macrofagi infiltrarsi.
DSS colite è stata indotta in C57BL/6 mediante l'applicazione di DSS (2% p/v) in acqua potabile. Topi di controllo ha ricevuto l'acqua potabile da solo. I dati da n = 5 topi per ogni gruppo sono mostrati ± SEM. (A) visualizzazione immunofluorescente delle infiltrazioni dei macrofagi nella mucosa. Vengono riportate le immagini rappresentative di anti-F4/80 macchiatura in colitic e topi di controllo. Grafico a barre: campo di cellule totali/alto potere (HPF). (B) immunofluorescente visualizzazione di infiltrazioni del neutrofilo mucosa. Vengono riportate immagini rappresentative di macchiatura in controlli e colitic animali anti-Gr-1. Grafico a barre: cellulari totali/HPF. Concentrazione di MPO (C) nel tessuto colico di topi colitic e non colitic. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Reclutamento di monociti al comparto intestinale.
I monociti del sangue periferico da topi colitic così come i topi di controllo (n = 5 per gruppo) sono stati analizzati mediante citometria a flusso per l'espressione di Ly - 6C su cellule CD11b-positive. Le cellule erano ordinate in base alla espressione di SSC e CD11b. Monociti del mouse sono stati identificati come pile dialta CD11bbassoSSC, ed è stata analizzata la loro espressione di Ly6C. (A) proporzionale cambia verso Ly6C infiammatoria monocitialta sono raffigurati relativa alle condizioni di pre-esperimento (variazione % ± SEM). (B) appezzamenti di dot FACS di Ly6C espressione su SSClussoCD11balte cellule di animali colitic prima e dopo induzione di colite (pannelli inferiori) e controlli pre e post-esperimento (pannelli superiori). (C) Splenocytes dai topi colitic e non colitic sono state valutate per l'espressione di F4/80 da citometria a flusso (media di fluorescenza intensità ± SEM). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Visualizzazione tomografica del macrofago si infiltra nella colite murina.
FMT analizza in topi colitic e non colitic controlli amministrati anticorpo coniugato Cyanine7 contro murino F4/80 (n = 5 per gruppo). Grafico a barre (A) : l'intensità di fluorescenza totale in pmol di tintura è stata determinata nel ROI e raffigurati ± SEM. rappresentante immagini vengono visualizzate con l'intensità di fluorescenza con codice colore corrispondente nella misura di infiltrato infiammatorio nei topi iniettati con la sonda specifica (anti-topo F4/80) un controllo non specifico (ratto IgG) e (B) (C). In entrambi i casi, un ROI di uguali dimensioni è stato disposto trasversa nella parte superiore dell'addome per ulteriori analisi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Ex vivo convalida della specificità dell'elemento tracciante nella colite murina.
In vivo FMT scansioni in colitic topi iniettati con la sonda specifica (anti-topo F4/80) sono stati seguiti da ex vivo scansioni planari fluorescenza degli intestini explanted di dimostrare l'origine colica del segnale tracciante ottenuto in vivo. Dati da due esperimenti con un totale di n = 8 animali sono mostrati. Immagini rappresentative sono mostrati raffigurante in vivo scansioni FMT di topi colitic con fluorescenza color-coded intensità corrispondente nella misura di infiltrato infiammatorio (A).Imaging di riflettanza di fluorescenza delle viscere explanted permette l'identificazione di specifiche regioni con accumulo del tracciante (B). Rappresentante post-mortem immunofluorescenza colorazione per i macrofagi F4/80-positivo da tali superfici conferma i risultati in vivo (C). Il numero di infiltrazione di macrofagi, come determinato dalla colorazione di immunofluorescenza, sono stati correlati con in vivo misurati accumulazione dell'elemento tracciante (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se le tecniche di imaging medicale si sono evolute rapidamente negli ultimi anni, siamo ancora limitati nella nostra capacità di rilevare processi infiammatori o tumori, nonché altre malattie, nelle loro prime fasi di sviluppo. Tuttavia, questo è fondamentale per la crescita del tumore di comprensione, invasione, o lo sviluppo di metastasi e processi cellulari, nello sviluppo di patologie infiammatorie e malattie degenerative, cardiovascolari e immunologiche. Mentre le tecniche di imaging tradizionale si basano su parametri fisici o fisiologici, imaging molecolare consente la visualizzazione di specifici marcatori molecolari in vivo20.
Per l'imaging di piccoli animali, approcci basati su radionuclide (ad es., single-fotone emissione tomografia computata (SPECT) e tomografia a emissione di positroni (PET)), l'ultrasuono e la formazione immagine di fluorescenza-mediata può essere utilizzati per visualizzare specifici strutture bersaglio molecolare. L'uso di anticorpi full-length come spina dorsale più disponibile tracciante richiede etichette di lunga durata, come tempi di lunga durata di circolazione e tessuto lenta penetrazione ritardo il tempo di imaging dopo applicazione tracer. Radionuclidi tipici di formazione immagini non sono pertanto adatti per l'imaging in vivo della distribuzione dell'anticorpo. L'uso degli isotopi longevi come Cu64 o In111 consente traccianti base di anticorpi, ma richiede un'infrastruttura complessa che attraversa generazione isotopo, sicurezza di radiazione prima e durante la procedura di etichettatura e alloggiamento animale dopo l'applicazione di sonda schermato. La variante più economica e più sicura sarebbe essere fluorescenza-mediata di imaging.
Diversi in vivo sistemi di imaging per la rilevazione, visualizzazione e misurazione della distribuzione di tintura fluorescente in animali vivi sono state presentate negli ultimi due decenni21. Maggior parte dei sistemi consentono immagini planari rapido adatto per l'imaging di lesione superficiale. A causa di assorbimento della luce e dispersione, segnali nei profondo il tessuto eludere immagini planari. La più importante soluzione per questo problema è di fluorescenza tomografia22. Basato su modelli matematici, il segnale di immagine è stato corretto per assorbimento di scattering e luce e un dataset 3D virtuale è calcolato dal dataset multi-proiezione8. L'algoritmo fornisce dati completamente quantitativi, consentendo la stima delle concentrazioni di tracciante in rappresentanza di regioni specifiche della destinazione concentrazione/espressione23. Una rilevante limitazione di FMT è legata alla scarsa risoluzione spaziale rispetto alle tecniche di imaging anatomici, che potrebbe-a seconda del desiderato destinazione-compromesso l'assegnazione di informazioni molecolari alle strutture anatomiche specifiche. Un'altra limitazione si trova nella profondità limitata penetrazione della luce nel tessuto, che richiede l'utilizzo di sonde assorbendo e che reagiscono in rosso a NIR gamma spettrale23.
Una modalità di imaging introdotta di recente che unisce i vantaggi dell'ecografia morfologica e la possibilità di ottenere informazioni molecolari da formazione immagine di fluorescenza è optoacoustic imaging. Risultati preliminari dai primi studi indicano che, nonostante la necessità di ulteriore affinamento tecnico-optoacoustic imaging tiene grande promessa per imaging molecolare e potenziali applicazioni traslazionale24.
Il reclutamento dei leucociti alla parete intestinale è un passo fondamentale nell'inizio e nella perpetuazione di IBD, come è il reclutamento di cellule infiammatorie nel sito di infezione o infiammazione in molte malattie immuno-mediate, come malattia autoimmune, infezione, malattia vascolare, tumorigenesi e molti più25. Come attivazione del monocito e infiltrazione nella mucosa intestinale è un passo essenziale nella patogenesi delle IBD, inibizione di infiltrazione del monocito, orchestrata da chemochine e l'interazione della molecola di adesione integrine-cellulare, è un promettente terapeutico approccio12,26. Pertanto, il monitoraggio del leucocita traffico al sito di infiammazione è cruciale nello sviluppo di nuove opzioni terapeutiche per visualizzare gli effetti antinfiammatori dei farmaci studiati. Questo può essere di particolare interesse perché sono stati sviluppati gli agenti del leucocita lotta contro la tratta, e alcuni anticorpi anti-integrina sono già disponibili per la terapia IBD, mentre ulteriori componenti sarà disponibile nel prossimo futuro26. Vedolizumab, un anticorpo monoclonale umanizzato contro la subunità di integrina α4β7 gut-specifici ed Etrolizumab, che lega la subunità β7 del α4β7 intestinale ed eterodimeri integrina αEβ7, sono stati approvati27,28. Altri agenti (per esempio, il MAdCAM-1 PF-00547659 e modulatori del recettore di sfingosina-1-fosfato (S1P) come Ozanimod) sono attualmente in fase di valutazione per il trattamento delle IBD29,30.
Quando si esegue FMT, possibili modifiche della tecnica includono la selezione di tracciante-destinazione differenti combinazioni, così come combinando FMT con approcci per compensare la scarsa risoluzione spaziale di imaging strutturale. Una vasta gamma di combinazioni di sonda-target è stata stabilita e commercializzata. Per progetti specifici, l'etichettatura di anticorpi su ordinazione possono essere fatta usando commerciale etichettatura kit e il protocollo sopra descritto. A seconda dell'anticorpo o più piccolo peptide scelto come la frazione di targeting, fornitori commerciali offrono una vasta gamma di etichette diverse. Considera il colorante desiderato, a seconda dell'applicazione: per deep tissue imaging, un colorante che operano nello spettro NIR (ad es., Cy7, λex / em 750/780 nm) potrebbe essere adatto, mentre la luminosità complessiva e la luce efficace fornitura di coloranti operativa nel campo vicino-visibile dello spettro (ad esempio, analoghi GFP) potrebbe essere preferibile. Praticamente tutti i coloranti possono essere ottenuti come un estere attivo per etichetta i residui di lisina delle proteine, così come con moiety associazione alternativa, ad esempio le maleimidi per l'associazione di cisteina o biotina per l'etichettatura delle proteine dotate di tag specifici di etichettatura31 . La selezione dell'etichetta non cambia il protocollo di principio, ma richiede solo lievi modifiche del regime di etichettatura ed è importante per un buon risultato di imaging. Un'altra modifica interessante per superare i limiti nella risoluzione spaziale è quello di combinare FMT con TC o RM, consentendo l'annotazione delle strutture anatomiche con informazioni molecolari.Le informazioni strutturali possono sia essere acquisite in sequenza come informazioni a priori o simultaneamente, che richiede strumentazione32,33di imaging ibrido.
Alcuni passaggi del protocollo meritano particolare attenzione. Come questa tecnica può essere adattata per una moltitudine di photoprobes fluorescente destinati a una varietà di molecole specifiche rappresentative dei diversi processi molecolari, è essenziale per consentire la distribuzione sufficiente del sonde e arricchimento nella regione di destinazione desiderata. Il punto di tempo ideale per l'imaging potrebbe variare secondo la combinazione di sonda-destinazione. Ad esempio, anticorpo targeting di recettori del tumore potrebbe essere influenzato dal tasso di diffusione di tumori, l'assorbimento e il metabolismo dal fegato e possibili reazioni avverse immunogeno34. Considera anche i controlli pertinenti per specifici approcci di imaging. Traccianti specifici devono sempre essere convalidati contro controlli isotipo che riflette effetti di aspersione e aspecifici associazione (ad es., un legame recettore-mediata Fc). Animali di destinazione-negativo possono servire come un controllo aggiuntivo per la specificità dell'elemento tracciante, se esistono tali modelli knockout. In alternativa, può essere eseguita bloccando gli esperimenti per dimostrare la specificità dell'anticorpo-destinazione interazioni35.
I seguenti sono passaggi critici riguardanti gli aspetti pratici della procedura: (1) accuratamente determinare le concentrazioni di DSS utilizzate, come suscettibilità DSS potrebbe variare tra mouse diverso ceppi e produce/lotti36. (2) con attenzione selezionare combinazioni di sonda-target. (3) consentire circa 5 min di tempo di scansione per una sufficiente esplorazione dell'intero addome. Il momento ottimale punto tra applicazione tracer e la procedura di imaging deve essere accuratamente determinata per consentire per accumulazione dell'elemento tracciante della regione di destinazione desiderata. Per il rilevamento di F4/80 intestinale nella colite murina, l'anticorpo marcato deve essere iniettato 24 h prima della scansione. (4) come accumulo di etichetta aspecifici potrebbe verificarsi (ad es., nel fegato), è cruciale etichettare il tessuto bersaglio appropriato come ROI inserendo i rispettivi strumenti di misurazione. Inoltre, controlli sufficienti per la distribuzione del tracciante non specifico dovrebbe essere incluso-considera non specifico isotipo controlli per escludere effetti di aspersione e Ko o blocchi studi per convalidare l'interazione dell'elemento tracciante-destinazione.
Tipiche fonti di errore relativo alla ricostruzione di routine e dati di scansione includono posizione animale improprio, scansione di campo e tempo di esposizione. Quando si posiziona l'animale, la lesione fluorescente deve essere circondata dal tessuto su tutti i lati per minimizzare il rumore di ricostruzione. Bolle d'aria intrappolate tra l'animale e la lastra di vetro anteriore della cassetta imaging potrebbe anche aumentare il rumore e dovrebbe essere rimosso spostando leggermente l'animale. Sovra - o sottoesposizione dell'immagine può richiedere una riacquisizione di scansione con le impostazioni di esposizione modificate, che può essere trovato nella schermata scansione (blocco immagine riflettanza: regolazioni del tempo di intensità e l'esposizione di LED anteriore). Quando si combinano in vivo misure FMT basate su anticorpo con post-mortem analisi istologiche, quali immunoistochimica o macchiatura immunofluorescente, l'uso degli anticorpi dello stesso clone e formato dovrebbe essere considerato. Anche, quando si eseguono misurazioni ripetitive FMT negli stessi animali, gli stessi formati e cloni dovrebbero essere usati per prevenire possibile reattività crociata o il targeting di epitopi diversi.
Presi insieme, tomografia molecolare mediata fluorescenza consente il monitoraggio ripetitivo del decorso della malattia e alla base di processi patofisiologici. Esso può essere applicato a una pletora di studi biomedici e potrebbe essere utile per accelerare il test anti-droga o come endpoint oggettivo in individualizzato terapie. FMT-targeting dei macrofagi F4/80-esprimendo nei modelli di infiammazione fornisce un valido strumento non invasivo per visualizzare e quantificare l'infiltrazione e l'accumulo di cellule infiammatorie mentre anche dimostrando buona correlazione ai tradizionali letture.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo la sig. ra Sonja Dufentester, Sig. ra Elke Weber e la signora Klaudia Niepagenkämper per l'eccellente assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
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