Mål-spesifikke sonder representerer et nyskapende verktøy for å analysere molekylære mekanismer som protein uttrykk i ulike typer sykdommer (f.eks betennelse, infeksjon og tumorigenesis). I denne studien beskriver vi en kvantitativ tredimensjonale tomographic vurdering av intestinal macrophage infiltrasjon i murine modell av kolitt med F4/80-spesifikke fluorescens-mediert tomografi.
Murine modeller av sykdommen er uunnværlig til vitenskapelig forskning. Men ansatt mange diagnostiske verktøy som endoskopi eller tomographic imaging ikke rutinemessig i dyremodeller. Konvensjonelle eksperimentelle readouts er ofte avhengige av post mortem og ex vivo analyser, som hindrer intra personlige oppfølging undersøkelser og øke antall studie dyr nødvendig. Fluorescens-mediert tomografi kan ikke-invasiv, repeterende, kvantitativ, tredimensjonale vurdering av fluorescerende sonder. Det er svært følsomme og tillater bruk av molekylære beslutningstakere, som gjør at bestemte gjenkjenning og karakterisering av forskjellige molekylære mål. Spesielt representerer målrettet sonder et nyskapende verktøy for å analysere genet aktivisering og protein uttrykk i betennelse, autoimmune sykdommer, infeksjon, vaskulær sykdom, celle migrasjon, tumorigenesis, etc. I denne artikkelen gi vi instruksjoner på denne avansert bildeteknologi for i vivo gjenkjenning og karakterisering av betennelse (dvs. F4/80-positiv macrophage infiltrasjon) i en brukte murine modell av intestinal betennelser. Denne teknikken kan også brukes i forskningsområder som immun celle eller stilk cellen sporing.
Dyr modeller er mye brukt i forskning, og mange ikke-invasiv prosedyrer eksisterer for å overvåke sykdomsaktivitet og vitalitet, som kvantifisering av kropp vekt endringer eller analyse av blod, urin og avføring. Dette er imidlertid bare indirekte surrogat parametere som også inter-individuelle variasjon. De må ofte suppleres av post mortem analyser av vev, som hindrer føljetong observasjon på repeterende tidspunkt og direkte observasjon av fysiologiske eller patologisk prosesser i vivo. Sofistikert liten-dyr Bildeteknikker har dukket opp, inkludert kryss seksjon bildebehandling og optisk tenkelig endoscopy, som kan direkte visualisering av prosessene og gir også mulighet for gjentatte analyser av samme dyr1 , 2 , 3. i tillegg muligheten til å full av gjentagelser overvåke ulike stater av sykdom i samme dyret kan redusere antall dyr nødvendig, som kan være ønskelig fra et dyreetikk synspunkt.
Det finnes flere forskjellige optiske imaging teknikker for i vivo fluorescens bildebehandling. Opprinnelig var AC confocal imaging ansatt å studere overflate og undergrunnen fluorescerende hendelser4,5. Nylig imidlertid har tomographic systemer som tillater kvantitative tredimensjonale vev vurderinger vært utviklet6. Dette er oppnådd gjennom utvikling av fluorescerende sonder som avgir lys i nær-infrarøde (NIR) spektrum, tilbyr lave absorpsjon, følsom detektorer og monokromatisk lyskilder7. Mens tradisjonelle tverrsnittet Bildeteknikker, som beregnet tomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI) eller ultralyd (US), stole mest på fysisk parameterene og visualisere morfologi, kan optisk tenkelig gi mer informasjon på underliggende molekylære prosesser sonder bruker endogene eller eksogene fluorescerende8.
Fremskritt innen molekylærbiologi har bidratt til å forenkle generasjonen av smart og målrettet fluorescerende molekylær sonder for et økende antall mål. For eksempel kan reseptor-mediert opptak og distribusjon i et gitt mål visualiseres ved hjelp av carbocyanine derivat-merket antistoffer9. Overflod av tilgjengelige antistoffer, som kan være merket skal fungere som bestemte tracers i ellers utilgjengelige områder av kroppen, gir enestående innsikt i molekylære og cellulære prosesser i modeller av tumorigenesis og nevrodegenerative, hjerte, immunologiske og inflammatoriske sykdommer7.
I denne studien beskriver vi bruken av fluorescens-mediert tomografi i murine modell kolitt. Dekstran natrium sulfat (DSS)-indusert kolitt er en standard kjemisk indusert musemodell intestinale betennelsen som ligner inflammatorisk tarm sykdom (IBD)10. Det er spesielt nyttig å vurdere bidrag av det medfødte immunsystemet til utviklingen av gut betennelse11. Siden rekruttering, aktivisering og infiltrasjon av monocytter og makrofager representerer avgjørende skritt i patogenesen av IBD, er visualisering av rekruttering og the kinetics av infiltrasjon avgjørende for overvåking, for eksempel effekten av potensielle terapeutiske stoffer i en prekliniske innstillingen12. Vi beskriver induksjon av DSS kolitt og demonstrere tomografi-mediert karakterisering av macrophage infiltrasjon i tarmen mucosa bruker fluorescens molekylær tomografi for bestemte effekten av monocyte/macrophage merket F4/80 13. i tillegg vi illustrere ekstra og supplerende prosedyrer, for eksempel antistoff merking; Det eksperimentelle oppsettet; og analyse og fortolkning av fått bildene, i sammenheng med konvensjonelle readouts som sykdom aktivitet indekser, flow cytometri og histologiske analyse og immunohistochemistry. Vi diskutere begrensninger av denne teknikken og sammenlignet med andre tenkelig modaliteter.
Selv om medisinske Bildeteknikker har utviklet seg raskt de siste årene, er vi fremdeles begrenset i vår evne til å oppdage inflammatoriske prosesser eller svulster, samt andre sykdommer, i deres tidligste stadiene av utviklingen. Dette er imidlertid avgjørende for å forstå tumor vekst, invasjon, eller metastaser utvikling og cellulære prosesser i utviklingen av inflammatoriske lidelser og degenerative, hjerte og immunologiske sykdommer. Mens tradisjonelle Bildeteknikker stole på fysisk eller fysiologiske paramet…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ms. Sonja Dufentester, Ms. Elke Weber og fru Klaudia Niepagenkämper for utmerket teknisk assistanse.
Reagents | |||
Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |