Summary
הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.
Abstract
מודלים מאתר של המחלה הן תנאי הכרחי למחקר מדעי. עם זאת, כלי אבחון רבים כגון אנדוסקופיה או הדמיה טומוגרפי לא שגרתי מועסקים במודלים של בעלי חיים. המפרט ניסיוני קונבנציונאלי מסתמכים בדרך כלל על ניתוח לאחר המוות ו- ex-vivo , אשר למנוע בדיקות מעקב התוך אישי, להגדיל את מספר חיות מחקר צריך. טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות מאפשר את ההערכה לא פולשנית, החוזרות על עצמן, כמותיים, תלת מימדי של הגששים פלורסנט. היא רגישה מאוד, מאפשר את השימוש מקבלי מולקולרית, אשר מאפשר זיהוי ספציפי, איפיון מטרות מולקולריות שונות. בפרט, יישוב הגששים מייצגים כלי חדשני עבור ניתוח ביטוי גנים הפעלה וחלבון, דלקת, מחלות אוטואימוניות, זיהום, מחלת כלי דם, נדידת תאים, tumorigenesis, וכו '. במאמר זה, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב על זו טכנולוגיית הדמיה מתוחכמות זיהוי ויוו , אפיון של דלקת (קרי, הסתננות מקרופאג F4/80-חיוביים) מודל מאתר בשימוש נרחב של דלקת מעיים. טכניקה זו עשויה לשמש גם בתחומים אחרים מחקר ', כגון מעקב תא או תאי מערכת החיסון.
Introduction
מודלים בעלי חיים נמצאים בשימוש נרחב במחקר מדעי, הליכים פולשנית רבים קיים צג פעילות המחלה, חיוניות, כגון כימות של שינויים במשקל הגוף או הניתוח של דם, שתן וצואה. עם זאת, אלה רק פרמטרים הפונדקאית עקיף עלולות גם להשתנות בין-אישי. הם לעתים קרובות חייב לקבל השלמה על ידי ניתוח לאחר המוות של רקמות הדגימה, אשר מונע טורי התבוננות בנקודות הזמן חוזרות, ישיר התבוננות פיזיולוגיים או פתולוגית תהליכים בתוך vivo. טכניקות הדמיה מתוחכם של חיית-קטן הופיעו, כולל קרוס הדמיה סקציות הדמיה אופטית, אנדוסקופיה, אשר מאפשר את פריט חזותי ישיר של תהליכים אלה ומאפשר גם ניתוחים חוזרים של חיות באותו1 , 2 , 3. בנוסף, האפשרות לפקח שוב ושוב מצבים שונים של מחלת החיה אותו עשוי להקטין את מספר בעלי חיים לצורך, אשר עשוי להיות נחשק אתיקה בעלי חיים מנקודת מבט.
מספר טכניקות דימות אופטי שונות קיימות עבור ויוו פלורסצנטיות הדמיה. במקור, הדמיה קונאפוקלית הועסק ללמוד משטח ואירועים פלורסנט מהסבא4,5. לאחרונה, עם זאת, הטומוגרפיה מערכות המאפשרות עבור הערכות רקמות תלת מימד כמותי כבר מפותחת6. זה הושג באמצעות הפיתוח של הגששים פלורסנט הפולטות אור בספקטרום (ניר)-סגול, מציע קליטה נמוכה, גלאי רגיש, מקורות אור מונוכרומטי7. ואילו טכניקות הדמיה הצלבה מסורתיים, כגון טומוגרפיה (CT), דימות תהודה מגנטית (MRI) או אולטרסאונד (ארה ב), מסתמכים בעיקר על פרמטרים פיזיים והמחש מורפולוגיה, הדמיה אופטית יכולים לספק מידע נוסף על תהליכים מולקולריים הבסיסי באמצעות פלורסנט אנדוגני או אקסוגני רגשים8.
ההתקדמות בביולוגיה מולקולרית סייעו כדי להקל על הדור של הגששים מולקולרית פלורסנט חכם, ממוקד עבור מספר גדל והולך של מטרות. לדוגמה, ספיגת קולטן בתיווך והפצה באזור היעד נתון, ניתן לאבחן באמצעות נוגדנים התווית על-ידי נגזרת carbocyanine9. השפע של נוגדנים זמינים, ניתן שכותרתו שישמשו המשדרים ספציפיים באזורים נגישים אחרת של הגוף, מספק תובנות ותהליכי מולקולרית הסלולר במודלים של tumorigenesis, ניווניות, חסר תקדים מחלות לב וכלי דם, אוטואימונית, דלקתיות7.
במחקר זה, אנו מתארים את השימוש בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה במודל של מאתר של קוליטיס כיבית. לתוספי נתרן גופרתי (DSS)-קוליטיס המושרה הוא מודל העכבר המושרה כימי סטנדרטי של דלקת מעיים הדומה מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי)10. זה שימושי במיוחד להעריך את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים11. מאז הגיוס, הפעלה, חדירה של ומונוציטים ו מקרופאגים לייצג שלבים קריטיים בפתוגנזה של מחלת המעי הדלקתי, ויזואליזציה של הגיוס שלהם וקינטיקה של חדירה חיוניים ניטור, לדוגמה, את השפעת חומרים טיפולית פוטנציאל גם עם הגדרת פרה12. אנחנו מתארים את תנאי הגיוס של קוליטיס DSS ומדגימים בתיווך טומוגרפיה אפיון מקרופאג חדירה לתוך רירית המעיים באמצעות טומוגרפיה מולקולרית פלורסצנטיות עבור הפריט החזותי ספציפי של סמן מונוציט/מקרופאג F4/80 13. בנוסף, אנחנו להמחיש שגרות עזר ומשלימה, כגון נוגדנים labelling; הגדרת הניסוי; ניתוח ופרשנות של תמונות שהושג, מתאם עם המפרט קונבנציונלי כגון מדדי פעילות המחלה, flow cytometry ניתוח היסטולוגית, ואת אימונוהיסטוכימיה. נדון מגבלות של הטכניקה הזאת השוואות כדי שיטות הדמיה אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על-ידי לדנציג Landesamt נטור, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen על פי חוק הגנת חיות גרמנית (Tierschutzgesetz).
1. הגדרת הניסוי וחומרים
- טיפול בבעלי חיים.
- להשתמש סקס - ואת גיל-מתאימים עכברים של כל זן DSS, רגישים (לדוגמה, C57BL/6) 20-25 גרם משקל גוף.
- תוכנית עכברים לפחות חמישה או יותר לכל קבוצה ניסיונית והבית העכברים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מקומיים.
- מספקים תקן האוכל מכרסמים דיאטה ופעילות בלוק שתיית מים ad libitum.
- להסיר את האוכל הרגיל ולהחליף אותו עם צ'או אספסת ללא לפחות שלושה ימים לפני סריקה כדי להפחית את endoluminal אוטומטי-זריחה.
- אינדוקציה של קוליטיס DSS-induced חריפה.
- לפזר 2 גר' DSS (משקל מולקולרי ~ 40,000 דא) ב- 100 מ של בלוק שתיית מים כדי להשיג של % 2 (w/v פתרון).
- למלא את האספקה שתייה של העכברים באופן בלעדי עם הפתרון DSS ולהעריך 5 מ של נוזל לכל עכבר לכל יום. לספק המים לשתייה אותו בלי DSS בקרת עכברים10.
הערה: לפקח על העכברים מדי יום עד סוף הניסוי. המתת חסד העכברים זה לאבד גדול מ- 20% ממשקל גופם הראשונית או זה הפכה אדעך (קרי, מגובנן יציבה, התנועה ירד בהתמדה, בצורה ניכרת את תפקוד, להקים את המעיל) בהתאם להנחיות מקומיים החלים על בעלי חיים רווחה.
- הכנת טומוגרפיה בתיווך זריחה.
- תווית הנוגדן הרצוי (למשל, עכברוש אנטי עכבר F4/80) עם פלורסצנטיות צבע (למשל, Cyanine7, λעירור: 750 ננומטר, λפליטה: 776 ננומטר) כפי שמתואר הפרוטוקול של היצרן. Dialyze נוגדנים מטוהרים קרום דיאליזה המתאים (גודל הנקבוביות < 50-100 kDa) נגד 1 ליטר של 0.15 מ' נתרן כלורי לפחות 2 שעות או לילה.
- להעביר את הנוגדן 1 ליטר של 0.1 M NaHCO3 , dialyze כבר לפחות שעתיים.
- להמיס את הכמות הנדרשת של הפלורסנט ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) (10.8 µL/מ ג של נוגדנים) ולהוסיף אותו לפתרון של נוגדן. השתמש את הפלורסנט עודף טוחנת 20-fold להשגת צבע-כדי-חלבון יחס של 1:3.
- דגירה בחושך ב 4 ° C עבור ה 1 להסיר ללא תווית נוגדנים על ידי דיאליזה נגד 1 ליטר של 0.15 מ' נתרן או באמצעות עמודה desalting PD-10 ולפתור בתוך תמיסת מלח באגירה פוספט (PBS) עבור יישום ויוו .
- לקבוע את ריכוז נוגדן הסופי ואת יחס תיוג על ידי ספקטרופוטומטר.
- למדוד את ריכוז חלבון-בליעת 250-330 nm ולשקול קליטה נוספים מאת לצבוע. לתקן את הספיגה המרבי-280 ננומטר (חלבון) על ידי 11 אחוז הספיגה המרבי-750 ננומטר (השלב הבא) עבור תיוג Cyanine7.
- למדוד לדילול של המתחם (בדרך כלל 1:10) ב- 250-800 nm ולחלץ את הריכוז של Cyanine7-750 ננומטר.
- לקבוע את היחס לצבוע-כדי-חלבון כמו: צבע/נוגדנים = ספיגה מירבית-750 ננומטר / 200,000 / (ספיגה מירבית-280 nm - 0.11 x מקסימום ספיגה-750 ננומטר) / 170,000.
- לשמור את הפתרון נוגדנים ב 4 ° C, מגן על זה מפני אור כדי למנוע הלבנת לפני ההזרקה.
- לטעון נוגדנים הדרושים לפתרון האחסון במחט סטרילית מיד לפני ההזרקה, מגן מפני אור עד הוא משמש.
- לקבוע העיתוי אופטימלית של הזרקת בדיקה וההליך סריקה, בהתאם פרמקוקינטיקה מעקב.
- עזים ומתנגד העכברים באמצעות איזופלוריין 1.5-2.5% בשאיפה חמצן או למקם אותם בצורה מאובטחת restrainer ייעודי עבור הזרקה וריד הזנב של הנוגדנים עם תוויות.
- עבור נוגדנים באורך מלא, להזריק את הנוגדן שכותרתו לפחות 24 שעןת לפני סריקה, כגון עבור אנטי-העכבר F4/80 מקרופאג ויזואליזציה של קוליטיס מאתר. מזריקים לווריד עכברים (עירוי) דרך הזנב הווריד עם נוגדן שכותרתו בסכום המתאים nmol 2.0 של צבע.
- השתמש באותה מידה כאנטי נוגדנים לא ספציפי (למשל, עכברוש IgG או isotype אחר התואם המורשת נוגדן ראשוני) פקד isotype במנות שוות ערך לאלו של המכשיר הספציפי.
הערה: התוצאות של in vivo סורק לאחר הזרקה של המתחם שליטה יכול לשמש כנקודת התייחסות הפרשנות של המכשיר הספציפי לעיבוד נתונים. - השתמש מכונת גילוח חשמלית לגלח את פרוות בעלי חיים באזור הבטן כדי למזער את השתקפות האור וספיגה.
- תווית הנוגדן הרצוי (למשל, עכברוש אנטי עכבר F4/80) עם פלורסצנטיות צבע (למשל, Cyanine7, λעירור: 750 ננומטר, λפליטה: 776 ננומטר) כפי שמתואר הפרוטוקול של היצרן. Dialyze נוגדנים מטוהרים קרום דיאליזה המתאים (גודל הנקבוביות < 50-100 kDa) נגד 1 ליטר של 0.15 מ' נתרן כלורי לפחות 2 שעות או לילה.
2. ציוד טכני
- להשתמש בהתקן וטרינרי בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה (FMT) עבור חיית-קטן קרינה פלואורסצנטית ( איור 4).
- ליצור מחקר חדש עבור כל פרוייקט על-ידי לחיצה על "מחקר חדש" כפתור וכלול בתיאור המחקר את המשדרים הרלוונטיים, כולל פרמטרים הדמיה מינונים לשימוש עתידי.
- במסגרת מחקר זה, ליצור קבוצות לימוד על פי תכנון המחקר המתאימים (למשל, ספציפית מעקב ובקרה isotype לא ספציפי) על-ידי לחיצה על "קבוצת המחקר החדשה" כפתור. לצייד כל קבוצת מחקר עם מספר בעלי החיים המתאימים.
- לכייל את המערכת עבור המבנה מעקב.
- לבצע את הכיול עבור כל אצווה של המשדרים לנרמל עבור הווריאציה תיוג ולאפשר מדידה כמותית מנתונים. היי.
- בצע ההדרכה של היצרן מכשיר הכיול של כל מערכת בודדים; בעת בחירת "הוסף חיצי מעקב חדש", תספק המערכת מדריך לאורך השלבים. מספקים הדילול של הפתרון נוגדן יישומית, ריכוז מוחלט מחושב מעקב את הגשוש.
- עבור FMT, להשתמש פנטום מחקה רקמות של מאפיינים שהוגדרו עובי וקליטה (דמוי רקמה חיונית) ולמלא אותה עם נפח מסוים של הפתרון הנוגדן בשימוש. מדוד את זה על המכשיר FMT.
הערה: המערכת ישתמש המדידה הפניה של המכשיר שסופקו, יחד עם ריכוז נתון, כדי לחשב ריכוזים מעקב מוחלטת מן העתיד ויוו מדידות.
- השתמש קלטת בדיקה מחוממת עם חום של 42 מעלות צלזיוס.
הערה: פעולה זו מונעת העכברים הופך חום במהלך הבדיקה.
3. בעלי חיים הרדמה
- השתמש זרימה רצופה של 1.5-2% איזופלוריין של % vol ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]), /min21.5 L O כדי עזים ומתנגד העכברים.
4. סריקת טומוגרפיה קרינה פלואורסצנטית בתיווך
הערה: להתאים את הפרטים הבאים, שהם ספציפיים למערכת FMT בשימוש זה ללמוד (ראה את הטבלה של חומרים) עבור התקני הדמיה של השתקפות פלורסצנטיות חלופי או FMT מערכות, לפי הצורך.
- הנח את העכבר anesthetized על גבו במגרה הבדיקה.
- בצע את ההליך סריקה.
- הכנס את הקלטת לתוך מערכת ההדמייה, לסגור אותו מיד כדי להבטיח הרדמה רציפה. בחר את הדגימה המתאימה מתוך קבוצת המחקר שיצרת קודם לכן. בחר את רכיב המעקב המנוהל מתוך התפריט הנפתח כדי להבטיח כי הערכים עבור מעקב ריכוז מחושבים כהלכה.
- לרכוש פלורסצנטיות התמונה השתקפות-אורך הגל המתאים (720 nm עבור Cyanine7) עבור סריקה ותכנון חלוקה לרמות השדה סריקה על-ידי לחיצה על לחצן "לרכוש תמונות".
- ראה כי השדה סריקה מופיע ככיסוי על התמונה השתקפות זריחה. להתאים אותו לאזור של הריבית (למשל, המעי הגס או הבטן), הימנעות אוויר או אזורים של פרווה הנותרים. בהתאם המטרה התמונה, להגדיר את מספר התמונה נקודות נתונים בתוך השדה סריקה על-ידי בחירה גס לרזולוציית סריקה-שדה בינוני וקנס בתפריט בצד הימין.
הערה: עליך לזכור כי שדה סריקה בסדר אולי להציע יותר רזולוציה מרחבית על חשבון זמן סריקה משמעותית יותר. - התחל ייבוא נתונים/תמונות-אורך הגל שנבחרו על ידי לחיצה על "סרוק".
הערה: זמן הסריקה בינונית-פיין סריקה של הבטן כל תהיה בסביבות 5 דקות; בזמן הזה, כל נקודת נתונים בנפרד מואר על ידי עירור לייזר, קרינה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך נרשם. - הסר את החיה הקלטת הדמיה בסוף הסריקה ולאפשר החיה להתאושש לחלוטין לפני הנחת בחזרה לתוך הכלוב.
- חוזר את FMT אם לנכון בנקודות זמן שונות במהלך הניסוי (למשל, ימים 0, 5, ו 9-10 (סוף הניסוי)), אך קח בחשבון ההצטברות של נוגדנים בגוף, לכן הגדלת האות פלורסצנטיות רקע.
5. שלאחר סריקה
- הנח את העכבר בכלוב נפרד על מגבת נייר תחת מנורה מחממת האורות האדומים ונטר את העכבר סימנים של אי נוחות או מצוקה עד החלמה מלאה. הנח את העכבר בחזרה לכלוב שלו בהתאמה כאשר ער לגמרי.
- המתת חסד של עכברים בסוף הניסוי על ידי המשלוח של CO2 isolator במינון של 100% (v/v), 100 vol % ו 3 L/min. לא מראש למלא את התא עם CO2, כמו חשיפה פתאומית ריכוזים גבוהים של CO2 עלול לגרום מצוקה. ודא מוות לאחר העכבר הפסיקה לנשום על ידי מצב משני עוקבות של המתת חסד כגון פריקה מהירה צוואר הרחם.
- Explant המעי הגס על ידי פתיחת בטן בטן ולבצע בסריקה ex-vivo של המעי הגס explanted, כמוסבר בשלבים 4.2.1 - 4.2.4. פתח כל המעי הגס longitudinally באמצעות קורות חיים כירורגי, שטפים היטב עם תמיסת לפני הכנתו עבור ניתוח נוסף.
- השתמש באזמל לחתוך קטע 0.5 ס מ מן המעי הגס דיסטלי ולמקם אותו מיד בשפופרת הקפאה 1.5-mL. . תקפיא את זה חנקן נוזלי, חנות ב-70 מעלות צלזיוס עד להמשך השימוש (למשל,מידות myeloperoxidase (MPO))
- תשתמשו במקל עץ, סכם הנותרים longitudinally פתחו המעי הגס מ דיסטלי למטרה צינתור, עם להקרין רירית ("טכניקה רולדה"), עבור ניתוחים היסטולוגית. למקם את ההכנה מקבע (ראה את הטבלה של חומרים) ומקפיאים -80 ° C14.
6. נתונים שחזור ופרשנות
- להשתמש בכלי בנייה של תוכנת ההדמיה המתאימות ליצירת מפות תלת-ממדיות של התפלגות קרינה פלואורסצנטית הדמיה הנתונים הגולמיים; סריקות מתווספים באופן אוטומטי הכלי בנייה מחדש, כאשר בעת סריקה, הפונקציה 'הוספה לתור שחזור' נבחרה.
- אחרת, בחר את הסריקות מתוך התפריט הנפתח תחת המחקר בהתאמה, קבוצת לימוד, הסריקה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר "להוסיף השיקום".
- לצורך ניתוח נוסף, לטעון את ערכת נתונים לתוך התוכנה ניתוח. בתפריט הנפתח בשורה העליונה, בחר המחקר המתאימים ולאחר מכן בחר את קבוצת המחקר, לחיה הבודדת מהתפריט בצד הימין; כל הסריקות שבוצעה עבור חיה זו יוצגו. בחר את הסריקה הנכונים ולחץ על "לטעון".
הערה: שחזור תלת-ממד של ההתפלגות מעקב יופיע משמאל ככיסוי של התמונה השתקפות פלורסצנטיות בתחילה רכשה. הדגם ניתן לסובב, מוגדל עבור ניתוח קל יותר. - לזהות מוקדים של הצטברות תווית לא ספציפי (למשל, הכבד או שתן בשלפוחית השתן) במפות תלת-ממד המשוחזרת, להבדיל ברקמות היעד (למשל, המעי הגס או המעי).
- בסרגל העליון, בחר את הצורה רועי המתאים ביותר עבור המטרה. תווית רקמת המטרה כמו אזורים מעניינים (ROI) על-ידי הצבת כלי המדידה המתאים בתוכנת ניתוח; התוכנה תספק עוצמת קרינה פלואורסצנטית רועי, וכן (pico-) כמויות טוחנת רכיב המעקב את הסריקה כוילה עבור.
- בחר את הסכום הכולל של מעקב ההחזר המתאים, מנורמל עבור גודל רועי, כמקבילה המתאימים ביותר עבור הערכת פעילות המחלה מתאם עם לחדור דלקתיות (היסטולוגיה).
הערה: תכונות אחרות של רועי יכולה להיבחר במידת הצורך כנציג של דגם מסוים.
7.לשעבר Vivo ניתוחים
- Hematoxylin אאוזין מכתים, immunofluorescence מכתים.
- Deparaffinize סעיפים על-ידי הצבתם 70% אתנול (EtOH) למשך 2 דקות; לאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים. כתם עם פתרון hematoxylin במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מים חמים מהברז למשך 10 דקות.
- לשטוף עם מים מזוקקים, counterstain עם פתרון אאוזין למשך 2 דקות, ולשטוף שוב עם מים מזוקקים.
- במקום 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH, וקסילן (פי 2) למשך 2 דקות כל מייבשים ולנקות את הסעיפים. הר שרפי הרכבה בינונית.
- Immunofluorescence מכתים.
- השתמש הסעיפים רקמות שהושג בעבר ("סיפורי רולדה") עבור immunofluorescence מכתים והכן הקפאה-לחתוך קטעים של 7 מיקרומטר.
- לחסום את המעי הגס אצטון-קבוע וקפואים סעיפים ב- 5.0% עכברוש בסרום למשך 10 דקות, דגירה בין לילה עם מדולל (v 1/500/v) biotinylated החולדה הראשית העכבר נגד נוגדן F4/80. לשטוף את הסעיפים שלוש פעמים בתוך תמיסת מלח באגירה טריס (TBS), דגירה עם Streptavidin-FITC (בטחונות וי/v) ב- PBS/BSA (0.1% w/v) לילה ב 4 º C.
- רוחצים בסעיפים TBS את הכתם עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי, 1:1000 v/v) להשגת חדות. לנתח את התמונות פלורסצנטיות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה את הטבלה של חומרים; 40 x הגדלה קוביה מסנן N2.1 מסנן עירור 515-560) ולספור את התאים F4/80-חיובית לכל שדה ובעוצמת.
הערה: שקול להשתמש נוגדנים של שיבוט, תבנית זהה בשעת שילוב ויוו FMT, אחרי המוות היסטולוגיה ניתוחים כגון אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence מכתים, בהתאם המטרה המיועדת. איתור F4/80-חיוביות מקרופאגים ויוו ו- ex-vivo, שימשו בפורמטים שונים.
- מדידות MPO בדגימות המעי הגס.
- שימוש להשיג טריים, לשטוף-PBS דוגמאות המעי הגס או הדגימה המופשרים למדידות MPO. שוקל כל הדגימות ואת homogenize הרקמה במאגר פירוק הניתנים את אליסה קיט (ראה את הטבלה של חומרים)-נפח של µL 20 פירוק מאגר לכל מ"ג של רקמות.
- Sonicate 15 s (sonication תדר: 20 kHz, כוח: 70 W), centrifuge את הדגימות 10 דקות ב- 200 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
- שימוש אליסה זמינים מסחרית קיט (ראה את הטבלה של חומרים) על פי תיאורו באתר לפי יצרנים. לבצע את בדיקת כפילויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של קוליטיס כיבית:
DSS-induced קוליטיס היא דוגמנית מאתר המושרה כימית של דלקת מעיים דומה האדם מחלת המעי הדלקתי, מוביל לירידה במשקל, דימום רקטלי, כיבי שטחית של נזק הרירית עכברים רגישים15. זה שימושי במיוחד לחקור את התרומה של מערכת החיסון המולדת להתפתחות של דלקת מעיים10,11. לזירוז מנע בעוצמה colitic דלקת, עכברים היו ללא הרף מנוהל DSS לאורך כל הניסוי. הפחתת משקל הגוף, דם סמוי בצואה שימשו מדדי קליני של דלקת. כפי שמוצג באיור 1A, עכברים החל לאבד משקל התחלתי היום הרביעי לאחר אינדוקציה של קוליטיס, ואילו חיות בקרת מקבל מים לבד הראה ללא שינויים משמעותיים במשקל הגוף. בנוסף, בעלי חיים colitic הראה הפרשה מוגברת של דם עם צואה (איור 1B), כפי העריך באמצעות את הבאים בדיקת הצואה לא הראתה שיטת הניקוד: 0 (דם), 1 (בדיקת הצואה לא הראתה חיובי), 2 (בדיקת הצואה לא הראתה חיובי וחזותית צניפה הדימום) ו- 4 ( ברוטו דימום, דם באזור פי-הטבעת)16. אורך המעי הגס נמדדה להעריך הנוצרות על-ידי דלקת מעי לינוק, חשיפת נקודתיים מקוצר משמעותית בעכברים colitic לעומת בקרת עכברים מקבל מים לבד (איור 1C). כדי להעריך ישירות נזק שטיפת המעי הגס, בוצע ניתוח היסטולוגית בסוף הניסוי. הערכה כמותית של נזק היסטולוגית בוצעה שטיפת המעי הגס H & מקטעים שהוכתמו E באמצעות ליבה הכוללת של פציעה בהתבסס על תואר במידה של דלקת, נזק קריפטה מעורבות אחוז17. Colitic עכברים הראה סימנים של דלקת חמורה, בעוד בקרת עכברים שקיבלו DSS לא הראה שום נזק היסטולוגית (איור 1D). התמונות להדגים שינויים דלקתיים אופיינית ב- DSS-induced קוליטיס, המאופיינת על ידי ההרס של אדריכלות אפיתל, עם האובדן של תאי גביע, נזק קריפטה כיבת הרירית, בניגוד שהשתמרו במידה רבה הרירית ארכיטקטורה בקרת עכברים18. ההבדלים סטטיסטית בין הקבוצות (n = 5 לכל קבוצה) חושבו על ידי ניתוח השונות (ANOVA) ולאחר מכן על ידי תלמיד-ניומן-Keuls (S.N.K.) פוסט הוק מבחן או על-ידי הבדיקה של וולש ואחריו משחקים-האוול פוסט הוק הבדיקה במקרה של סטיה משמעותית inhomogeneity. P-הערך של < 0.05 נחשב משמעותי.
הערכה של מונוציט מקרופאג גיוס:
כמו קוליטיס DSS-induced מזוהה עם החדירה של תאים חיסוניים, ומונוציטים ו מקרופאגים, לתוך רירית ו submucosa של המעי הגס, השתמשנו מכתים immunofluorescent עבור דה מרקר מונוציט/מקרופאג F4/80 לכמת לחדור. Colitic עכברים שקיבלו DSS הראה גבוהות באופן משמעותי מספר ומונוציטים שחדר בקיר המעי הגס לעומת שליטה שאינם colitic עכברים (איור 2 א). ליקוציט הסתננות היה בנוסף לכמת באמצעות צביעת immunofluorescent עבור דה מרקר נויטרופילים GR1, חשיפת הגירה משמעותית של נויטרופילים לתוך המעי הגס מודלק לעומת בקרת עכברים (איור 2B). כדי לאשר, MPO רמות המשקף שני מספרים נויטרופילים פעילות דלקתית היו גבוהות באופן משמעותי ברקמת המעי הגס של עכברים colitic (איור 2C). אנובה ובדיקה פוסט הוק S.N.K. שימשו כדי לחשב את מובהקות סטטיסטית בין הקבוצות (n = 5 לכל קבוצה). מובהקות סטטיסטית הוגדר ב- p < 0.05.
שינוי מערכתי Macrophage Subpopulation:
העכבר ומונוציטים להקיף קבוצה הטרוגנית של subpopulations ברורים שונים במצב ההבשלה והיכולת שלהם להתגייס לאתרים דלקתיות, איפה הם להשתתף ייזום, להנציח את התגובה דלקתית19 . לכן, אנחנו מאופיין ומונוציטים דם על-ידי ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של CD11b, Ly6C באמצעות flow cytometry. תחת תנאים דלקתיים של קוליטיס DSS חריפה, הבחנו לעליה משמעותית דלקתיים CD11bגבוהLy6Cגבוה ומונוציטים לעומת תנאי הניסוי מראש. לעומת זאת, שינוי זה לא עלה בעכברים שליטה ללא colitic ללא DSS (איור 3 א). הנתונים (n = 5 לכל קבוצה) נותחו באמצעות ANOVA, S.N.K. בתור פרמטר הפונדקאית נוספים עבור דלקת מערכתית, אנחנו העריכו הנוכחות של תאים F4/80-חיוביות הטחול של עכברים colitic לעומת הלא-colitic שולט, אשר חשף עלייה משמעותית אצל עכברים שטופלו DSS (איור 3C).
סריקת טומוגרפיה בתיווך זריחה:
השתמשנו טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות למדוד מונוציט/מקרופאג גיוס וחדירה לתוך רירית המעיים. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוגדן נגד F4 מאתר/80 הועסק ישירות להמחיש מקרופאגים מופעל בבעלי חיים. נוגדנים IgG שכותרתו, לא ספציפי חולדה שימשו את הפקד isotype. לסריקה, עכברים היו גילח באזור הבטן כדי למזער את השתקפות האור על ידי הפרווה ומורדמת באמצעות אספקה רציפה איזופלוריין, בחן התקן FMT וטרינרי עבור קרינה פלואורסצנטית קטן-חיה. כפי שמוצג באיור 4A, תנאי הגיוס של קוליטיס הוביל הצטברות מוגברות באופן משמעותי של פלורסנט מעקב ב- נקודתיים של עכברים colitic לעומת פקדים שאינם colitic, המציין עלייה מונוציט הסתננות ובידול לתוך מקרופאגים פעילים ב colitic בעלי חיים. היישום של IgG התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית לא ספציפי לא זכה לתגובה לזיהוי קרינה פלואורסצנטית הבטן, המעי, גם את colitic (DSS) ולא הקבוצה שאינם colitic (מים), הוכחת יחודיות של בדיקה-היעד האינטראקציה של הנוגדן F4/80 (איור 4A). מוצגות תמונות נציג של אזור הבטן. קוד הצבע מציין את רמת עוצמת קרינה פלואורסצנטית, המתאים היקף דלקתיות לחדור(איור 4B ו- 4 C).Ex-vivo מדידות F4/80-ניהל מעקב ההצטברות נקודתיים explanted לאמת את המקור חוקן של האות ויוו זוהה של הצטברות מעקב F4/80 (איור 5 א ו- 5B). סכומים שחושבו של נוגדן מאוגד בקורלציה טוב (R2 = 0.52) עם מספרים בהיסטולוגיה נחושה של הסתננות מקרופאגים (איור 5C ו 5 D), המאשר הזה אין ויוו ההדמיה עם קליעים נותבים ספציפי יכול להיות . מצביע על פעילות המחלה המקומית. הנתונים נותחו על ידי פוסט הוק מבחן ANOVA, S.N.K. עם רמת מובהקות סטטיסטית להגדיר ב- p < 0.05. המתאם מחושב כמו רגרסיה ליניארית.
איור 1 . פרמטרים קליניים ופציעה היסטולוגית במהלך קוליטיס DSS חריפה.
C57BL/6 עכברים הם היו אתגר DSS (2% w/v) במי שתייה במשך 8 ימים. בקרת עכברים ניתנו שתייה ללא DSS. בעלי חיים היו מורדמים ביום 9. מוצגות נתונים ניסוי אחד (n = 5 לכל קבוצה) ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). (א) שינויים bodyweight מוצגים ביחס למשקל ההתחלתי. (B) דם הפרשה בצואה, כפי שנקבע על ידי הבדיקה נייר שביר (בדיקת הצואה לא הראתה, 0 = שלילי, 4 = דם בעין בלתי מזוינת). (ג) אחרי המוות המעי הגס אורך. (ד) פגיעה היסטולוגית כמו המוערך על ידי מידת הנזק קריפטה ואת מידת דלקת. מוצגות תמונות היסטולוגית נציג (haematoxylin/אאוזין מכתימה; הגדלה: 10 x (החלונית העליונה), 20 x (החלונית התחתונה)) colitic (לוחות שמאלה) או עכברים שליטה (לוחות נכון). שימו לב ההרס עמוקה של אדריכלות אפיתל, דלקתיות מחלחל (חץ). גרף: פגיעה ניקוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . מונוציט מעיים ו מקרופאג לחדור.
DSS קוליטיס היה המושרה ב- C57BL/6 על-ידי היישום של DSS (2% w/v) במי השתייה. בקרת עכברים קיבל שתייה לבד. הנתונים מ- n = 5 עכברים לכל קבוצה מוצגים ± ב- SEM. Immunofluorescent (א) החזיית מקרופאג חדירות רירית. מוצגות תמונות נציג של אנטי-F4/80 מכתים ב colitic לשלוט עכברים. גרף: שדה כוח לספור/גבוהה התא (HPF). (B) Immunofluorescent ויזואליזציה של חדירות נויטרופילים רירית. מוצגות תמונות נציג של אנטי-Gr-1 מכתים חיות colitic ובפקדים. גרף: תא ספירת/HPF. (ג) ריכוז MPO ברקמת המעי הגס של עכברים colitic ו- colitic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מונוציט הגיוס תא מעיים.
דם היקפיים ומונוציטים עכברים colitic, כמו גם בקרת עכברים (n = 5 לכל קבוצה) נותחו על ידי cytometry זרימה עבור הביטוי של Ly - 6C בתאי CD11b-חיוביות. התאים היו ממוינים לפי הביטוי האס ו- CD11b. העכבר ומונוציטים זוהו כתאי האסנמוךCD11bגבוהה , ניתחנו את הביטוי Ly6C שלהם. (א) פרופורציונלי משתנה לכיוון דלקתיים Ly6C ומונוציטיםגבוהה מתוארים ביחס לתנאי הניסוי מראש (% לשנות ± SEM). (B) נקודה FACS חלקות Ly6C ביטוי בתאי SSClאווCD11bגבוהה של בעלי חיים colitic, לפני לאחר אינדוקציה קוליטיס (לוחות התחתון) ופקדים מראש, שלאחר הניסוי (לוחות העליון). (ג) Splenocytes מ- colitic ו- colitic עכברים היו לאומדן לביטוי F4/80 cytometry זרימה (± עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . ויזואליזציה טומוגרפי של מקרופאג לחדור ב מאתר קוליטיס.
FMT סורק בעכברים colitic וערך פקדים שאינם colitic Cyanine7 מצומדת נוגדן נגד F4 מאתר/80 (n = 5 לכל קבוצה). (א) גרף: עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל ב pmol של צבע נקבע ברועי ומוצגים ± מתוארים ב- SEM. נציג תמונות עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית בצבעים המתאימים במידה של דלקתיות לחדור בעכברים מוזרק עם המכשיר הספציפי (אנטי עכבר F4/80) (B) , פקד לא ספציפי (חולדה IgG) (C). בשני המקרים, רועי בגודל זהה הונחה רוחבי על הבטן העליונה לצורך ניתוח נוסף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . Ex-vivo אימות היחודיות מעקב בקוליטיס מאתר-
אין ויוו סריקות FMT בעכברים colitic מוזרק עם המכשיר הספציפי (אנטי עכבר F4/80) הובילו שמחוץ מישורי קרינה פלואורסצנטית סריקות של המעיים explanted להפגין המקור חוקן של האות מעקב שהושג ויוו. נתונים שני ניסויים עם סך של n = 8 בעלי חיים מוצגים. להחליפן בתמונות מוצגים המתארים ויוו FMT סריקות של עכברים colitic עם פלורסצנטיות בצבעים האינטנסיביות התואמות היקף לחדור דלקתיות (א).קרינה פלואורסצנטית השתקפות הדמיה של המעי הגס explanted מאפשר זיהוי אזורים ספציפיים עם מעקב הצטברות (B). נציג אחרי המוות immunofluorescent מכתים עבור מקרופאגים F4/80-חיוביות מאזורים כאלה מאשרת את התוצאות ויוו (ג). המספר של הסתננות מקרופאגים, כפי שנקבע על ידי immunofluorescence מכתים, היו בקורלציה עם ויוו נמדדת הצטברות מעקב (ד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות טכניקות הדמיה רפואית התפתחו במהירות בשנים האחרונות, אנחנו עדיין מוגבלת היכולת לזהות תהליכים דלקתיים או גידולים, כמו גם מחלות אחרות, בשלבי ההתפתחות. עם זאת, דבר זה חיוני להבנה הגידול, הפלישה, או גרורות, תהליכים תאיים בהתפתחות של מחלות דלקתיות ומחלות ניווניות, וכלי דם אימונולוגי. ואילו טכניקות הדמיה המסורתית להסתמך על פרמטרים פיזיים או פיזיולוגיים, הדמיה מולקולרית מאפשרת את החזיית מסוים סמנים מולקולריים ויוו20.
עבור הדמיה חיית-קטן, גישות מונחה רדיונוקלידים (פליטת פוטון אינגלה, למשל sשחושב טומוגרפיה (SPECT), טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET)), אולטרסאונד, בתיווך פלורסצנטיות הדמיה יכול לשמש כדי להמחיש ספציפי מטרה מולקולרית מבנים. השימוש של נוגדנים באורך מלא כעמוד השדרה מעקב הזמינה ביותר דורש תוויות לאורך זמן, כמו מחזור ארוך פעמים ועיכוב חדירה איטית רקמות הזמן של הדמיה לאחר יישום מעקב. Radionuclides הדמיה אופייני ולכן מתאימים לא ויוו ההדמיה של התפלגות נוגדן. השימוש של איזוטופים חיים ארוך כמו Cu64 או In111 מאפשר המשדרים נוגדן מבוססי אבל דורש תשתית מורכבים המתפרסות על-פני הדור איזוטופ, בטיחות קרינה לפני, במהלך ההליך תיוג, ושל ממוגן דיור בעלי חיים לאחר בדיקה היישום. Variant יותר חסכוני ובטוח להיות קרינה פלואורסצנטית בתיווך הדמיה.
מספר ויוו מערכות איתור הדמיה, ויזואליזציה ופתוח מדידה של הפלורסנט הפצה בבעלי חיים הוצגו במהלך שני העשורים האחרונים21. ברוב המערכות מאפשרות מהיר מישורי הדמיה מתאימים עבור הדמיה הנגע שטחית. בשל קליטת האור, פיזור, אותות עמוק בתוך הרקמה להתחמק הדמיה מישוריים. הפתרון הבולטים ביותר לבעיה זו היא קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה22. מבוסס על מודלים מתמטיים, האות תמונה מתוקנת לקליטה פיזור של האור, dataset וירטואלי תלת-ממד מחושבת על פי השלכה מרובת הנתונים (dataset)8. האלגוריתם מספק נתונים כמותיים באופן מלא, ומאפשרת הערכת הריכוז מעקב בנציג אזורים ספציפיים של ריכוז/ביטוי היעד23. מגבלה רלוונטית של FMT קשורה רזולוציה מרחבית נמוכה לעומת טכניקות הדמיה אנטומית, אשר ייתכן-בהתאם הרצוי היעד-פשרה ההקצאה של מידע מולקולרית מבנים אנטומיים ספציפיים. מגבלה נוספת טמונה עומק חדירה מוגבל של אור לתוך רקמות, אשר מחייב שימוש הגששים קליטת ו ואזוריט באדום טווח הספקטרום ניר23.
מודאליות הדמיה הציג לאחרונה המשלבת את היתרונות של אולטרסאונד מורפולוגי ועל האפשרות של קבלת מידע מולקולרית מן פלורסצנטיות הדמיה הוא optoacoustic הדמיה. תוצאות ראשוניות מוקדמת מחקרים מראים כי למרות צורך עוד יותר עידון טכני-optoacoustic הדמיה חסימות הבטחה גדולה עבור הדמיה מולקולרית ו translational יישומים פוטנציאליים24.
הגיוס של לויקוציטים לדופן המעי הוא שלב חיוני החניכה, הנצחת למחלתך, כמו הגיוס של תאים דלקתיים לאתר של זיהום או דלקת רבים בתיווך החיסונית מחלות, כגון מחלות אוטואימוניות. זיהום, מחלת כלי דם, tumorigenesis, ו הרבה יותר25. כפי מונוציט הפעלה וחדירה לתוך mucosa מעיים הוא צעד חיוני בפתוגנזה של מחלת המעי הדלקתי, עיכוב של חדירה מונוציט, בניצוחו של נוגדנים ואינטראקציה מולקולה אדהזיה אינטגרין-סלולר, הוא מבטיח טיפולית הגישה12,26. לכן, ניטור ליקוציט סחר לאתר של דלקת חיוני בהתפתחות של אפשרויות טיפוליות חדשות כדי להמחיש את השפעות אנטי דלקתיות הסמים למד. זה עשוי להיות עניין מיוחד כי סוכני מיקוד ליקוציט סחר פותחו נוגדנים anti-אינטגרין מסוימים זמינים כבר לטיפול מחלת המעי הדלקתי, בעוד רכיבים נוספים יהיו זמינים בעתיד הקרוב26. Vedolizumab, חד-שבטיים מואנשים נגד יחידת משנה של אינטגרין ספציפיים בטן α4β7, Etrolizumab, אשר מאגד את יחידת משנה β7 של המעי α4β7 וαeβ7 אינטגרין heterodimers, היו מאושרים27,28. סוכנים אחרים (כגון MAdCAM 1 PF-00547659 ו- sphingosine-1-פוספט (S1P) קולטן מאפננים כגון Ozanimod) נמצאים כעת בתהליך הערכה לטיפול של מחלת המעי הדלקתי29,30.
בעת ביצוע FMT, שינויים אפשריים של הטכניקה כוללים המבחר של שילובים מעקב אחר-יעד, כמו גם שילוב FMT עם מבני הדמיה גישות כדי לפצות על רזולוציה מרחבית נמוכה. יש מגוון רחב של שילובים בדיקה-יעד שהוקמו והותאמו ממוסחר. עבור פרויקטים ספציפיים, תיוג של נוגדנים מותאמים אישית ניתן יהיה לעשות שימוש מסחרי תיוג ערכות ואת הפרוטוקול המתואר לעיל. בהתאם נוגדן או פפטיד קטן יותר נבחר לשמש מיקוד moiety, ספקים מסחריים מציעים מגוון רחב של תוויות שונות. שקול את הצבע הרצוי, בהתאם ליישום: עבור הדמיה, צבע הפועלים בספקטרום ניר רקמות עמוק (למשל, Cy7, λex / em 750/780 ננומטר) יכול להיות מותאם היטב, ואילו הבהירות הכוללת ואור יעיל אספקת צבעים הפועלים בטווח ליד הגלוי של הספקטרום (למשל, ה-GFP מקבילים) עשוי להיות עדיף. כמעט כל צבע ניתן להשיג גם אסתר פעיל לתווית ליזין-שאריות של חלבונים, כמו גם עם הכריכה אלטרנטיבית moieties, כגון maleimides עבור איגוד ציסטאין או ביוטין עבור תיוג של חלבונים מצויד עם תגים ספציפיים תיוג31 . הבחירה של התווית אינה משנה את פרוטוקול עיקרון אבל רק דורש שינויים קלים של ההליך תיוג, חשוב עבור הדמיה תוצאה טובה. שינוי אטרקטיבי אחר על מנת להתגבר על המגבלות ברזולוציה המרחבית היא שילוב FMT עם CT או MRI, הפעלת הביאור של מבנים אנטומיים במידע מולקולרית.המידע המבני ניתן גם לרכוש ברצף כמידע א-פריורי או בעת ובעונה אחת, אשר דורש היברידית הדמיה מכשור32,33.
שלבים מסוימים של הפרוטוקול מגיע תשומת לב מיוחדת. טכניקה זו יכולה להיות מותאם עבור מספר רב של photoprobes פלורסנט המכוון על מגוון רחב של מולקולות ספציפיות נציג של תהליכים מולקולריים שונים, זה חיוני כדי לאפשר חלוקת מספיק המחקרים וכל העשרה ב אזור היעד הרצוי. נקודת זמן אידיאלי עבור הדמיה עשוי להשתנות בהתאם השילוב בדיקה-יעד. למשל, נוגדן פילוח של גידול קולטני עשוי להיות מושפע הקצב דיפוזיה גידולים, ספיגת החומרים על ידי הכבד, immunogenic לוואי אפשריות34. שקול גם פקדי הרלוונטיים עבור גישות הדמיה. המשדרים ספציפי תמיד לאמת נגד isotype שולטת המשקף זלוף אפקטים ואיגוד לא ספציפי (למשל, איגוד קולטן בתיווך Fc). חיות היעד-שלילי יכול לשמש פקד נוספים עבור מעקב ירידה לפרטים, אם קיים כזה מודלים נוקאאוט. לחלופין, חסימת ניסויים ניתן לבצע כדי להוכיח יחודיות של נוגדן-יעד אינטראקציות35.
להלן שלבים קריטיים בנוגע על פתיחה של ההליך: (1) בזהירות לקבוע ריכוז DSS בשימוש, כפי DSS הרגישות עשוי להשתנות בין העכבר שונים זנים, מייצרת/אצוות36. (2) בחר בקפידה בדיקה-יעד שילובים. (3) לאפשר בסביבות 5 דקות סריקה זמן מספיק סריקה של כל הבטן. הזמן האופטימלי הצבע בין מעקב יישום הנוהל הדימות צריך להיקבע בקפידה כדי לאפשר מעקב הצטברות באזור היעד הרצוי. עבור זיהוי F4/80 מעיים מאתר קוליטיס, הנוגדן שכותרתו צריך להיות מוזרק 24 שעןת לפני הסריקה. (4) כמו הצטברות תווית לא ספציפי עלול להתרחש (למשל, בכבד), זה הכרחי לתייג את רקמת המטרה המתאים כמו רועי על-ידי הצבת כלי המדידה בהתאמה. יתר על כן, הפקדים מספיק להפצה מעקב לא ספציפי להיות כלול-לשקול isotype לא ספציפי פקדים כדי לשלול זלוף אפקטים, הסתרה או לימודים חסימה כדי לאמת את האינטראקציה מעקב-יעד.
מקורות טיפוסי של השגיאה הקשורים שחזור פרוצדורה ונתונים סריקה כוללות עמדת בעלי חיים לא תקין, סריקה שדה, וזמן החשיפה. בעת ביצוע מיקום החיה, הנגע ואזוריט צריך להיות מוקף רקמות על כל הצדדים כדי למזער את הרעש שחזור. בועות אוויר לכוד בין החיה לבין לוח הזכוכית הקדמית בקלטת ההדמיה עלול גם להגדיל את רעש ויש להסירם על-ידי העברת החיה מעט. נגמר - או מצילום של התמונה תוכל לדרוש סריקה הכל נראה טוב עם הגדרות חשיפה שונה, אשר ניתן למצוא במסך סריקה (השתקפות תמונת רחוב: התאמות של החזית LED עוצמת וחשיפה הזמן). בשעת שילוב ויוו נוגדן מבוססי FMT מדידות עם היסטולוגית ניתוח לאחר המוות , כגון אימונוהיסטוכימיה או צביעת immunofluorescent, השימוש של נוגדנים של שיבוט, תבנית זהה להתייחס. בנוסף, בעת ביצוע מדידות FMT החוזרות על עצמן את החיות זהה, פורמטים זהה של שיבוטים אמור לשמש כדי למנוע אשיג אפשרי או התמקדות epitopes שונים.
יחדיו, טומוגרפיה מתווכת-מולקולרית של קרינה פלואורסצנטית מאפשר בקרה חוזרות של הקורס המחלה הבסיסית התהליכים הקשורים pathophysiological. זה יכול להיות מיושם למגוון רחב של מחקרים ביו עשוי להיות שימושי להאיץ בדיקות סמים או בתור נקודת קצה אובייקטיבית ב פרטנית טיפולים. FMT פילוח של מקרופאגים F4/80-ביטוי במודלים של דלקת מספק כלי חשוב לא פולשנית כדי להמחיש ולכמת את חדירת ואת הצטברות של תאים דלקתיים תוך הצגת גם מתאם טוב קונבנציונלי המפרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים גב' סוניה Dufentester, גב אלקה וובר, גב' נעמה Niepagenkämper לסיוע טכני מעולה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
