Summary
Target-specifikke sonder repræsenterer et innovativt værktøj til at analysere molekylære mekanismer, såsom protein udtryk i forskellige typer af sygdomme (fx inflammation, infektion og tumordannelse). I denne undersøgelse beskriver vi en kvantitativ tredimensionale tomografisk vurdering af intestinal makrofag infiltration i en murine model af colitis bruger F4/80-specifikke fluorescens-medieret tomografi.
Abstract
Murine modeller af sygdommen er uundværlige for videnskabelig forskning. Men mange diagnostiske værktøjer som endoskopi eller tomografisk imaging er ikke rutinemæssigt ansat i dyremodeller. Konventionelle eksperimentelle udlæsninger afhængige ofte slagtningen og ex vivo analyser, der forhindre intra individuelle opfølgende undersøgelser og øge antallet af undersøgelse dyr behov. Fluorescens-medieret tomografi gør det muligt for en ikke-invasiv, repetitive, kvantitative, tre-dimensionelle vurdering af fluorescerende sonder. Det er yderst følsom og tillader brug af molekylære beslutningstagere, som giver mulighed for specifikke påvisning og karakterisering af forskellige molekylære mål. Især repræsenterer målrettet sonder et innovativt værktøj til at analysere genekspression aktivering og protein i inflammation, autoimmun sygdom, infektion, karsygdom, celle migration, tumordannelse, osv. I denne artikel giver vi trinvise instruktioner på denne avancerede imaging-teknologi til i vivo påvisning og karakterisering af betændelse (dvs. F4/80-positive makrofager infiltration) i en udbredte murine model af tarmbetændelse. Denne teknik kan også anvendes i andre forskningsområder som immun celle eller stamceller tracking.
Introduction
Dyremodeller er meget udbredt i videnskabelig forskning, og mange ikke-invasive procedurer findes til skærm sygdomsaktivitet og vitalitet, som kvantificering af kroppens vægtændringer eller analyse af blod, urin og afføring. Disse er imidlertid kun indirekte surrogat parametre, der er også omfattet af indbyrdes individuelle variation. De skal ofte suppleres med slagtningen analyser af væv modellen, som forhindrer seriel observation på gentagne gang point og direkte observation af fysiologiske eller patologiske processer in vivo. Sofistikeret lille dyr Billeddannende teknikker er dukket op, herunder grænseoverskridende Sektional imaging, optiske billeddannelse og endoskopi, som giver mulighed for direkte visualisering af disse processer og også giver mulighed for gentagne analyser af de samme dyr1 , 2 , 3. Derudover mulighed for at gentagne overvåge forskellige stater af sygdom i den samme dyr kan reducere antallet af dyr behov, der måtte være ønskeligt fra en Dyreetik synspunkt.
Flere forskellige optiske billeddannelse teknikker findes i vivo fluorescens billeddannelse. Oprindeligt, Konfokal imaging var ansat til at studere overflade og undergrund fluorescerende begivenheder4,5. For nylig har tomografisk systemer, der giver mulighed for kvantitative tredimensionale væv vurderinger blevet udviklet6. Dette er opnået gennem udvikling af fluorescerende sonder, der udsender lys i nær-infrarødt (NIR) spektrum, tilbyder lav absorption, følsomme detektorer og monokromatiske lys kilder7. Mens traditionelle tværsnittet Billeddannende teknikker, såsom computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MR) eller ultralyd (USA), for det meste er afhængige af fysiske parametre og visualisere morfologi, kan optiske billeddannelse give yderligere oplysninger på underliggende molekylære processer sonder ved hjælp af endogen eller eksogen fluorescerende8.
Fremskridt inden for Molekylærbiologi har bidraget til at lette generation af smart og målrettede fluorescerende molekylære sonder til et stigende antal mål. For eksempel, kan receptor-medieret udbredelse og distribution i en given målområdet visualiseres ved hjælp af carbocyanine derivat-mærket antistoffer9. Overfloden af tilgængelige antistoffer, som kan mærkes for at fungere som specifikke røbestoffer i ellers utilgængelige områder af kroppen, giver hidtil uset indsigt i molekylære og cellulære processer i modeller af tumordannelse og neurodegenerative, hjerte-kar-, immunologiske og inflammatoriske sygdomme7.
I denne undersøgelse beskriver vi brugen af fluorescens-medieret tomografi i en murine model af colitis. Dextran natriumsulfat (DSS)-induceret colitis er en standard kemisk inducerede musemodel af tarmbetændelse, der ligner inflammatoriske tarm sygdom (IBD)10. Det er især nyttigt at vurdere bidrag af den medfødte immunsystem til udviklingen af gut betændelse11. Da ansættelse, aktivering og infiltration af monocytter og makrofager repræsenterer afgørende trin i patogenesen af IBD, er visualisering af deres ansættelse og kinetik af infiltration afgørende for overvågning, for eksempel effekten af potentielle terapeutiske stoffer i en prækliniske indstilling12. Vi beskriver induktion af DSS colitis og påvise-tomografi-medieret karakterisering af makrofag perkolatnedsivning i tarm mucosa ved hjælp af fluorescens molekylære tomografi for specifikke visualisering af monocyt/makrofag markør F4/80 13. Derudover vi illustrere hjælpeansatte og supplerende procedurer, såsom antistof mærkning; opsætningen af eksperimenterende; og analyse og fortolkning af de fremkomne billeder, i sammenhæng med konventionelle udlæsninger som sygdom aktivitet indekser, flow flowcytometri og histologiske analyse og Immunhistokemi. Vi diskutere begrænsninger af denne teknik og sammenligninger med andre billeddiagnostiske modaliteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen ifølge den tyske lov om dyr (Tierschutzgesetz).
1. materialer og eksperimentel opsætning
- Dyrs pleje.
- Bruge sex - og alder-matchede mus af enhver DSS-modtagelige stamme (f.eks. C57BL/6) på 20-25 g kropsvægt.
- Plan mindst fem eller flere mus pr. eksperimentelle gruppe og hus mus ifølge lokale dyrs pleje retningslinjer.
- Give en standard gnaver chow, kost og autoklaveres drikkevand ad libitum.
- Fjerne den standard chow og erstatte det med Lucerne-fri chow mindst tre dage før scanning for at reducere endoluminal auto-fluorescens.
- Induktion af akut DSS-induceret colitis.
- Opløs 2 g af DSS (Molekylær vægt ~ 40.000 Da) i 100 mL autoklaveres drikkevand til at opnå en 2% (w/v opløsning).
- Fyld drikke levering af musene udelukkende med DSS løsning og skøn 5 mL af væske pr. mus pr. dag. Give den samme drikkevand uden DSS til kontrol mus10.
Bemærk: Overvåge mus dagligt indtil slutningen af forsøget. Aflive mus at miste mere end 20% af deres oprindelige kropsvægt eller at blive døende (dvs. vedvarende foroverbøjet kropsholdning, nedsat bevægelighed, anstrengt åndedræt, markant oprejst frakke) Ifølge lokale gældende retningslinjer på dyr velfærd.
- Forberedelse af fluorescens-medieret tomografi.
- Mærke den ønskede antistof (fx rotte anti-mus F4/80) med fluorescens dye (f.eks. Cyanine7, λexcitation: 750 nm, λemission: 776 nm) som beskrevet i producentens protokol. Dialyze renset antistof i en passende dialyse membran (pore størrelse < 50-100 kDa) mod 1 L 0,15 M natriumchlorid i mindst 2 timer eller natten over.
- Overføre antistoffet til 1 L af 0,1 M NaHCO3 og dialyze i mindst 2 timer.
- Opløse den nødvendige mængde af fluorescerende farvestof i dimethylsulfoxid (DMSO) (10,8 µL/mg af antistof) og tilføje det til antistof løsning. Brug den fluorescerende farvestof i 20-fold kindtand overskud for at opnå et farvestof til protein-forhold på 1:3.
- Inkuber i mørke ved 4 ° C for 1 h. fjerne umærkede antistof ved dialyse mod 1 L 0,15 M natrium eller en PD-10 udvanding kolonne og løse i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) for programmet på vivo .
- Bestemme den endelige antistof koncentration og mærkning forholdet ved spektrofotometri.
- Måle proteinkoncentration på en absorption af 250-330 nm og overveje yderligere absorption af farvestoffet. Rette op på den maksimale absorption på 280 nm (protein) med 11% af den maksimale absorption ved 750 nm (næste trin) til Cyanine7 mærkning.
- Måle en fortynding af sammensatte (typisk 1:10) på 250-800 nm og uddrag koncentrationen af Cyanine7 ved 750 nm.
- Bestemme farvestof til protein-forhold som: farvestof/antistof = maksimal absorption ved 750 nm / 200.000 / (maksimal absorption ved 280 nm - 0,11 x max absorption ved 750 nm) / 170.000.
- Holde antistof løsning ved 4 ° C og beskytte det fra lys til at undgå blegning før injektion.
- Indlæse nødvendigt antistof løsning volumen i en steril sprøjte umiddelbart før injektion og skjold fra lys, før det bruges.
- Bestemme den optimale timing af sonden injektion og den scanning procedure, afhængigt af tracer farmakokinetik.
- Bedøver musene bruger 1,5-2,5% inhaleret isofluran i ilt eller placere dem sikkert i en dedikeret Tilbageholderen injektionsvæske hale vene af mærkede antistoffer.
- For fuld længde antistoffer, injicere mærket antistof mindst 24 h før scanning, sådan som for anti-mus F4/80 makrofag visualisering i murine colitis. Injicere mus intravenøst (i.v.) via halen vene med mærket antistof i en mængde svarende til 2,0 nmol farvestof.
- Brug lige mærket uspecifik antistoffer (fx rotte IgG eller et andet isotype svarende til den primære antistof arv) som en isotype kontrol i doser svarende til de specifikke sonde.
Bemærk: Resultater af in vivo scanner efter injektion af kontrol sammensatte kan tjene som reference for fortolkningen af den specifikke sonde imaging data. - Bruge en barbermaskine til at barbere dyrehår i bughulen at minimere lysrefleksion og absorption.
- Mærke den ønskede antistof (fx rotte anti-mus F4/80) med fluorescens dye (f.eks. Cyanine7, λexcitation: 750 nm, λemission: 776 nm) som beskrevet i producentens protokol. Dialyze renset antistof i en passende dialyse membran (pore størrelse < 50-100 kDa) mod 1 L 0,15 M natriumchlorid i mindst 2 timer eller natten over.
2. tekniske udstyr
- Bruge en veterinær fluorescens-medieret tomografi (FMT) enhed for små-dyrs fluorescens ( figur 4).
- Opret en ny undersøgelse for hvert projekt ved at klikke på "ny undersøgelse" knappen og omfatter undersøgelse beskrivelse de relevante røbestoffer, herunder imaging parametre og doser for fremtidig reference.
- Inden for denne undersøgelse, oprette studiegrupper ifølge de respektive forsøgsdesign (f.eks. for specifik sporingsfunktion og uspecifik isotype kontrol) ved at klikke på "ny study group" knappen. Udstyre hver studiegruppe med det respektive antal dyr.
- Kalibrere systemet for tracer konstruktioner.
- Udfør kalibrering for hver batch af røbestoffer til at normalisere for variation i mærkning og aktiverer kvantitativ måling fra OI data.
- Følg instrument producentens vejledning for kalibrering af hvert enkelte system; ved valg af "Tilføj ny tracer", vil systemet give en guide gennem trinene. Give fortyndingen af den anvendte antistof løsning og den beregnede absolutte koncentrationen af røbestof i sonden.
- For FMT, bruge en væv-efterligne phantom defineret tykkelse og absorption karakteristika (ligner vitale væv) og fyld den med en bestemt volumen af antistof løsningen anvendes. Måle dette på enheden FMT.
Bemærk: Systemet vil bruge reference måling af medfølgende sonden, sammen med den samme fusion, til at beregne absolutte tracer koncentrationer fra fremtidige i vivo målinger.
- Bruge en opvarmet undersøgelse kassette med en temperatur på 42 ° C.
Bemærk: Dette forhindrer mus bliver hypotermiske under behandlingen.
3. dyrs anæstesi
- Bruge en kontinuerlig strøm af 1,5-2% vol % isofluran ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) og 1,5 L O2/min til bedøver musene.
4. fluorescens-medieret CT-scanning
Bemærk: Tilpasse følgende oplysninger, der er specifikke for FMT systemet anvendes i denne undersøgelse (Se Tabel af materialer) for alternative fluorescens Reflektionsgraden imaging udstyr eller FMT systemer, efter behov.
- Opstille den bedøvede mus på ryggen i undersøgelse kassette.
- Udfør en scanning.
- Sæt kassetten i den billedbehandlingssystem og luk det samme for at sikre kontinuerlig anæstesi. Vælg den passende udsnit fra study group har oprettet tidligere. Vælg den administreret tracer i rullemenuen til at sikre, at værdierne for koncentrationen af røbestoffet beregnes korrekt.
- Erhverve fluorescens Reflektionsgraden billede på den passende bølgelængde (720 nm for Cyanine7) til scanning planlægning og kontur scanning felt ved at klikke på knappen "erhverve billede".
- Se, at feltet scan vises som en overlejring på fluorescens Reflektionsgraden billede. Justere det område af interesse (f.eks kolon eller maven), undgå luft eller områder af resterende pels. Afhængigt af målet for billedet, indstille antallet af billede datapunkter inden for feltet scan ved at vælge fra den grove til mellemlang og fine scan-feltet opløsning i menuen til højre.
Bemærk: Husk på at et fint scanning felt kan tilbyde bedre rumlige opløsning på bekostning af et betydeligt længere scanning tid. - Starte data/image erhvervelse ved den valgte bølgelængde ved at klikke på "scan".
Bemærk: Scan tid til en medium-fine scanning af hele maven vil være omkring 5 min; i denne tid, hvert datapunkt er særskilt oplyst af excitation laser, og den resulterende fluorescens registreres. - Fjerne dyret fra imaging kassetten i slutningen af scanningen og give dyret til at inddrive helt før du placerer det tilbage ind i buret.
- Gentag FMT, hvis det skønnes nødvendigt på forskellige tidspunkter under eksperimentet (f.eks. dage 0, 5 og 9-10 (slutningen af forsøget)), men overveje ophobning af antistof i kroppen, derfor øge baggrunden fluorescens signal.
5. efter scanning
- Placere musen i en selvstændig bur på et stykke køkkenrulle under et rødt-lys opvarmning lampe og overvåge mus for tegn på ubehag eller angst før fuld helbredelse. Placer musen tilbage i sit respektive bur når helt vågen.
- Aflive den mus i slutningen af forsøget ved levering af CO2 til isolator i en dosis på 100% (v/v), 100 vol % og 3 L/min. Ikke pre fyld salen med CO2, som en pludselig eksponering for høje koncentrationer af CO2 kan medføre angst. Kontrollere død efter musen har stoppet vejrtrækning ved en efterfølgende sekundære tilstand af eutanasi som hurtige cervikal dislokation.
- Explant i tyktarmen af abdominal laparotomi og udføre en ex vivo -scanning af eksplanterede tyktarmen, som forklaret i trin 4.2.1 - 4.2.4. Åbn hver kolon på langs ved hjælp af Metzenbaum kirurgisk saks og grundigt skylles med saltvand løsning før forberede yderligere analyse.
- Brug en skalpel til at skære en 0,5-cm fragment fra den distale colon og straks placerer det i en 1,5 mL kryogene tube. Frys det i flydende nitrogen og opbevares ved-70 ° C indtil videre brug (f.eks.myeloperoxidase (MPO) målinger).
- Bruge en træpind og roll op de resterende langs åbnede kolon fra den distale proksimale ende med slimhinde udad ("Swiss roll teknik"), for histologiske analyser. Placer forberedelsen i fiksativ (Se Tabel af materialer) og fryse på-80 ° C14.
6. data genopbygning og fortolkning
- Bruge værktøjet genopbygning af de respektive imaging software for at skabe 3D maps af fluorescens-distribution fra den rå billeddiagnostiske data; scanninger føjes automatisk til værktøjet genopbygning når ved scanning, funktionen "Tilføj til genopbygning kø" er valgt.
- Ellers Vælg scanninger fra dropdown menuen under de respektive undersøgelse og studiegruppe, Højreklik på scanningen og vælge "Tilføj til genopbygning."
- For yderligere analyse, skal du indlæse et datasæt i analyse software. Fra dropdown-menuen i den øverste bjælke, Vælg den respektive undersøgelse og derefter vælge study group og det enkelte dyr fra menuen til højre. alle scanninger udføres for dette dyr vil blive vist. Vælg den korrekte scanning og klikke på "Indlæs."
Bemærk: 3D rekonstruktion af tracer distribution vises til venstre som en overlejring af i første omgang erhvervede fluorescens Reflektionsgraden billede. Modellen kan drejes og forstørret til nemmere at analysere. - Identificere foci af uspecifik etiket ophobning (fx, leveren eller urin blære) på rekonstruerede 3D maps og differentiere fra målvæv (fx tarmen eller tarmen).
- Den øverste bjælke, Vælg figuren ROI mest passende for målet. Etiketten target væv som regioner af interesse (ROI) ved at placere de respektive måleværktøjer i analyse software; softwaren vil give et fluorescens-intensiteten for det Investeringsafkast, samt (pico-) molær mængder af tracer, at scanningen er kalibreret til.
- Vælg det samlede beløb af tracer i passende ROI, normaliseret for ROI størrelse, som den mest egnede svarende til evaluering af sygdomsaktivitet i sammenhæng med den inflammatoriske Infiltrer (histologi).
Bemærk: Andre funktioner af ROI kan vælges, hvis det er relevant som repræsentant for den pågældende model.
7.Ex Vivo Analyser
- Hæmatoxylin og eosin pletter og immunfluorescens farvning.
- Deparaffinize afsnit ved at placere dem i 70% ethanol (EtOH) for 2 min; skylning med destilleret vand bagefter. Pletten med hæmatoxylin løsning til 5 min og efterfølgende skylles med varmt vand fra hanen i 10 min.
- Skylles med destilleret vand, kontrastfarve med eosin løsning for 2 min, og igen skylles med destilleret vand.
- Sted i 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH og xylen (2 gange) i 2 min. hver at dehydrere og klare sektionerne. Mount med harpiksholdige montering medium.
- Immunfluorescens farvning.
- Brug sektionerne tidligere opnåede væv ("Swiss roll") for immunofluorescens farvning og forberede cryo-cut sektioner af 7 µm.
- Blokere acetone-fast og frosne kolon sektioner i 5,0% rotte serum i 10 min og der inkuberes natten over med fortyndet (1/500 v/v) biotinylated primære rotte anti-mus F4/80 antistof. Vaske i afsnit tre gange i Tris-bufferet saltvand (TBS) og inkuberes med Streptavidin-FITC (1: 100 v/v) i PBS/BSA (0,1% w/v) natten over ved 4 ° C.
- Vaske sektioner i TBS og plette med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:1000 v/v) at opnå kontrast. Analysere fluorescens billeder under en Konfokal mikroskop (Se Tabel af materialer, 40 x forstørrelse, filter cube N2.1 med excitation filter 515-560) og tælle F4/80-positive celler pr. high-power felt.
Bemærk: Overvej at bruge antistoffer af den samme klon og format når kombinere i vivo FMT og slagtningen histologi analyser som Immunhistokemi eller immunfluorescens farvning, afhængigt af den tilsigtede mål. Til påvisning af F4/80-positive makrofager i vivo og ex vivoanvendtes forskellige formater.
- MPO målinger i kolon prøver.
- Brug fremstillet frisk, PBS-skylles kolon prøver eller optøede modellen for MPO målinger. Vejer alle prøver og homogeniseres vævet i lysisbuffer i ELISA kit (Se Tabel af materialer) på et volumen på 20 µL af lysisbuffer pr. mg af væv.
- Rens med ultralyd i 15 s (sonikering frekvens: 20 kHz, power: 70 W) og centrifugeres prøver i 10 min ved 200 x g og 4 ° C.
- Brug en kommercielt tilgængelig ELISA kit (Se Tabel af materialer) Ifølge fremstiller beskrivelsen. Udføre test i dubletter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vurdering af Colitis:
DSS-induceret colitis er en kemisk inducerede murine model af tarmbetændelse, der ligner menneskets IBD og fører til vægttab, rektal blødning, overfladiske ulceration og slimhinde skader i modtagelige mus15. Det er især nyttigt at studere bidrag af den medfødte immunsystem til udviklingen af tarmbetændelse10,11. For at potent fremkalde colitic betændelse, mus blev løbende administreres DSS hele eksperimentet. Faldende kropsvægt og fækal okkult blod blev brugt som kliniske indeks af betændelse. Som vist i figur 1A, begyndte mus at miste vægt starter på dag fire efter induktion af colitis, mens kontroldyr modtager vand alene viste ingen væsentlige ændringer i kropsvægt. Derudover colitic dyr viste øget udskillelse af okkult blod med afføring (figur 1B), der vurderes ved hjælp af de følgende hemoccult pointsystem: 0 (ingen blod), 1 (hemoccult positive), 2 (hemoccult positive og visuelle pellet blødning) og 4 () brutto blødning, blod omkring anus)16. Kolon længde blev målt til at evaluere betændelse-induceret Colon afkortning, afslørende væsentligt forkortet koloner i colitic mus end kontrol mus modtager vand alene (figur 1 c). For at direkte vurdere Colon skader, blev histologiske analyse udført i slutningen af forsøget. En kvantitativ vurdering af histologiske skader blev udført på Colon H & E-farvede sektioner ved hjælp af en samlet skade core baseret på graden og omfanget af betændelse, krypt skader og procent inddragelse17. Colitic mus viste tegn på svær betændelse, mens kontrol mus modtager ingen DSS viste ingen histologiske skader (fig. 1 d). Billederne viser karakteristiske inflammatoriske forandringer i DSS-induceret colitis, karakteriseret ved ødelæggelsen af epitel arkitektur, med tab af goblet celler, krypt skader og slimhinde ulceration, i modsætning til den stort set bevarede slimhinde arkitektur i kontrol mus18. Statistiske forskelle mellem grupperne (n = 5 pr. gruppe) blev beregnet af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af studerende-Newman-Keuls (S.N.K.) post hoc test eller af Welch's test efterfulgt af spil-Howell post hoc test i tilfælde af betydelige varians uensartethed. En p-værdi af < 0,05 blev betragtet som væsentlig.
Vurdering af monocyt og makrofag ansættelse:
Som DSS-induceret colitis er forbundet med infiltrationen af immunceller, som monocytter og makrofager, i mucosa og submucosa af tyktarmen, brugte vi immunfluorescent farvning for monocyt/makrofag markør F4/80 for at kvantificere infiltrere. Colitic mus modtage DSS viste signifikant forhøjet antal monocytter infiltrerer kolon væg i forhold til ikke-colitic kontrol mus (figur 2A). Leukocyt infiltration var desuden kvantificeres ved hjælp af immunfluorescent farvning for den neutrofile markør GR1, afslørende betydeligt øget indvandring af neutrofiler i den betændte kolon i forhold til kontrol mus (figur 2B). Bekræfte, MPO var niveauer afspejler begge neutrofile antal og inflammatorisk aktivitet markant forhøjet i tyktarmen væv af colitic mus (figur 2 c). ANOVA og S.N.K. post hoc test blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans mellem grupperne (n = 5 pr. gruppe). Statistisk signifikans blev sat på p < 0,05.
Systemiske ændringer i makrofag delpopulation:
Musen monocytter omfatte en heterogen gruppe af forskellige delpopulationer, der adskiller sig i modning tilstand og deres kapacitet til at blive ansat til inflammatoriske websteder, hvor de deltager i indlede og fastholde den inflammatoriske respons19 . Derfor, vi kendetegnet blod monocytter ved at analysere det differentierede udtryk af CD11b og Ly6C ved hjælp af flow flowcytometri. Under betændelsestilstande akut DSS colitis konstaterede vi en betydelig stigning i inflammatorisk CD11bhøjLy6Chøj monocytter i forhold til før eksperimentet betingelser. Derimod opstår dette skift ikke i ikke-colitic kontrol mus uden DSS (figur 3A). Data (n = 5 pr. gruppe) blev analyseret ved hjælp af ANOVA og S.N.K. Som en ekstra surrogat parameter for systemisk inflammation vurderet vi tilstedeværelsen af F4/80-positive celler i milt fra colitic mus i forhold til ikke-colitic kontrol, som viste en betydelig stigning i DSS-behandlede mus (figur 3 c).
Fluorescens-medieret Computertomografi scanning:
Vi brugte fluorescens-medieret tomografi til at måle monocyt/makrofag rekruttering og infiltration i tarm mucosa. Et fluorescens-mærket antistof mod murine F4/80 var ansat direkte visualisere aktiveret makrofager i levende dyr. Mærket, uspecifik rotte IgG antistoffer blev brugt som kontrolelementet isotype. Til scanning, blev mus barberet i bughulen at minimere lys afspejling af pels, bedøvede af kontinuerlig isofluran levering, og undersøgt i en veterinær FMT enhed for små-dyrs fluorescens. Som vist i figur 4A, induktion af colitis førte til et betydeligt forhøjet ophobning af fluorescerende sporstof i kolon af colitic mus i forhold til ikke-colitic kontrolelementer, der viser en stigning i monocyt infiltration og differentiering i aktive makrofager i colitic dyr. Anvendelsen af en uspecifik fluorescens-mærket IgG ikke fremkalde en påviselig fluorescens reaktion i maven og tarmen, hverken i den colitic (DSS) heller ikke colitic (vand)-gruppen udviser specificitet af sonde-målet samspillet mellem F4/80 antistof (figur 4A). Repræsentative billeder af maveregionen er vist. Farvekode angiver niveauet af fluorescens intensitet, der svarer til omfanget af inflammatoriske infiltrere()figur 4B og 4 C).Ex vivo målinger af F4/80-instrueret tracer ophobning i eksplanterede koloner verificeret Colon oprindelse af signalet i vivo opdaget af F4/80 tracer ophobning (figur 5A og 5B). Beregnede beløb bundet antistof korreleret godt (R2 = 0,52) med histologisk bestemmes antallet af infiltrerer makrofager (figur 5 c og 5 D), bekræfter, at i vivo billeddannelse med specifikke røbestoffer kan være vejledende af lokale sygdomsaktivitet. Data blev analyseret af ANOVA og S.N.K. post hoc test med en statistiske signifikansniveau angivet på p < 0,05. Korrelationen blev beregnet som lineær regression.
Figur 1 . Parametre for klinisk og histologisk skade i løbet af akutte DSS colitis.
C57BL/6 mus blev udfordret med DSS (2% w/v) i drikkevand i 8 dage. Control mus fik drikkevand uden DSS. Dyrene blev aflivet på dag 9. Vises data fra et eksperiment (n = 5 pr. gruppe) ± standardafvigelsen på middelværdien (SEM). (A) ændringer i kropsvægt er præsenteret i forhold til den oprindelige vægt. (B) blod udskillelse i afføring, som bestemmes af guaiac papir test (hemoccult, 0 = negativ, 4 = blod makroskopisk). (C) slagtningen kolon længde. (D) histologiske skade som vurderet af graden af crypt skade og omfanget af betændelse. Vist er repræsentative histologiske billeder (haematoxylin/eosin pletter; forstørrelser: 10 x (øverste panel), 20 x (nederste panel)) colitic (venstre paneler) eller kontrol (højre paneler) mus. Bemærk den dybtgående ødelæggelse af epitel arkitektur og inflammatoriske infiltrater (pilespidser). Søjlediagrammet: skade score. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Tarm monocyt og makrofag infiltrere.
DSS colitis er fremkaldt i C57BL/6 ved anvendelsen af DSS (2% w/v) i drikkevandet. Control mus modtaget drikkevand alene. Data fra n = 5 mus hver gruppe er vist ± SEM. (A) immunfluorescent visualisering af makrofag infiltrationer i slimhinden. Vist er repræsentative billeder af anti-F4/80 farvning i colitic og styrer mus. Søjlediagrammet: celle count/high power felt (HPF). (B) immunfluorescent visualisering af slimhinde neutrofile infiltrationer. Vist er repræsentative billeder af anti-Gr-1 farvning i colitic dyr og kontrol. Søjlediagrammet: celle count/HPF. (C) MPO koncentration i Colon væv af colitic og ikke-colitic mus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Monocyt rekruttering til den intestinale rum.
Perifert blod monocytter fra colitic mus samt kontrol mus (n = 5 pr. gruppe) blev analyseret ved flowcytometri til udtryk i Ly - 6C på CD11b-positive celler. Celler var sorteres på grundlag af SSC og CD11b udtryk. Musen monocytter blev identificeret som VSKlaveCD11bhøje celler, og deres Ly6C udtryk blev analyseret. (A) Proportional ændres mod inflammatoriske Ly6Chøj monocytter er afbildet i forhold til før eksperimentet betingelser (% ændre ± SEM). (B) FACS dot parceller af Ly6C udtryk på SSClowCD11bhøj celler af colitic dyr før og efter colitis induktion (lavere paneler) og kontrol før og efter forsøget (øvre paneler). (C) Splenocytes fra colitic og ikke-colitic mus blev vurderet til udtryk på F4/80 ved flowcytometri (gennemsnitlig fluorescens intensitet ± SEM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Tomografisk visualisering af makrofag infiltrere i murine colitis.
FMT scanner i colitic mus og ikke colitic kontrolelementer administreres Cyanine7-konjugeret antistof mod murine F4/80 (n = 5 pr. gruppe). (A) Bar graf: samlede fluorescens intensitet i pmol farvestof blev fastsat i ROI og skildret ± SEM. repræsentant billeder er vist med farvekodede fluorescens intensitet svarer til omfanget af inflammatoriske infiltrere i musene injiceret med den specifikke sonde (anti-mus F4/80) (B) og en uspecifik kontrol (rotte IgG) (C). I begge tilfælde blev en ROI på samme størrelse placeret tværgående i den øvre del af maven for yderligere analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Ex vivo validering af tracer specificitet i murine colitis.
In vivo FMT scanninger i colitic musene injiceret med specifikke sonden (anti-mus F4/80) blev efterfulgt af ex vivo planar fluorescens scanninger af eksplanterede tarme at demonstrere Colon oprindelsen af tracer signalet opnået in vivo. Data fra to eksperimenter med ialt n = 8 dyr er vist. Repræsentative billeder vises skildrer i vivo FMT scanninger af colitic mus med farvekodede fluorescens intensitet svarer til omfanget af inflammatoriske infiltrere (A).Fluorescens Reflektionsgraden billeddannelse af eksplanterede tarmen giver mulighed for identifikation af bestemte regioner med sporstof ophobning (B). Repræsentative slagtningen immunfluorescent farvning for F4/80-positive makrofager fra sådanne områder bekræfter resultaterne i vivo (C). Antallet af infiltrerer makrofager, som bestemmes ved immunfluorescens farvning, var korreleret med i vivo målt tracer ophobning (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om medicinske Billeddannende teknikker har udviklet sig hurtigt i de seneste år, er vi stadig begrænset vores evne til at detektere inflammatoriske processer eller tumorer, samt andre sygdomme i deres tidligste udviklingsfaser. Dette er imidlertid afgørende at forståelse tumorvækst, invasion, eller udvikling af metastaser og cellulære processer i udviklingen af inflammatoriske sygdomme og degenerative, hjerte-kar- og immunologiske sygdomme. Mens traditionelle Billeddannende teknikker er afhængige af fysiske eller fysiologiske parametre, molekylær billeddannelse giver mulighed for visualisering af specifikke molekylære markører i vivo20.
For små-dyrs imaging, kan radionukleid-drevet metoder (fx single-photon emission beregnet tomografi (SPECT) og positron emission tomografi (PET)), ultralyd og fluorescens-medieret billedbehandling bruges til at visualisere specifikke molekylære mål strukturer. Brug af fuld længde antistoffer som den mest tilgængelige tracer rygrad kræver langvarig etiketter, som omløb gange og langsom væv penetration forsinkelse tid Imaging efter tracer ansøgning. Typiske imaging radionuklider er derfor ikke egnet til i vivo billeddannelse af antistof distribution. Brugen af lang-levende isotoper som Cu64 eller In111 gør det muligt for antistof-baserede røbestoffer, men kræver en kompleks infrastruktur spanning isotop generation, stråling sikkerhed før og under proceduren mærkning og afskærmet staldfaciliteter efter sonde ansøgning. Den mere omkostningseffektiv og sikker variant ville være fluorescens-medieret imaging.
Flere i vivo billeddannelse systemer til detektion, blevet visualisering og måling af fluorescerende farvestof distribution i levende dyr præsenteret over de sidste to årtier21. De fleste systemer aktiverer hurtig planar imaging egnet til overfladisk læsion billeddannelse. På grund af lys absorption og spredning, signaler dybt i vævet unddrage planar billeddannelse. Den mest fremtrædende løsning til dette problem er fluorescens tomografi22. Baseret på matematisk modellering, billedet signal er korrigeret for spredning og let absorption og en virtuel 3D datasæt er beregnet ud fra multi projektion datasæt8. Algoritmen, der giver fuldt kvantitative data, gør det muligt skøn over koncentrationen af røbestoffet i specifikke regioner repræsentant for target koncentration/udtryk23. En relevant begrænsning af FMT er relateret til dårlig rumlige opløsning i forhold til anatomiske Billeddannende teknikker, som kan-afhængigt af den ønskede mål-kompromis tildeling af Molekylær information til særlige anatomiske strukturer. En anden begrænsning ligger i den begrænsede indtrængningsdybde af lys ind i væv, som kræver brug af sonder absorberende og fluorescerende i rød til NIR spektrale vifte23.
En nyligt indførte imaging modalitet, der kombinerer fordelene ved morfologiske ultralyd og muligheden for opnåelse af Molekylær information fra fluorescens imaging er optoacoustic billeddannelse. Foreløbige resultater fra tidlige studier tyder på, at-trods et behov for yderligere teknisk raffinement-optoacoustic imaging holder meget lovende for molekylær billeddannelse og potentiel translationel programmer24.
Ansættelse af leukocytter til tarmvæggen er et afgørende skridt i indledningen og fastholdelsen af IBD, som er rekruttering af inflammatoriske celler til stedet for infektion eller betændelse i mange immun-medieret sygdom, såsom autoimmune sygdom, infektion, karsygdom, tumordannelse og mange flere25. Som monocyt aktivering og infiltration i tarmslimhinden er et vigtigt skridt i patogenesen af IBD, er hæmning af monocyt infiltration, orkestreret af kemokiner og integrin-cellulære vedhæftning molekyle interaktion, en lovende terapeutisk tilgang12,26. Derfor er overvågning leukocyt handel til webstedet for betændelse afgørende i udviklingen af nye terapeutiske muligheder til at visualisere de anti-inflammatoriske effekter af de undersøgte lægemidler. Dette kan være af særlig interesse, fordi agenter målretning leukocyt menneskehandel er blevet udviklet, og nogle anti-integrin antistoffer er allerede tilgængelige for IBD terapi, mens yderligere komponenter vil være anvendelig i den i nærheden af fremtidige26. Vedolizumab, en humaniseret monoklonalt antistof mod den gut-specifikke α4β7 integrin subunit, og Etrolizumab, som binder β7 underenhed af tarm α4β7 og αEβ7 integrin heterodimers, har været godkendt27,28. Andre agenter (fx, MAdCAM-1 PF-00547659 og sphingosine-1-fosfat (S1P) receptor modulatorer såsom Ozanimod) i øjeblikket er under evaluering til behandling af IBD29,30.
Når du udfører FMT, omfatter eventuelle ændringer af teknikken udvælgelsen af forskellige tracer-target kombinationer, samt kombinere FMT med strukturelle imaging tilgange til at kompensere for dårlig rumlige opløsning. En bred vifte af sonde-target kombinationer er blevet etableret og kommercialiseret. For specifikke projekter, mærkning af brugerdefinerede antistoffer kan blive gjort brug af kommercielle mærkning kits og den ovenfor beskrevne protokol. Afhængigt af antistof eller mindre peptid valgt som den målretning gruppe, tilbyder kommercielle udbydere en bred vifte af forskellige etiketter. Overveje den ønskede farve, afhængigt af programmet: for dybe væv imaging, et farvestof, der opererer i NIR spektrum (fx Cy7, λex / em 750/780 nm) kan være velegnet, mens den samlede lysstyrke og effektiv lys levering af farvestoffer opererer i det nær-synlige spektrum af spektrum (fx normal god landbrugspraksis analoger) ville være at foretrække. Stort set alle farvestoffer kan fås som en aktiv ester til etiket lysin-rester af proteiner, samt med alternative bindende fraspaltning, f.eks maleimides for cystein bindende eller biotin for mærkning af proteiner udstyret med specifik mærkning tags31 . Udvælgelsen af etiketten ændrer ikke princippet om protokollen, men kræver blot mindre ændringer af proceduren for mærkning og er vigtig for en god imaging resultat. En anden attraktiv ændring at overvinde begrænsninger i rumlige opløsning er at kombinere FMT med CT eller Mr, at aktivere kommentering af anatomiske strukturer med molekylær information.Den strukturelle oplysninger kan enten erhverves sekventielt som forhånd oplysninger eller samtidigt, som kræver hybrid imaging instrumentation32,33.
Visse trin i protokollen fortjener særlig opmærksomhed. Denne teknik kan tilpasses til et væld af fluorescerende photoprobes, der er rettet mod en bred vifte af specifikke molekyler repræsentant for forskellige molekylære processer, er det nødvendigt at give mulighed for tilstrækkelig fordelingen af sonder og berigelse i de ønskede målområde. Det ideelle tidspunkt for imaging kan variere alt efter sonde-target kombination. For eksempel kan antistof rettet mod tumor receptorer være påvirket af den udbredelse sats til tumorer, optagelse og metabolisme af leveren og mulige immunogen bivirkninger34. Også overveje relevante kontroller for specifikke Billeddannende metoder. Specifikke røbestoffer skal altid valideres mod isotype kontrol afspejler perfusion effekter og uspecifik bindende (fx Fc receptor-medieret bindende). Target-negative dyr kan tjene som en ekstra kontrol for tracer specificitet, hvis sådanne knockout modeller findes. Alternativt kan blokering eksperimenter udføres for at bevise specificiteten af antistof-target interaktioner35.
Følgende er kritiske trin om de praktiske aspekter af proceduren: (1) omhyggeligt bestemme DSS koncentrationerne anvendes, da DSS modtagelighed kan variere mellem forskellige mus stammer og fremstiller/batchnumre36. (2) omhyggeligt vælge sonde-target kombinationer. (3) tillade omkring 5 min scanning tid for en tilstrækkelig scanning af hele maven. Det optimale tidspunkt punkt mellem tracer ansøgning og billedbehandling proceduren skal fastlægges nøje at tillade tracer ophobning i regionen ønskede mål. Til tarm F4/80 påvisning i murine colitis, bør mærket antistof indsprøjtes 24 timer før scanning. (4) som uspecifik etiket ophobning kan opstå (f.eks. i leveren), er det afgørende at mærke den passende målvæv som Investeringsafkast ved at placere de respektive måleværktøjer. Derudover bør tilstrækkelig kontrol for uspecifik tracer fordeling være inkluderet-overveje uspecifik isotype kontrol at udelukke perfusion effekter og knockout eller blokerende undersøgelser at validere tracer for målgruppen interaktion.
Typiske fejlkilder relateret til scanning procedure og data genopbygningen omfatter forkert animalske holdning, scanne felt og eksponeringstid. Når positionering dyret, skal fluorescerende læsion være omgivet af væv på alle sider til at minimere genopbygning støj. Luftbobler fanget mellem dyret og front glasplade af den billeddiagnostiske kassette kan også øge støj og bør fjernes ved at flytte dyret lidt. Over- eller undereksponering af billedet kan kræve en Genfangst scanning med ændrede eksponeringsindstillinger, som kan findes i skærmbilledet scanning (reflektans billedet blok: justeringer af den forreste LED intensitet og eksponering tid). Når du kombinerer i vivo antistof-baserede FMT målinger med slagtningen histologiske analyser, såsom Immunhistokemi eller immunfluorescent farvning, betragtes som brug af antistoffer af den samme klon og format. Også, når du udfører gentagne FMT målinger i de samme dyr, de samme formater og kloner skal bruges til at forhindre mulige krydsreaktivitet eller målretning af epitoper, der er forskellige.
Tilsammen, muliggør fluorescens medieret-Molekylær tomografi den gentagne overvågning selvfølgelig sygdom og bagvedliggende patofysiologiske processer. Det kan anvendes til et utal af biomedicinske undersøgelser og kan være nyttigt at fremskynde dopingkontrol eller som en objektiv slutpunkt i individualiserede behandlinger. FMT-målretning af F4/80-udtrykker makrofager i modeller af betændelse giver en værdifuld noninvasive værktøj til at visualisere og kvantificere infiltration og ophobning af inflammatoriske celler samtidig også viser god korrelation til konventionelle udlæsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber og Mrs Klaudia Niepagenkämper for den fremragende teknisk bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al.
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S.
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
