Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير

Published: July 22, 2017 doi: 10.3791/55955
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 1,3
1London Research and Development Centre, Agriculture & Agri-Food Canada, 2Department of Biology, University of Western Ontario, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Western Ontario

Summary

ويدعم النظام كوكولتفاتيون المائية المائية النباتات سليمة مع شاشات شبكة معدنية وتزرع لهم البكتيريا. ويمكن بعد ذلك تحصين الأنسجة النباتية والبكتيريا والجزيئات التي تفرز بشكل منفصل لتحليل المصب، مما يسمح في وقت واحد للاستجابات الجزيئية من كل من المضيفين النبات والتفاعل الميكروبات أو الميكروبيوم ليتم التحقيق فيها.

Abstract

إن التصميم التجريبي الذي يحاكي التفاعلات الطبيعية بين النباتات والميكروب مهم جدا لتحديد عمليات التشوير المعقدة للنباتات الميكروبية. أرابيدوبسيس ثاليانا - أغروباكتريوم توميفاسيانز يوفر نظام نموذج ممتاز لدراسة المرضية البكتيرية وتفاعلات النبات. الدراسات السابقة من النباتات -التفاعلات العطرية تعتمد إلى حد كبير على الخلايا النباتية تعليق الثقافات، اصابة اصطناعية للنباتات، أو تحريض اصطناعي من عوامل الفوعة الميكروبية أو الدفاعات النباتية من قبل المواد الكيميائية الاصطناعية. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تختلف عن الإشارات الطبيعية في بلانتا ، حيث النباتات والميكروبات تعترف وتستجيب في الأخلاق المكانية والزمانية. يعرض هذا العمل نظام استنبات مشترك المائية حيث يتم دعم نباتات سليمة من خلال شاشات شبكة معدنية وcocultivated مع الأجرعية. في هذا النظام كوكولتيفاتيون، لا الاصطناعية فيتوهورمون أو الكيميائية التي تحفز ميكرأوفيال الفوعة أو دفاع النبات ويستكمل. نظام كوكولتفاتيون المائية يشبه عن كثب التفاعلات النباتية والمكروب الطبيعية والتوازن إشارة في بلانتا . ويمكن فصل جذور النباتات عن الوسيط المحتوي على أغروباكتريوم ، ويمكن التحقق من إشارات واستجابات كل من المضيفات النباتية والميكروبات المتفاعلة في وقت واحد ومنهجي. في أي وقت معين / فاصل زمني، يمكن حصاد الأنسجة النباتية أو البكتيريا بشكل منفصل لمختلف تحليلات "أوميكس"، مما يدل على قوة وفعالية هذا النظام. يمكن تكييف نظام الزراعة المائية بسهولة لدراسة: 1) الإشارات المتبادلة لنظم متنوعة من نباتات الميكروب، 2) تشوير بين مضيف النباتات والأنواع الميكروبية المتعددة ( أي اتحادات الميكروبات أو الميكروبيوم)، 3) كيفية تورط العناصر الغذائية والمواد الكيميائية في تشوير النباتات الميكروبية، و 4) كيفية تفاعل الميكروبات مع المضيفين النبات والمساهمة في تحمل النبات للحيوية or أبيوتيك ستريسس.

Introduction

وتؤدي الميكروبات المرتبطة بالمصانع أدوارا هامة في ركوب الدراجات الكيميائية الجيولوجية الحيوية، والمعالجة البيولوجية، والتخفيف من تغير المناخ، ونمو النباتات والصحة، وتسامح النبات للإجهادات الأحيائية وغير الحيوية. الكائنات الحية الدقيقة تتفاعل مع النباتات مباشرة من خلال الخلايا النباتية الجدار الاتصال وبشكل غير مباشر عن طريق إفراز الكيميائية والإشارات 1 ، 2 ، 3 . وبوصفها كائنات حية، وضعت النباتات آليات مباشرة وغير مباشرة لمقاومة العدوى بواسطة مسببات الأمراض. وتشمل الدفاعات المباشرة الدفاعات الهيكلية والتعبير عن بروتينات الدفاع، في حين أن الدفاعات غير المباشرة تشمل إنتاج المستقلب النبات الثانوي وجذب الكائنات الحية معادية للغزو مسببات الأمراض 4 ، 5 . الجذور المستمدة من الافرازات الجذر، إفرازات، ميوسيلاجيس، موسيجيل، و ليسيتس يغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية لل ريزوسفير لجذب أو صدالميكروبات نحو المضيفين 6 . التركيب الكيميائي لإفراز الجذر هو نوع معين، وبالتالي بمثابة مرشح انتقائي يسمح بعض الكائنات الحية الدقيقة قادرة على الاعتراف هذه المركبات لتزدهر في الجريزوسفير 6 . وهكذا، يمكن تحفيز الأنواع الميكروبية المتوافقة لتنشيط وتعزيز جمعياتها، إما لصالح أو ضرر للمضيف النبات 1 .

ويعد فهم تفاعلات الميكروب النباتي في الغلاف الجوي أمرا أساسيا لتعزيز إنتاجية النبات وأداء النظام الإيكولوجي، حيث أن غالبية التعرض للميكروبات والكيماويات يحدث في البنية الجذرية والسطح البيني للتربة والهواء 2 و 6 و 7 و 8 . ومع ذلك، فإن فحص التفاعلات بين النباتات الميكروبية تحت الأرض والاستجابات المتبادلة كان تحديا بسبب ما يثير الفضول والطبيعة المعقدة والديناميكية وعدم وجود نماذج تجريبية مناسبة مع هيكل الجذر الطبيعي ومورفولوجيا النبات تحت ظروف نمو يمكن السيطرة عليها بإحكام. وباعتبارها واحدة من أكثر النباتات النباتية التي تمت دراستها بشكل كبير، فإن الجراثيم تصيب مجموعة واسعة من النباتات ذات الأهمية الزراعية والبستانية، بما في ذلك الكرز والتفاح والكمثرى والعنب والورود 9 . الجراثيم هو كائن نموذج مهم لفهم التفاعلات الممرضات النباتية وهو أداة قوية في تحويل النبات والهندسة النباتية 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 .

وقد تم دراسة التفاعلات الجراثيم دراسة جذور لعدة عقود، والفهم الحالي للأمراض الجراثيم المرضية واسعة النطاق 9 ،f "> 11 ، 15 ، 16. ويعزى المرضية الجرثومية إلى حد كبير إلى قدراتها المتطورة لإدراك الإشارات المستمدة من النباتات، مما أدى إلى التشكيل الدقيق لبرنامج الفوعة والاتصالات من خلية إلى خلية، ما يسمى استشعار النصاب 17 . وينظم برنامج الجرثومة الفوعة من قبل العديد من الإشارات المتاحة في ريزوسفير وينطوي على مجموعتين من أنظمة 2-مكون، ونظام تشفغ / I ونظام فيرا / G.الظروف الحمضية في ريزوسفير تفعيل النسخ من تشفغ / I ، فيرا / G ، والعديد من الجينات الأخرى المشاركة في الأجرعية المرضية، بما في ذلك virE0، virE1، virH1، virH2، والجينات من نوع VI نظام إفراز (T6SS) 18. المركبات الفينولية، بما في ذلك acetosyringone (4'-هيدروكسي-3، 5 مصنع مشتقة '-dimethoxyacetophenone)، وتفعيل Vإيرا / G 2-نظام مكون من خلال آليات الإشارات الفسفرة 19 . فيرا / G ثم ينشط ريجيونون الفيروس بأكمله، مما أدى إلى نقل والتكامل من ~ 20 كيلو بايت جزء الحمض النووي البكتيرية تسمى الحمض النووي نقل (T- دنا) من البلازميد (تي) التي تحفز الورم في نواة النبات 16 . T-دنا يحمل الجينات المسؤولة عن تخليق هرمونات النبات إندول -3 حمض الخليك (إيا) ( إام و إاه ) والسيتوكينين ( إيبت )، وعبر مرة واحدة في الخلايا النباتية، ويتم إنتاج كميات كبيرة من هذه الفيتوهورمونات. وهذا يؤدي إلى انتشار الأنسجة غير طبيعي وتطور الورم النباتي، والمعروفة باسم مرض غالون تاج، وهو مشكلة مزمنة وعاد للنباتات 9 ، 11 ، 20 . إيا أيضا يعمل بشكل جماعي مع حمض الصفصاف وحمض الأمينية غاما الأمينية لقمع الفوعة الجرثومية أو للحد من أغروباكتيريو (كور) الاستشعار عن بعد (قس) 17 ، 21 ، 22 . لمكافحة هذا القمع، T- الحمض النووي يحمل أيضا الجينات لالبصرية الحيوي، الذي ينشط أغروباكتريوم النصاب الاستشعار عن تعزيز إمبروكتريوم المرضية وأيضا بمثابة مصدر المغذيات للمسبب 22 ، 23 .

وعلى الرغم من فهم عميق العام للالأجرعية التفاعلات -plant والناتجة نقل T-DNA إلى المضيف النبات، والأحداث الإشارات المعقدة في المرحلة الأولى من التفاعل وفهم أقل أيضا. ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود المفروضة على النهج التقليدية للتحقيق الجراثيم- زرع إشارة. وتستخدم الخلايا النباتية تعليق الثقافات والجروح اصطناعية محددة الموقع عادة لدراسة الجزيئية التفاعلات النباتية ميكروب 24 ،إف "> 26 ، 27. ومع ذلك، تعليق خلية تفتقر النموذجية مورفولوجيا النبات، على وجه الخصوص، وخلايا تعليق النبات ليس لديهم هياكل الجذور ونضح الافرازات، والتي هي مهمة جدا لتفعيل الكيميائي الميكروبي والفوعة 28 ، 29. الحفاظ على مورفولوجيا النبات وقد تم معالجة هيكل الجذر عن طريق اصابة النباتات اصطناعيا، مما يسهل العدوى موقع معين، مما أدى إلى الكشف عن الجينات ذات الصلة دفاع النبات التي يسببها في الأنسجة النباتية المصابة مباشرة 30 ، 31. ومع ذلك، الإصابات الاصطناعية يختلف اختلافا كبيرا عن العدوى الممرض في الطبيعة ، لا سيما أن الجرح يؤدي إلى تراكم حمض جاسمونيك (جا)، والذي يتداخل بشكل منهجي مع إشارات النباتات الطبيعية والدفاع 26. وبالإضافة إلى ذلك، وتستخدم المواد الكيميائية الاصطناعية عادة لتحفيز اصطناعية ردود المضيف النباتأو فيروسة الممرض. على الرغم من أن تكملة هذه المركبات الكيميائية تعكس تركيزات في بلانتا ممكن، فإن مثل هذه المكملات لا تمثل نشر الافرازات الجذر تدريجيا في ريزوسفير المحيطة، الذي يولد التدرج الكيميائي الاستشعار عن طريق الميكروبات 28 ، 32 . ونظرا للقيود المفروضة على النهج التقليدية لدراسة تفاعلات الميكروبات النباتية، قد تكون دقة وعمق البيانات التي تم الحصول عليها معوقة ومقيدة، والمعرفة الناتجة عن النهج التقليدية قد لا تترجم مباشرة في النباتات . العديد من جوانب النباتات الزراعية إشارة ليست مفهومة تماما، لا سيما في المرحلة المبكرة من التفاعلات، عندما لم تظهر أعراض المرض بعد.

ولتعديل القيود على النهج التقليدية، يعرض هذا العمل الزراعة المائية غير المكلفة والمتحكم فيها بشكل صارم والمرننظام أوكولتيفاتيون الذي يسمح للباحثين للحصول على رؤى أعمق في مسارات التشوير والاستجابة المعقدة في المرحلة الأولى من التفاعلات الجزيئية النباتية والميكروب. وقد استخدمت الزراعة المائية على نطاق واسع لدراسة المغذيات النباتية، الافرازات الجذر، وظروف النمو، وآثار السمية المعدنية على النباتات 33 ، 34 . وهناك العديد من المزايا للنماذج المائية، بما في ذلك المتطلبات المكانية الصغيرة، وإمكانية الوصول إلى الأنسجة النباتية المختلفة، والرقابة المشددة على العناصر الغذائية / البيئية، ومكافحة الآفات / الأمراض. كما أن أنظمة الزراعة المائية أقل تقييدا ​​لنمو النباتات مقارنة بتقنيات طلاء أجار / فيتواغار التي تقيد النمو عادة بعد 2-3 أسابيع. الأهم من ذلك، والحفاظ على هياكل المصنع كله يسهل إفراز الجذر الطبيعي الضروري للالعلاج الكيميائي الميكروبي والفوعة الحث 8 ، 29 . وصف النظامالسرير هنا هو أبسط وأقل كثيفة العمالة من البدائل 33 ، 34 . ويستخدم أجزاء أقل ولا يتطلب أي أدوات أخرى من مقص القياسية. ويستخدم شبكة معدنية (على عكس النايلون 33 ) كدعم قوي لنمو النبات وطريقة بسيطة من التهوية تحت ظروف معقمة من خلال الهز لدعم النمو الميكروبي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للنظام استخدام شبكة معدنية من مختلف الأحجام لدعم نمو النبات، الذي يستوعب أنواع النباتات المختلفة دون تقييد عرض جذورها.

في النظام كوكولتفاتيون المائية المعروضة هنا، تزرع النباتات في نظام الزراعة المائية العقيمة حيث جذور النباتات تفرز المركبات العضوية التي تدعم نمو البكتيريا الملقحة. في هذا النظام كوكولتيفاتيون، لا تكمل أي مواد كيميائية اصطناعية، مثل هرمونات النبات، داعية إليتور، أو المواد الكيميائية التي تسبب الفوعة، مما يعكس الخلية الطبيعيةوالتوازن -signaling خلال التفاعلات مصنع الميكروب. مع هذا النظام كوكولتفاتيون المائية، كان من الممكن تحديد في وقت واحد التعبير الجيني في أرابيدوبسيس ثاليانا كول -0 أنسجة الجذر على العدوى من قبل أغروباكتريوم ، فضلا عن تفعيل الجينات الجراثيم على كوكولتيفاتيون مع أرابيدوبسيس . وقد تجلى أيضا أن هذا النظام هو مناسبة لدراسة مرفق الأجرعية إلى جذور النباتات، وكذلك التعريف secretome جذور النبات، على استنبات مشترك (العدوى) مع الأجرعية (الشكل 1).

شكل 1
الشكل 1: نظرة عامة على نظام الزراعة المائية، مع تحليلات عينة. تزرع النباتات على رأس شبكة (يطلق النار فوق شبكة)، مع جذور مغمورة في المتوسطة المائية التي يتم بعد ذلك تلقيح مع البكتيريا وأو كوكولتشر. ثم يتم فصل الأنسجة النباتية والبكتيريا للاستخراج في وقت واحد والتحليلات. وقد عدل هذا الرقم من المرجع 35 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التخطيط التجريبي

  1. حدد الأهداف المحددة للتجربة.
  2. قراءة من خلال البروتوكول بأكمله أدناه. حدد الأقسام ذات الصلة بالأهداف المحددة وما إذا كان يلزم إجراء أي تعديلات. انظر أدناه للحصول على أمثلة.
    1. النظر في ما إذا كانت التجارب سوف تستخدم A. النباتات ثاليانا و A. البكتيريا المومياء ، على النحو التالي، أو مزيج آخر من النبات الميكروبي.
      ملاحظة: في حين يمكن استخدام أنواع النباتات المختلفة، سمك جذور النبات قد تتطلب شبكة مختلفة الحجم (الخطوة 3.3)، ومعلمات النمو (الخطوات 3.10-3.11، و 4.4) وحجم خزان المائية وحجم المتوسطة (خطوة 4.2) قد تتطلب أيضا تعديل ( الشكل 2 ). يمكن بسهولة تلقيح الميكروبات كثقافات خالصة، أو أنواع مختلطة (كونسورتيومات)، أو من عينات بيئية (ميكروبيوم)، ولكن يمكن أن تؤثر أي تغييرات على البروتوكول، وخاصة الخطوة 4.5.
    2. النظر فيأنواع التجارب التي سيتم استخدامها لتحليل العينات.
      ملاحظة: المجهر مضان (الخطوة 5) يتطلب الكائنات التي وصفت مع بناء مراسل الفلورسنت.
  3. تصميم الضوابط المناسبة. وتشمل خزانات المائية دون الشتلات التي يتم تلقيحها مع البكتيريا السيطرة والدبابات مع شتلات السيطرة التي لم يتم تلقيح مع البكتيريا.
  4. خطة التجارب مع العدد المناسب من البذور والدبابات المائية. النظر في الضوابط، مكررات البيولوجية (3 على الأقل)، وكميات من الأنسجة اللازمة لجميع التحليلات.
  5. تحديد طول مناسب من كوكولتفاتيون للأهداف التجريبية (الخطوة 4.8).
  6. راجع أي خطوات أدناه، حسب الاقتضاء.

الشكل 2
الشكل 2. أمثلة على النباتات الأخرى التي يمكن زراعتها في نظام الزراعة المائية، بدعم من P منصة من شبكة معدنية. التوافق بين مجموعة من شبكات معدنية لمجموعة متنوعة من بذور النباتات وزراعة. ( A ) الفولاذ المقاوم للصدأ نوع 304 ويلدميش 3 × 3 شبكة × .047 "ديا سلك ل فيسيا فبا . ( ب ) الفولاذ المقاوم للصدأ نوع 304 ويلدميش 4 × 4 شبكة × .035" ديا الأسلاك ل زي مايس . (C) نوع الفولاذ المقاوم للصدأ 304 weldmesh 4 × 4 × شبكة 0.032 "سلك ديا لجليكاين ماكس (فول الصويا). (D) نوع الفولاذ المقاوم للصدأ 304 weldmesh 6 × 6 × شبكة 0.047" سلك ديا لRaphanus نبات الخيار (الشتاء الفجل). ( E ) الفولاذ المقاوم للصدأ نوع 304 ويلدميش 6 × 6 شبكة × .047 "ديا سلك ل تريتيكوم سب. ( F ) الفولاذ المقاوم للصدأ نوع 304 ويلدميش 6 × 6 شبكة × .035" ديا سلك ل كوكوميس ساتيفوس . وقد عدل هذا الرقم من المرجع 35 .955fig2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. النبات البذور سطح التعقيم

  1. دوامة (بسرعة عالية) ما يقرب من 200 بذور A. ثاليانا مع 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب ميكروسنتريفوج. بالنسبة لأنواع النباتات ذات البذور الكبيرة، استخدم أنبوب كبير لتسهيل التعقيم السطحي.
  2. أجهزة الطرد المركزي هذا في حوالي 9000 x ج لمدة 30 ثانية في ميكروسنتريفوج الجدول الأعلى. إزالة الماء (طاف) باستخدام ماصة.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من 2٪ هيبوكلوريت الصوديوم إلى البذور والدوامة. ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. بالنسبة لأنواع النباتات ذات البذور الكبيرة، استخدم كميات أكبر لتغطية البذور.
  4. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 9000 x ج لمدة 30 ثانية في ميكروسنتريفوج طاولة أعلى. إزالة محلول هيبوكلوريت الصوديوم باستخدام ماصة.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من العقيمة، منزوع الأيونات الماء إلى البذور والدوامة. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 9000 x ج ل30 ثانية وإزالة المياه باستخدام ماصة معقمة.
  6. كرر الخطوة 2.5 إضافية 4 مرات.
  7. إضافة 500 ميكرولتر من الايثانول 70٪ إلى البذور والدوامة. ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
  8. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 9000 x ج لمدة 30 ثانية في ميكروسنتريفوج طاولة أعلى. إزالة الايثانول 70٪ باستخدام ماصة.
  9. كرر الخطوة 2.5 إضافية 5 مرات.
  10. ريسوسبيند البذور معقمة في 500 ميكرولتر من العقيمة، الماء عالى النقاء.

3. إنبات البذور و شبه الصلبة زراعة النباتات

  1. إعداد شبه الصلبة موراشيج و سكوغ (مس) المتوسطة: 2.165 ز / ل مس الأملاح القاعدية. 10 غ / L سكروز؛ 0.25 جم / لتر ميس؛ و 59 مل / لتر B5 مزيج فيتامين، ودرجة الحموضة 5.75، مع 4 غ / L فيتواغار.
  2. الأوتوكلاف المتوسطة مس. صب 25 مل منه في كل طبق بتري عميق العقيمة (100 × 25 مم 2 ).
  3. لكل طبق بتري، وقطع 90 × 90 مم مربع من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة.
    ملاحظة: شبكة الموصى بها ل A. ثاليانا < / إم> على درجة 304 (الدرجة القياسية)، وعدد الشبكة (عدد الثقوب لكل بوصة خطية) 40 × 40، وقطر السلك 0.01 "(0.0254 سم)، وهناك حاجة إلى مربع شبكة أكبر لصهاريج هدروبينيك أكبر أو منصات أعلى.
  4. ثني زوايا كل شبكة مربعة فقط بما فيه الكفاية بحيث شبكة يناسب داخل لوحة بتري. ثني الزوايا في زاوية 90 درجة إلى الجزء الأكبر من شبكة للسماح شبكة لتكون مدعومة من قبل الزوايا، وترك مساحة كافية أدناه لتطوير الجذر ( الشكل 3A ).
  5. وضع الساحات شبكة قطع في كوب، تغطية مع رقائق الألومنيوم، وتعقيم بواسطة التعقيم باستخدام دورة 30 دقيقة الجافة.
  6. مرة واحدة وقد عززت المتوسطة في أطباق بتري وشبكة معقمة، ضع كل مربع شبكة معقمة على رأس المتوسطة شبه الصلبة، مع زوايا عازمة تواجه أسفل.
  7. دفع الشبكة بحيث زوايا تخترق المتوسطة والجزء الأكبر من شبكة تلامس السطح العلوي من المتوسطة (> الشكل 3 ب).
  8. استخدام ماصة نقل 200 ميكرولتر لرسم الفردية سطح تعقيم A. بذور ثاليانا (البذور ستبقى على طرف ماصة بسبب قوة فراغ) ونقل بلطف كل البذور على رأس شبكة. وضع البذور بحيث تكون متباعدة بشكل مناسب للاحتياجات التجريبية (على سبيل المثال، 4 6 بذور / لوحة).
  9. ختم لوحات بتري مع الأغطية، ووضع الشريط الجراحية يسهل اختراقها حول حواف.
  10. تصنف البذور بوضع طبق بتري بأكمله عند 4 درجات مئوية لمدة 2 د في الظلام (على سبيل المثال، التفاف في التينفول لمحاكاة الظلام.)
  11. زراعة البذور في طبق بتري في 22-24 درجة مئوية مع 16 ساعة فوتوبيريود لمدة 10-14 يوما ( الشكل 3C ).

الشكل 3
الشكل 3: نظام زراعة النباتات الميكروبية المائية. اليسار اليسارنيل يمثل مخططا تدفق يحدد الخطوات الرئيسية الست في تجميع وتشغيل نظام الزراعة المشتركة للزراعة. اللوحة اليمنى يوضح المواد التجريبية الفعلية، والمعدات، والإجراءات التشغيلية لنظام الزراعة المائية كوكولتيفاتيون عند دراسة التفاعلات أرابيدوبسيس-أغروباكتريوم . وتظهر الآن خطوة التلقيح والخطوة النهائية لأخذ العينات النباتية أو البكتيرية. وقد عدل هذا الرقم من المرجع 35 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. نظام كوكولتيفاتيون المائية

  1. إعداد السائل موراشيج و سكوغ (مس) المتوسطة: 2.165 غم / لتر الأملاح القاعدية مس، 10 غ / L سوكروز، 0.25 غ / L ميس، و 59 مل / L B5 مزيج فيتامين، ودرجة الحموضة 5.75.
  2. الأوتوكلاف المتوسطة. صب 18 مل منه في كل زجاج أسطواني معقمة أو خزان من البلاستيك واضحة (أطباق بلورة، 100 × 80 مم2) مع الأغطية المعقمة.
    ملاحظة: بريستريليز الدبابات والأغطية عن طريق لفها في رقائق الألومنيوم والتعقيم.
  3. في غطاء تدفق معقمة، استخدام ملقط معقم لنقل بلطف كل مربع شبكة مع 10-14 شتلات عمرها اليوم من المتوسطة شبه الصلبة إلى خزان اسطواني المائية ( الشكل 3D ). ختم الأغطية على الدبابات باستخدام الشريط الجراحي المسامية.
  4. زراعة الشتلات على شبكة في الخزان لمدة 72 ساعة في 22-24 درجة مئوية، مع 16 ساعة فوتوبيريود والهز في 50 دورة في الدقيقة لتهوية ( الشكل 3E ).
    ملاحظة: هذا يسمح للنباتات للتكيف مع البيئة المائية قبل التلقيح (كوكولتيفاتيون) مع الكائنات الحية الدقيقة. وستسمح فترة االنتظار أيضا بالتلوث الجرثومي العرضي قبل ظهور التلقيح.
    1. تبدأ الخطوة التالية في اليوم السابق لنهاية فترة الحضانة.
  5. تنمو A. توميفاسيونس في أب المتوسطة(0.5٪ ث / الخامس الخميرة استخراج، 0.5٪ ث / ت تريبتون، 0.5٪ ث / س السكروز، 50 ملي مغسو 4 ، ودرجة الحموضة 7.0) عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز بين عشية وضحاها حتى تصل الثقافة كثافة بصرية النهائية من 1.0 في 600 نانومتر (أود 600 )، كما تم قياسها باستخدام مقياس الطيف، مع المتوسطة أب أونينوكولاتد كما فارغة.
    ملاحظة: أود 600 من 1.0 ما يعادل حوالي 10 9 خلايا / مل.
  6. غسل A. توميفاسينس ثلاث مرات في حجم مساو من 0.85٪ كلوريد الصوديوم. ريسوسبيند في حجم متساو من الماء المقطر المزدوج المعقم.
  7. قبل التلقيح، فحص الدبابة مع الشتلات بعناية لضمان عدم وجود تلوث. يجب أن تكون الوسيلة في الخزانات غير الملوثة واضحة وشفافة.
    1. تجاهل أي خزان مع السائل الغائم (التلوث) وعدد بقية الدبابات. عينة كمية صغيرة (20 ميكرولتر) من المتوسطة المائية من كل دبابة مرقمة ووضعه على طبق بتري مليئة لوريا مرق (لب). احتضانطبق في 28 درجة مئوية.
  8. على الفور، إضافة 50 ميكرولتر من تعليق A. توميفاسيانز (حوالي 5 × 10 7 خلايا، ويقدر من أود 600 ) في كل خزان مائي مرقمة. كوكولتيفات الشتلات A. ثاليانا و A. المهدئات في 22-24 درجة مئوية مع فوتوبيريود 16 ساعة ويهز في 50 دورة في الدقيقة ( الشكل 3F ).
    1. فحص لوحة لب رصدت من الخطوة 4.7.1. بعد حضانة 12 و 28 ساعة للتحقق من عقم الدبابات. إذا كان هناك أي تلوث، لا تستخدم خزان مرقمة المقابلة (تلقيح مع البكتيريا) لمزيد من المقايسات المصب.
  9. إذا رغبت في ذلك، ومراقبة نمو A. توميفاسيانز على فترات منتظمة عن طريق إزالة عينة من المتوسطة من الخزان وقياس أود 600 باستخدام مطياف مع المتوسطة من السيطرة غير الملقحة كما فارغة ( الشكل 4 ).
    لاتي: أعراض المرض النباتي يجب أن يكون واضحا بعد 7 د ( الشكل 5 ).
  10. جذور A. ثاليانا منفصلة من تعليق البكتيرية عن طريق رفع لوحة شبكة. فإن توقيت هذه الخطوة يعتمد على عمليات المصب. راجع الخطوات من 5 إلى 8 للحصول على التفاصيل.
  11. إذا استخدمت جذور لتحليلات لاحقة، شطف بسرعة الجذور في الماء المقطر المزدوج. إذا كنت تستخدم ورقة أو غيرها من الأنسجة، وقطع الأنسجة. لتحليل الحمض النووي الريبي، انتقل فورا إلى الخطوة 7.1.

الشكل 4
الشكل 4: نمو الجراثيم في نظام الزراعة المائية. تم رصد نمو الجراثيم في وجود أو غياب المضيف النبات ( أرابيدوبسيس ) كل 4 ساعات. تم زراعة الخلايا الجراثيم في أب المتوسطة O / N، وغسلها 3X مع كلوريد الصوديوم 0.85٪، وتلقيح في نظام الزراعة المائية، مع أو ثإيثوت أرابيدوبسيس شارك في زراعة، من أود الأولي 600 من حوالي 0.1. القيم أود 600 هي وسيلة من ثلاث مكررات بيولوجية، مع الانحرافات المعيارية ( أود 600 من 1.0 = 1 × 10 9 خلية / مل).

الشكل 5
الشكل 5: النماذج النمطية النباتية ممثل والأعراض مرض ملحوظ أثناء كوكولتيفاتيون. في غضون 4 د بعد التلقيح، لا تظهر أعراض المرض ( A ) بالمقارنة مع النباتات نونينوكولاتد ( B ). بعد 7 د من كوكولتيفاتيون (العدوى)، لوحظت أعراض المرض في النباتات المصابة ( C )، في حين تبقى النباتات غير الملقحة صحية ( D ).

5. مضان المجهري

  1. استخدام A. توميفاسيانز تؤوي بناء مراسل لبروتين أوتوفلورسنت لالإعداد كوكولتيفاتيون في الخطوة 4.5 .
    ملاحظة: يتم تعديل PJP2 البلازميد تعبير بهيري، مشتق من دسرد 36 ، هنا.
  2. بعد زراعة مناسبة مناسبة (على سبيل المثال، 48 ساعة) في الخطوة 4.8، منفصلة الجذور الثانوية الفردية (فروع جانبية من الجذر الرئيسي) باستخدام مقص العقيمة.
  3. شطف الجذور في الماء المقطر المزدوج لإزالة المواد فضفاضة ملزمة. تغمر كل جذر في 30 ميكرولتر من الماء على شريحة المجهر وتغطي مع ساترة الزجاج.
  4. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر لمنع الجفاف من الجذور.
  5. تصور مرفق A. المهدئات إلى A. جذور ثاليانا بواسطة المجهر مضان.
    ملاحظة: هنا، يتم استخدام المجهر متحد البؤر مع الإثارة من الهيليوم النيون (هي-ن) 543/594 نانومتر ليزر لتصور بيشري الأحمر مضان في 590-630 نانومتر تحت مقلوب 63X هدف عدسة المياه مع فتحة عددية من 1.4 (

الشكل 6
الشكل 6: أغروباكتريوم الجذر مرفق، يحددها المجهر متحد البؤر. وتصور لالأجرعية المسمى مضان pCherry الحمراء في 590-630 نانومتر، مع الإثارة من الهليوم نيون (وني) 543/594 نانومتر ليزر. تم إجراء التصور تحت مقلوب الهدف عدسة المياه 63X مع فتحة عددية من 1.4. مقياس الحانات = 11 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. البكتيرية تحليلات النص

  1. بعد زراعة مشتركة مناسبة (على سبيل المثال، 8 ح) في الخطوة 4.8، فصل الجذور من المتوسطة المائية كما هو الحال في الخطوة 4.9. نقل 1.5 مل من المتوسطة المائية إلى 1.5 مل الدقيقةأنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة لتكوير الخلايا.
  2. إزالة طاف. نقل آخر 1.5 مل من الوسط المائية إلى نفس أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 12،000 غرام لمدة 2 دقيقة لتكوير الخلايا.
  3. إزالة طاف.
    ملاحظة: يمكن أن يكون البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق تجميد العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا A. توميفاسيانز باستخدام أساليب قياسية 37 أو مناسبة رنا التجاري وعزل مجموعة تنقية مع العلاج الدناز لتجنب التلوث الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن أن يكون البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق تجميد أليكوتس من الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  5. استخدام الحمض النووي الريبي معزولة لمجموعة متنوعة من التحليلات باستخدام الطرق القياسية، بما في ذلك ما يلي.
    1. استخدام ميكروأري التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكشف عن مجموعات الجينات التي تم التعبير عنها تفاضليا في كوكولتيفاتد مقابل السيطرةحضاره.
    2. استخدام الكمية في الوقت الحقيقي البلمرة سلسلة رد الفعل (كرت-ير) للكشف عن التعبير عن جينات محددة أو للتحقق من صحة البيانات ميكروأري 38 .

7. تحاليل نص النبات

  1. بعد زراعة مناسبة (على سبيل المثال، 8 ح) في الخطوة 4.8، فصل الجذور من وسط الزراعة المائية، كما هو الحال في الخطوة 4.9، أو منفصلة الأنسجة الأخرى حسب الحاجة. وضع على الفور ما يقرب من 150 ملغ من الجذور أو الأنسجة النباتية الأخرى في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يمكن أن يكون البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق تجميد العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. طحن العينات المجمدة إلى مسحوق في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي من مسحوق باستخدام الطرق القياسية 39 أو مناسبة رنا التجاري وعزل مجموعة تنقية مع العلاج الدناز لتجنب تلوث الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن أن يكون البروتوكول مؤقتا هنا عن طريق تجميد أليكوتس من الحمض النووي الريبي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. استخدام الحمض النووي الريبي معزولة لمجموعة متنوعة من التحليلات باستخدام الطرق القياسية، بما في ذلك ما يلي.
    1. استخدام ميكروأري التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة للكشف عن مجموعات الجينات التي تم التعبير عنها تفاضليا في النباتات المزروعة المشترك مقابل السيطرة.
    2. استخدام كرت-ير للكشف عن التعبير التفاضلي للجينات محددة أو للتحقق من صحة البيانات ميكروأري 38 .

8. التنميط السريوم

  1. بعد زراعة مشتركة مناسبة (على سبيل المثال، 72 ساعة) في الخطوة 4.8، فصل الجذور من المتوسطة المائية كما في الخطوة 4.9. تعقيم 18 مل من المتوسطة المائية عن طريق تمريرها من خلال مرشح ميكرون 0.2 ميكرون إلى 50 مل أنابيب مخروطية.
  2. تجميد العينات في -80 ° كو / N.
  3. تخفيف قبعات على 50 مل أنابيب مخروطية ووضعها في آلة التجفيف لمدة 36 ساعة. المضي قدما لتخزين أو معالجة العينات (كما ديسكريبد أدناه) لتحليل هبلك وكشف مركب.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.
  4. ريسوسبيند كل عينة في 5 مل من الماء المقطر المزدوج في أنبوب اختبار قابل للاشتعال.
  5. إضافة 5 مل من خلات الإيثيل وخلط عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
  6. السماح للمراحل للفصل في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  7. نقل الجزء العلوي (المرحلة العضوية) إلى حاوية جديدة عن طريق بيبتينغ. إذا لزم الأمر، تجمع الكسور العضوية متعددة.
  8. الجاف تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين (~ 45 دقيقة).
  9. إعادة تعليق العينة في حل مناسب ل هبلك (على سبيل المثال، 100٪ الميثانول).
  10. أداء هبلك وفقا للأساليب القياسية 40 .
  11. كشف المركبات بالوسائل المناسبة.
    ملاحظة: إليكتروسبراي التأين الوقت من الطيران الطيف الكتلي (إيسي-توف-مس) 40 يستخدم هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النمو في الزراعة المشتركة شارك في زراعة النظام

أظهر منحنى النمو ل A. توميفاسيونس C58 مرحلة تأخر كبيرة في 16 ساعة الأولي من زراعة النباتات، تليها نمو مستقر جدا عندما تزرع مع A. ثاليانا كول -0 ، تصل إلى حد أقصى أود 600 من حوالي 0.9 بدءا من 48 ساعة بعد التلقيح. على النقيض من ذلك، في الأساس لم يلاحظ أي نمو البكتيريا في ثقافة السيطرة دون A. ثاليانا ( الشكل 4 ). وتشير هذه النتائج إلى أنه بدون إضافة مواد مغذية إضافية بشكل مصطنع، فإن المركبات الكيميائية التي تفرز جذور النباتات قادرة على دعم نمو الجراثيم في نظام الزراعة المائية المائية (كوكولتيفاتيون سيستيم). يمكن أن تعزى مرحلة تأخر كبيرة خلال 16 ساعة الأولي من كوكولتفاتيون إلى الإدراك المضيف معقدة نوعا ما وإفراز الجذر التدريجي على زراعة النباتات مع الممرض. < / P>

لم تظهر نباتات A. ثاليانا أي أعراض المرض خلال الأيام الثلاثة الأولى، نسبة إلى النباتات السيطرة نمت في غياب A. توميفاسينس ( الشكل 5A ، 5B ). ومع ذلك، بعد 5 أيام من تربية النبات، أصبحت الخلافات تدريجيا مرئية وكانت محطات التحكم المعالجة وهمية أكثر اخضرارا وأكثر صحة. بعد 7 أيام من استنبات مشترك مع الأجرعية، وأظهرت الأنسجة النباتية الاخضرار ونخر، وكذلك المزهرة في وقت مبكر (الشكل 5 ج، 5 د). المزهرة في وقت مبكر في أرابيدوبسيس هو نتيجة عامة للعدوى من قبل مجموعة من مسببات الأمراض متفاوتة فلوجينيتيكالي 41 ، 42 .

التصور المجهري للمرفق الجراثيم لجذور النباتات

= "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> بعد 48 ساعة من زراعة الكوكتيل، تم توطين A. توميفاسيانز المسمى مع مضان أحمر بسيري إلى بنية الجذر النباتية مع شكل نموذجي مثل قضيب أو خيطي، 0.5 ميكرون في العرض و 3-5 ميكرون في الطول ( الشكل 6 ). معظم الخلايا البكتيرية تعلق عموديا على سطح جدار الخلية الجذرية، وفقا للنتائج السابقة أن الجراثيم ربط جدار الخلية في الأزياء القطبية 32 .

وتشير هذه النتائج إلى أن نظام الزراعة المائية كوكولتفاتيون يمكن استخدامها لدراسة الديناميات البكتيرية في بلانتا ، مثل مرفق لهيكل الجذر وعملية العدوى، في الوقت الحقيقي. في الواقع، في غياب الميكروبات الأخرى، ويوفر هذا النظام كوكولتيفاتيون منصة خالية من الضوضاء لمراقبة مباشرة من مرفق البكتيريا النبات في بلانتا . تفعيل النصوص الجرثومية الفوعة

بعد 8 ساعات من زراعة النباتات، تم تحصين A. الخلايا المورمة لعزل الحمض النووي الريبي، وتم تقييم مستويات النسخ من الجينات الفوعة ممثل بواسطة كرت-ير ( الشكل 7 ). تم التعبير عن الجينات الفوعة روب، فيرا، virD1، virH1، VirE0 ، و تشفغ أوبريغولاتد بشكل ملحوظ خلال شارك في زراعة مع المضيف النبات، بالمقارنة مع السيطرة دون A. ثاليانا . على وجه التحديد، وفرة من مرنا بنسبة 100٪ ل تشفغ ، بنسبة 70٪ ل VerD1 ، بنسبة 94٪ ل فيرا ، بنسبة 40٪ ل VirE0 ، بنسبة 330٪ ل روب ، و 48٪ ل VirH1 .

هذه النتائج تشير إلى أنه، دون سوبليمنتاتيون مع المواد الكيميائية الاصطناعية الفوعة التي تسببها، والنباتات إفراز المواد الكيميائية في نظام كوكولتفاتيون المائية قادرة على تفعيل البرمجة الفوعة الجراثيم . تحريض الجينات الفوعة الأجرعية يدل على استجابة Agrobacteria إلى إشارات النبات مستمدة في نظام استنبات مشترك المائية. ومن المثير للاهتمام جدا أن أغروباكتريوم روب و تشفغ هي المستحثة على كوكولتيفاتيون مع أرابيدوبسيس، كما أشارت الدراسات السابقة أن هذه الجينات هي التي يسببها الظروف الحمضية 18 ، ولكن ليس من قبل أسيتوسيرينغون، وهو مركب يحفز الفوعة المعروفة 19 . هذه النتيجة تشير إلى أن مركبات مجهولة الهوية من جذور أرابيدوبسيس قادرة على إحداث روب و تشفغ التعبير. ومع ذلك، يجب تحديد المزيد من المواد الكيميائية المحرضة الفوعة.

الشكل 7 الشكل 7. تفعيل الجراثيم الفوعة في نظام الزراعة المائية. تم قياس مستويات مرنا من ستة عوامل فوعة الجراثيم كميا عن طريق كرت-ير. تم تطبيع وفرة من النصوص عامل الفوعة إلى أن من 16S الرنا الريباسي النصوص. تمثل البيانات وسائل ± الانحراف المعياري (أشرطة الخطأ) من 3 مكررات بيولوجية، مع P- القيم التي تم الحصول عليها من قبل تي اختبار الطالب.

التعبير عن النصوص النباتية

تم إجراء تحليل كرت-ير لخمسة جينات تم عرضها سابقا على أنها تفاضلية في A. ثاليانا (بيانات غير منشورة). كما هو متوقع، أكد كرت-ير أن أغب 30 (AT2G33790) و ناس 1 (AT5G04950) كانت دونريغولاتد (بنسبة 97 و 89٪ على التوالي) في حين هسب21 (AT4G27670) و ببيب 1 (AT5G06860) و إيب 1 (AT3G22840) تم تنظيمها (بمقدار 3،800 و 540 و 510٪ على التوالي) في كل من المكررين الثلاثة مقابل عناصر التحكم ( الشكل 8 ).

الشكل 8
الشكل 8: كرت-ير من A. ثاليانا الجذور النصوص. تم تطبيع وفرة كل نسخة مرنا إلى أن من أكتين إي النصوص. البيانات هي متوسطات من 3 مكررات بيولوجية ± الانحراف المعياري (أشرطة الخطأ)، مع P- القيم التي تم الحصول عليها من قبل تي اختبار الطالب.

التعديلات لاستضافة ملامح إفراز

وقد تبين أن المركبات المشتقة من الجذر تختلف إلى حد كبير بين الأنواع النباتية 6 ، 8 . رووتشمل الإفرازات أوت الإشارات الجزيئية التي تثير ردود مختلفة الإشارات خلال التفاعلات ميكروب النبات 1 ، 43 . ومع ذلك، الاختلافات التقدمية في ملامح إفراز المضيف مع مرور الوقت بعد التفاعل الميكروب هي أقل بكثير فهم، إلا أن المركبات التي أفرز الجذر هي حتمية لجذب البكتيريا المفيدة 29 . بعد 72 ساعة من زراعة النباتات مع A. المهدئات C58، تم إنشاء الاختلافات في A. ثاليانا كول-0 سكريتوم ملامح باستخدام وضع أيون إيجابي لك-مس تحليل ومقارنات إلى غير الملقحة A. ثاليانا كول -0 ( أي في غياب أغروباكتريوم ). وقد لوحظ تحول واضح في سكروم، مع ظهور مركبات جديدة نتيجة التلقيح الجراثيم ( الشكل 9 ). وإجمالا، تم تعزيزها 35 مركبات نسبيا في secretome خطة -inoculated الأجرعيةتيسي، في حين تم تعزيز 76 في سكروم من النباتات نونينوكولاتد ( الشكل 9 ). وهذا الأخير يمثل على الأرجح المركبات التي سوف A. المكورات C58 تواجه قبل الإصابة. على الرغم من أن هذه المركبات لم يتم تحديدها، والإفراز التفاضلي لمركبات محددة الجذر المشتقة لم يتم تحديدها في سياق هذه الدراسة، أظهر تحليل سيكريتوم الاختلافات كشفها في ملامح إفراز المضيف باستخدام هذا النظام كوكولتفاتيون المائية.

الشكل 9
الشكل 9: A. ثاليانا كول-0 تحليل الجذر سكريتوم. وقد تم الانتهاء من تحليل A. ثاليانا كول-0 سكريتم ملامح في ثلاث نسخ لعينات وهمية تلقيح وملقحة. تم حساب متوسط ​​مناطق الذروة ل 138 إشارة كتلة فريدة (مركبات) وجدت في ملامح إفراز في كل مجموعة علاج، وتم استخدام متوسط ​​القيم لحساب الفرق في وفرة كل مركب (ناقص التطعيم وهمية تلقيح) من أجل تصور الاختلافات في المركبات القابلة للاكتشاف. وكانت المركبات ذات القيم الفارق السلبي الكبير أكثر وفرة في سكروم للنباتات الملقحة، في حين أن تلك التي لديها اختلافات إيجابية كبيرة كانت أكثر وفرة في سكروم من النباتات وهمية تلقيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وبالنظر إلى الطبيعة التدريجية لإفراز الجذور، فإن تركيز المواد الكيميائية المحرضة للفوعة المنتجة في النباتات وتأثيراتها على التفاعلات الديناميكية بين النبات والميكروب تحدث في التدرجات المكانية والزمانية. في هذا النظام المشترك للزراعة المائية، لا يستكمل أي هرمون نباتي كيميائي أو كيميائي يحفز الفوعة الميكروبية أو الدفاعات النباتية. في المقابل، باستخدام النهج التقليدية، وإضافة المواد الكيميائية الاصطناعية، مثل أسيتوسيرينغون، ويخلق ارتفاع مفاجئ، الاصطناعي في تركيزات. ولذلك، فإن هذا النظام كوكولتفاتيون المائية يحاكي عن كثب البيئة الطبيعية، حيث الميكروبات والنباتات المضيفة تعترف والاستجابة في الأخلاق المكانية والزمانية.

هنا، كان من الممكن إثبات أن الجراثيم الفوعة الجينات تم تفعيلها على شارك في زراعة مع أرابيدوبسيس . وهذا يشير إلى أن المواد الكيميائية المشتقة من النباتات الطبيعية تحفز الفوعة الجرثومية . المستقبل eففورت هناك حاجة لتحديد هذه المواد الكيميائية والتحقق مما إذا كان أو لم يكن أسيتوسيرينغون المحرض الفوعة هو من بينها. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت تغييرات كبيرة في التعبير الجيني نبات الأرابيدوبسيس الجذر وملامح secretome على استنبات مشترك مع الأجرعية، مما يدل على إمكانات نظام استنبات مشترك المائية لدراسة استجابات المضيف النباتية والتشكيلات إفراز خلال التفاعلات مصنع للميكروب. في الواقع، وذلك باستخدام تقنية الزراعة كوكولتيفاتيون، والتعبير الجيني وملامح سكروموم من المضيفين النبات يمكن دراستها في أي مرحلة تؤدي إلى وبعد التفاعل الميكروبي، والتي سوف تساعد على توضيح كيف يمكن لهذه التغييرات النسخي أو سيكريوم تسهيل أو ردع لاحق التفاعلات مصنع الميكروب .

بالإضافة إلى دراسة نبات الأرابيدوبسيس - إشارات الأجرعية، ونظام استنبات مشترك المائية يمكن تكييفها لدراسة النظم النباتية للميكروب الهامة الأخرى. ويمكن استخدامه لوتوضيح الاستجابات النباتية لمجموعة واسعة من الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض أو المفيدة، تعمل بشكل فردي أو جماعي، ودراسة مرفق الميكروبية والاستجابات لمختلف المضيفين النبات في ظروف "طبيعية" نسبيا. الحفاظ على التشكل نموذجي الشتلات مهم لتوضيح التفاعلات الجزيئية النباتية-ميكروب. في حالة البكتيريا الأخرى، الفطريات، أو مسببات الأمراض العاشبة، يمكن أن تكمل المواد الغذائية الإضافية لدعم النمو الميكروبي خلال زراعة النباتات.

ومع ذلك، هناك عدد قليل من المعلمات للنظر في كوكولتيفاتينغ مع مختلف نظم الميكروب النبات. اعتمادا على حجم البذور وتشكل الجذور، شبكة معدنية مع ثقوب أكبر وحاوية نمو أكبر قد تكون مطلوبة لبذور أكبر وشتلات لضمان أن الهياكل الجذرية تتطور بشكل كامل تحت سطح شبكة وأن الأنسجة تبادل لاطلاق النار تتكاثر أعلاه. قد تحتاج أيضا إلى تغيير الإعداد ليشمل منصة أعلى. ويمكن تحقيق ذلك بy قطع مربع أكبر من شبكة والانحناء من مزيد من الزوايا، لرفع سطح شبكة أعلى من الجزء السفلي من الحاوية، أو عن طريق قطع شبكة في شكل الصليب اليوناني والانحناء كل رفرف في المسافات البادئة. وبطبيعة الحال، هناك قيود على كل نظام، ولن يكون من المفيد هنا تقديمه للنباتات الكبيرة التي تزرع لفترات أطول ( مثل الذرة الناضجة). وعلاوة على ذلك، قد تتطلب بعض الكائنات أكثر تهوية مما يوفره الهز عند استخدام هذا النظام.

ومن المسلم به أنه من الصعب جدا أو حتى من المستحيل تصميم نظام في المختبر الذي يكرر تماما وبشكل كامل التفاعلات الديناميكية بين النبات والميكروب التي تحدث في الطبيعة. على الرغم من أن كوكولتفاتيون المائية تمثل عن كثب الظروف الطبيعية في ريزوزفير، على الأقل من الناحية المفاهيمية، مع هياكل الجذر سليمة ومورفولوجيا النبات، لا توجد التربة أو التربة الكائنات الحية الدقيقة في النظام. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا النظاملتلبية الاحتياجات المختلفة، مثل دراسة الميكروبات في بيئة يمكن السيطرة عليها ومعرفة كيفية تصور النباتات أو الميكروبات والاستجابة لمختلف المحفزات الحيوية أو اللاأحيائية. ويمكن أيضا أن يساعد نظام الزراعة المائية هذا على فهم الكائنات المجهرية ووظائفها في الزراعة المائية أو النظم الإيكولوجية. وهذا مهم جدا لإدارة الأمراض وصحة النبات في صناعة الدفيئة المائية أو البيئة المائية للنباتات والميكروبات.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا النظام كوكولتفاتيون المائية لدراسة العلاج البيولوجي وتوضيح عمليات التمثيل الغذائي ذات الصلة والمسارات التنظيمية في الميكروبات أو النباتات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النظام كولوتيفاتيون المائية يسهل التحقيق على آثار ما قبل موجودة (أليلوشيميكالز) و / أو تطبيق (الاصطناعية) المغذيات والإشارات الكيميائية / المركبات على الميكروبات أو النباتات المضيفين 44 . توافر تأثير غير مباشر على الأنسجة النباتية ( أي0؛ ورقة، واطلاق النار) في نظام كوكولتفاتيون المائية يوفر الفرصة لاستكشاف العمليات الدفاعية النباتية الأخرى، مثل فتيلة النبات، وكيف يتم ترانسدوسد هذه الإشارات.

الجزء الأكثر أهمية من هذا النظام المشترك للزراعة هو منع التلوث. على وجه الخصوص، يجب أن يتم نقل النباتات من المتوسطة شبه الصلبة في الخزان بعناية فائقة لمنع تلوث الوسط الهيدروجيني. ولذلك فمن الضروري لهذه الخطوة التجريبية التي يتعين تنفيذها في ظل ظروف معقمة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية، ويجب على المجربين الانتظار 2-3 أيام بعد نقل قبل تلقيح أي الكائنات الحية الدقيقة للتجربة.

وباختصار، فإن نظام كوكولتفاتيون المائية يحسن القيود المختلفة من النهج التقليدية من خلال الحفاظ على التشكل النباتي نموذجي وسلامة هياكل الجذور النباتية في جميع مراحل العملية التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النظام يتجنب التكميليةعلى المواد الكيميائية الاصطناعية، مثل هرمونات النبات أو المواد الكيميائية الحاملة للدفاع / الفوعة. وهكذا، فإنه يحاكي عن كثب البيئة الطبيعية، حيث الميكروبات والنباتات المضيفة تعترف وتستجيب في الأخلاق المكانية والزمانية. هذا النظام كوكولتيفاتيون يمكن تكييفها لدراسة مختلف أنظمة الميكروب النبات في أكثر "طبيعية" وظروف يمكن التحكم فيها، بما في ذلك مع الميكروبات إندوفيتيك أو إبيفيتيك. ويمكن دراسة جوانب مختلفة من التفاعلات في بلانتا ، مثل المرضية، والتعايش، أو تعزيز نمو النبات. يمكن للنظام كوكولتفاتيون المائية تقديم رؤى جديدة في الاستجابات الفسيولوجية والكيميائية الحيوية والجزيئية من كل من النباتات والميكروبات. في أي وقت معين / فاصل زمني أو مرحلة النمو، يمكن أن تكون عينات البكتيريا أو النباتات التي تنمو في النظام كوكولتفاتيون المائية على حدة لمختلف تحليلات "أوميكس"، بما في ذلك النباتات والميكروبات ترانسكريبتوميكس، النبات والميكروبات الميتاتولوميك، النبات والميكروبات سكريتم، و بيوريمدياتيعلى. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا النظام المشترك للزراعة المائية لدراسة التفاعلات بين المضيفين النبات والميكروبيوم في بيئة يمكن السيطرة عليها. وباختصار، فإن مزايا زراعة كوكولتفاتيون المائية تمثل نظام متفوق للكشف عن التفاعل الجزيئي النبات والميكروب والتشوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نود أن نشكر براين ويسيلوسكي والكسندر إيستمان لمساعدتهم ومناقشة مفيدة. ونود أيضا أن نشكر الدكتور. يوجين دبليو نستر، لينغروي تشانغ، هايتاو شين، يوهاي تسوى، وجريج ثورن على مساعدتهم، مناقشات مفيدة، والقراءة النقدية للمخطوطة. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الزراعة و أغري-فود كانادا و غروينغ فوروارد-أغريفلكس (ربي رقم 2555) و غروينغ فوروارد إي بروجيكت نومبر 1670، التي أجراها المؤلفون كجزء من واجباتهم. كما تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا (نزيرك) منحة اكتشاف ربين-2015-06052 منحت ل زك يوان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) Arabidopsis Biological Resource Centre CS7000 https://abrc.osu.edu/order-stocks
bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) University of Washington N/A
labeled bacteria in-house optional, depends on downstream analyses
vortex (various)
microcentrifuge tubes (various)
microcentrifuge (various)
5% sodium hypochlorite (various)
double distilled water (various)
autoclave (various)
micropipette  (various)
70% ethanol (various)
Murashige and Skoog (MS) basal salts Sigma-Aldrich M5524
sucrose (various)
MES (various)
B5 vitamin mix Sigma-Aldrich G1019
phytoagar (various)
Deep Petri dishes (various)
stainless steel mesh Ferrier Wire Goods Company Ltd N/A grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01
micropore tape, 1" 3M 1530-1
diurnal growth chamber (various)
cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm  Pyrex 3250 other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment
flow hood (various)
forcepts (various)
yeast extract (various)
tryptone (various)
MgSO4 (various)
shaking incubator (various)
spectrophotometer (various)
NaCl (various)
shaker (various)
scissors (various) optional, depends on downstream analyses
fluorescence microscope (various) optional, depends on downstream analyses
microscope slides and cover slips (various) optional, depends on downstream analyses
nail polish (various) optional, depends on downstream analyses
Bacterial RNA extraction kit (various) optional, depends on downstream analyses
plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) Qiagen 74903 or 74904 optional, depends on downstream analyses
material and equipment for qRT-PCR (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for microarray analysis (various) optional, depends on downstream analyses
liquid nitrogen (various) optional, depends on downstream analyses
mortar and pestle (various) optional, depends on downstream analyses
0.2 µm pore filter (various) optional, depends on downstream analyses
50 mL conical tubes (various) optional, depends on downstream analyses
freeze dryer (various) optional, depends on downstream analyses
sealable test tubes (various) optional, depends on downstream analyses
ethyl acetate (various) optional, depends on downstream analyses
nitrogen gas (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for HPLC (various) optional, depends on downstream analyses
material and equipment for ESI-TOF-MS (various) optional, depends on downstream analyses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
  2. Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
  3. Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
  4. Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
  5. Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
  6. Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
  7. Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
  8. Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
  9. Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
  10. Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
  11. Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
  12. Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
  13. Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
  14. Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
  15. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  16. Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
  17. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
  18. Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
  19. Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
  20. Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
  21. Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
  22. Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
  23. Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
  24. Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
  25. Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
  26. León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
  27. Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
  28. Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
  29. Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
  30. Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
  31. Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
  32. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
  33. Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
  34. Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
  35. Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
  36. Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  37. Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
  38. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  39. Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
  40. Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
  41. Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
  42. Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
  43. Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
  44. Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).

Tags

البيولوجيا الجزيئية، العدد 125، التفاعل الجزيئي النبات الميكروبي،
نظام الزراعة المائية المشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية النباتية / الميكروبية والتشوير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nathoo, N., Bernards, M. A.,… More

Nathoo, N., Bernards, M. A., MacDonald, J., Yuan, Z. C. A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling. J. Vis. Exp. (125), e55955, doi:10.3791/55955 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter