Summary
記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。
Abstract
自然な植物 - 微生物相互作用を模倣する実験デザインは、複雑な植物 - 微生物シグナル伝達プロセスを描写するために非常に重要である。 シロイヌナズナ - アグロバクテリウム・ツメファシエンス 細菌の病原性および植物相互作用を研究するための優れたモデルシステムを提供します。植物 - アグロバクテリウム相互作用の以前の研究は、植物細胞浮遊培養、植物の人工的創傷、または合成化学物質による微生物毒性因子または植物防御の人為的誘発に大きく依存していた。しかし、これらの方法は、植物および微生物が空間的および時間的な仕方で認識し応答する、植物の天然シグナル伝達とは異なる。この研究は、インタクトな植物が金属メッシュスクリーンによって支持され、 アグロバクテリウムと共培養された水耕共培養系を提示する。この共存系において、micrを誘導する合成植物ホルモンまたは化学物質は存在しない陰茎毒性または植物防御が補われる。水耕性共培養系は、植物の微生物との自然な相互作用および植物のシグナル伝達ホメオスタシスに非常に類似している。植物根は、 アグロバクテリウムを含む培地から分離することができ、植物宿主および相互作用する微生物の両方のシグナル伝達および応答を同時にかつ系統的に調べることができる。任意の時点/間隔で、植物組織または細菌を様々な「オミックス」分析のために別々に収穫することができ、このシステムの効力および効力を実証する。水耕共培養系は、1）多様な植物微生物系の相反するシグナル伝達、2）植物宿主と複数の微生物種（ すなわち微生物のコンソーシアムまたは微生物）との間のシグナル伝達、3）栄養素および化学物質の関与方法植物微生物シグナル伝達における微生物、および4）微生物が植物宿主とどのように相互作用し、生物的Oに対する植物耐性に寄与するかr非生物的ストレス。
Introduction
植物関連微生物は、生物地球化学サイクル、バイオレメディエーション、気候変動の緩和、植物の成長と健康、生物的および非生物的ストレスに対する植物耐性において重要な役割を果たす。微生物は直接植物細胞壁の接触を介して間接的に化学分泌を介して1、2、3シグナリングの両方の植物と相互作用します。固着生物として、植物は病原体による感染に抵抗する直接的および間接的メカニズムを開発してきた。間接的な防御は、二次植物代謝物の生産と病原体4,5の侵入に対する拮抗生物の魅力を含むのに対し、直接防御は、構造的な防御および防御タンパク質の発現を含みます。植物由来の滲出液、分泌物、粘液、ムシゲル、および溶解物は、根圏の物理化学的特性を変化させて誘引または反発する宿主に向かって微生物6 。根分泌物の化学組成は種特異的であり、それによって、そのような化合物を認識することができる特定の微生物が根圏6で繁殖することを可能にする選択的フィルターとして役立つ。したがって、適合性の微生物種は、植物宿主1の有益性または有害性のいずれかに、それらの関連性を活性化および強化するように刺激され得る。
微生物および化学的暴露の大部分は、ルート構造と土壌エアインタフェース2、6、7、8で起こるからである。根圏における理解植物微生物相互作用は、植物生産性と生態系の機能を強化するための鍵でありますしかしながら、地下の植物 - 微生物相互作用および相反応答の試験は、その興味深いことに複雑かつ動的な性質、および厳密に制御可能な増殖条件下での天然根構造および植物形態を有する適切な実験モデルの欠如を含む。最も頻繁に研究植物病原の一つとして、 アグロバクテリウムは桜、リンゴ、ナシ、ブドウなどの農園芸重要性を持つ植物の広い範囲に感染し、9ローズ 。 アグロバクテリウムは理解植物-病原体相互作用のための重要なモデル生物であり、植物の形質転換および植物工学10、11、12、13、14における強力なツールです。
分子は、 アグロバクテリウムの相互作用が十分に数十年にわたって研究されている、およびアグロバクテリウム病原性の現在の理解は9広範であるプラント-F "> 11、15、16。 アグロバクテリウムの病原性は、主に17を感知する、植物由来の信号を感知その毒性プログラムおよび細胞間通信の細かい調節をもたらす、いわゆる定足数のその進化能力に起因する。ザアグロバクテリウムの病原性プログラムは根圏で利用可能ないくつかの信号によって調節され、2成分系、は、chvg / Iシステムとビラ/ Gシステムの2つのセットを含むている。根圏における酸性条件は、 は、chvg / I、 ビラ/ Gの転写を活性化します、およびvirE0 、 virE1 、 virH1 、 virH2 、およびVI型分泌系（T6SS） 18の遺伝子を含むアグロバクテリウムの病原性に関与するいくつかの他の遺伝子が含まれる。アセトシリンゴン（4'-ヒドロキシ-3 '、5 ' - ジメトキシアセトフェノン）、Vリン酸化シグナル伝達機構によるirA / G二成分系19 。その後、VirA / Gはvirレギュロン全体を活性化し、その結果、腫瘍誘導性（Ti）プラスミドからトランスファーDNA（T-DNA）と呼ばれる約20kbのバクテリアDNA断片を植物核16に移入して組み込む。 T-DNAは、植物ホルモンインドール-3-酢酸（IAA）（ iaaMおよびiaaH ）およびサイトカイニン（ ipt ）の合成に関与する遺伝子を保有し、一旦植物細胞で発現すると、これらの植物ホルモンが大量に産生される。これは、植物9、11、20のために慢性および復活問題であるクラウンゴール病として知られる異常な組織増殖および植物腫瘍発達、もたらします。 IAAは、 アグロバクテリウムビルレンスを抑制するために、またはアグロバクテリウムを減少させるために、サリチル酸およびγ-アミノ酪酸と一緒に作用する m個のクオラムセンシング（QS）17、21、22。この抑制に対抗するために、T-DNAはまた、 アグロバクテリウムの病原性を促進するために、 アグロバクテリウムクオラムセンシングを活性化し、病原体22,23のための栄養源となるオピンの生合成のための遺伝子を運びます。
アグロバクテリウム -プラント相互作用の全体的な深い理解と、植物宿主への得られたT-DNA転移にもかかわらず、相互作用の初期段階での複雑なシグナル伝達事象はあまり理解されていない。これは、部分的に、 アグロバクテリウム -植物シグナル伝達を調べるための従来のアプローチの限界に起因する。植物細胞懸濁液培養および人工部位特異的創傷は、分子植物 - 微生物相互作用を研究するために一般的に使用されている24 、。EF "> 26、27はしかし、細胞懸濁液は、一般的な植物の形態に欠け、特に、植物の懸濁細胞は、微生物の走化性および病原性28、29を活性化するために非常に重要なルート構造と根の滲出液を、持っていない植物の形態の維持。ルート構造が直接感染した植物組織30、31に誘導される植物防御関連遺伝子の検出結果として、サイト固有の感染を容易に人為的に負傷植物によって対処されてきた。しかし、人工的な創傷は、自然の中で病原体感染と大きく異なっています特に、創傷がジャスモン酸（JA）の蓄積をもたらし、天然植物のシグナル伝達と防御を全身的に妨害する26。また、合成化学物質は、人工的に植物宿主応答を誘導するために使用される26 。または病原体の病原性である。 植物体中の濃度を反映するような化学物質の補充が可能であるが、そのような補充は徐々に微生物28、32によって検知された走化性勾配を生成取り囲む根圏へ根滲出液の拡散を考慮していません。植物 - 微生物相互作用を研究する従来のアプローチの限界を考えると、得られたデータの精度と深さは妨げられ、制限され、従来のアプローチから生成された知識は植物に直接翻訳されない可能性がある。植物 - アグロバクテリウムシグナリングの多くの局面は、特に、疾患の症状がまだ発症していない初期の相互作用の段階では、完全には理解されていない。
従来のアプローチの限界を修正するために、この研究は、安価で、しっかりと制御可能で、柔軟な水耕性のc研究者が分子植物 - 微生物相互作用の初期段階で複雑なシグナル伝達経路と応答経路に深い洞察を得ることを可能にする。水耕栽培は広く植物栄養素、根の滲出液、成長条件、および植物33、34上の金属毒性の影響を研究するために使用されてきました。水耕栽培モデルには、小さな空間的要件、様々な植物組織の接近可能性、栄養素/環境条件の厳密な制御、害虫/病害の制御などのいくつかの利点があります。水耕栽培システムはまた、典型的には2〜3週間後に成長を制限する寒天/フィトアガルめっき技術と比較して、植物の生育を制限するものではない。重要なのは、全体のプラント構造物の維持管理は、微生物の走化性および病原性の誘導8、29のために必要な自然なルート分泌を促進します。システムの説明ここでのベッドは選択肢33、34よりも簡単かつ少ない労働集約的です。これは、より少ない部品を使用し、標準はさみ以外の工具を必要としません。それは、植物生長の強力な支持体としての金属メッシュ（ナイロン33とは対照的に）と、微生物増殖を助けるための振盪による無菌条件下での単純な通気方法を使用する。さらに、このシステムは、根の幅を制限することなく多様な植物種に適応する、植物成長をサポートするために様々なサイズの金属メッシュを使用することができる。
ここに提示されている水耕共培養系では、接種された細菌の増殖を支える有機化合物を植物の根が分泌する無菌水耕システムで植物を栽培する。この共培養システムでは、植物ホルモン、防御エリシター、または病原性誘導化学物質などの人工化学物質は補充されず、自然細胞を反映する植物 - 微生物相互作用中のホメオスタシスシグナル。この水耕共培養システムでは、同時に遺伝子、アグロバクテリウムによる感染時シロイヌナズナ COL-0根組織における発現、ならびにシロイヌナズナとの共培養時にアグロバクテリウム遺伝子の活性化を決定することが可能でした。このシステムは、 アグロバクテリウム （ Agrobacterium ）との同時培養（感染）の際に、植物根へのアグロバクテリウムの付着および植物根の分泌のプロファイルを研究するのに適していることがさらに実証された（ 図1 ）。
図1：サンプル分析を用いた水耕共培養系の概要。植物をメッシュの上に成長させる（メッシュの上に芽を入れる）が、水耕培地に浸漬され、その後、バクテリアfまたは共培養する。次いで、植物組織および細菌を分離して、同時に抽出および分析する。この数字は参考文献35から変更されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.実験計画
- 実験の具体的な目標を決定する。
- 以下のプロトコル全体を読んでください。特定の目標に関連するセクションと、変更が必要かどうかを判断します。例は下記を参照してください。
- A. thaliana植物とA. tumefaciens細菌、以下のような実験、または別の植物 - 微生物の組み合わせを実験で使用するかどうかを検討する。
注：さまざまな植物種を使用することができますが、植物の根の厚さは、異なるサイズのメッシュ（ステップ3.3）、および増殖パラメータ（ステップ3.10-3.11および4.4）および水耕栽培タンクサイズおよび培地容量（ステップ4.2）も調整を必要とする可能性がある（ 図2 ）。微生物は、純粋な培養物、混合種（コンソーシアム）、または環境サンプル（微生物）から簡単に接種することができますが、変更はプロトコール、特にステップ4.5に影響します。 - 考慮するサンプルを分析するために使用される実験の種類。
注：蛍光顕微鏡（ステップ5）は、蛍光レポーター構築物で標識された生物を必要とする。
- A. thaliana植物とA. tumefaciens細菌、以下のような実験、または別の植物 - 微生物の組み合わせを実験で使用するかどうかを検討する。
- 適切なコントロールを設計する。コントロールバクテリアとバクテリアを接種していないコントロール苗をタンクに接種した苗を持たない水耕液タンクを含める。
- 適切な数の種子と水耕栽培タンクを用いて実験を計画する。対照、生物学的反復（最低3回）、およびすべての分析に必要な組織の量を考慮する。
- 実験目標（ステップ4.8）の同時培養の適切な長さを決定する。
- 必要に応じて、以下の手順を改訂してください。
図2.養液栽培システムで栽培可能な他の植物の例金属メッシュの格子。様々な植物種子と栽培のための金属メッシュセットの互換性。 （A）ステンレススチールタイプ.047" ×304 weldmesh 3×3メッシュソラマメ用DIAワイヤ。（B）ステンレス鋼タイプ0.035" ×304 weldmesh 4×4メッシュゼアはメイズ用DIAワイヤ。 （C）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 4×4メッシュ0.032" × ダイコン用DIA線（DIAワイヤダイズ （ダイズ）。（D）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.047" ×冬だいこん）。 （E）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.047" × コムギ属用DIAワイヤ。（F）ステンレス鋼タイプ304 weldmesh 6×6メッシュ0.035" × キュウリのためのDIAワイヤ。この数字は参考文献35から変更されています。955fig2large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
2.植物種子表面の滅菌
- 微量遠心分離管内で500μLの脱イオン水を含むA. thalianaの約200の種子を（高速で）ボルテックスする。大きな種子の植物種については、表面の滅菌を容易にするために大きなチューブを使用してください。
- これを約9,000 xgで30秒間、卓上マイクロ遠心分離機で遠心します。ピペットを用いて水（上清）を除去する。
- 2％の次亜塩素酸ナトリウム300μLを種と渦に加える。室温で1分間放置する。より大きな種子を持つ植物種については、種を覆うためにより大きな量を使用する。
- 卓上マイクロ遠心分離機で30秒間約9,000×gで遠心分離する。ピペットを用いて次亜塩素酸ナトリウム溶液を除去する。
- 500μLの滅菌脱イオン水を種と渦に加えます。約9,000 xgの遠心分離機滅菌ピペットを使用して水を除去する。
- ステップ2.5をさらに4回繰り返します。
- 種子およびボルテックスに70％エタノール500μLを加える。室温で1分間放置する。
- 卓上マイクロ遠心分離機で30秒間約9,000×gで遠心分離する。ピペットを用いて70％エタノールを除去する。
- ステップ2.5をさらに5回繰り返します。
- 滅菌した種子を500μLの滅菌超純水に再懸濁する。
3.植物の種子発芽と半固体栽培
- 半固体のMurashige and Skoog（MS）培地を調製する：2.165g / LのMS基礎塩; 10g / Lスクロース; 0.25g / L MES;および5g / Lのフィトアガールを含む59mL / LのB5ビタミンミックス、pH5.55。
- MS培地をオートクレーブする。各滅菌深いペトリ皿（100×25 mm 2 ）に25 mLを注ぎます。
- それぞれのペトリ皿のために、90×90mm四方のステンレススチールメッシュを切り取ってください。
注： A. thalianaの推奨メッシュ< / em>はグレード304（標準グレード）、メッシュ数（線形インチ当たりの穴数）40 x 40、ワイヤー直径0.01 "（0.0254 cm）です。またはそれ以上のプラットフォーム。 - メッシュがペトリプレートの内側に収まるように、各正方形メッシュの角をちょうど曲げます。コーナーをメッシュのバルクに対して90°の角度で曲げて、コーナーでメッシュを上にして、ルート展開のために十分なスペースを残します（ 図3a ）。
- 切断されたメッシュの四角をビーカーに入れ、アルミホイルで覆い、30分間の乾式サイクルを用いてオートクレーブで滅菌する。
- 培地がペトリ皿で凝固し、メッシュが滅菌されたら、曲がったコーナーを下に向けて、滅菌メッシュの正方形を半固体培地の上に置きます。
- コーナーが媒体を貫通し、メッシュの大部分が媒体の上面に接触するようにメッシュを押す。>図3b）。
- 200μLの移送ピペットを使用して、個々の表面滅菌A. thaliana種子（種子は真空力によってピペットの先端に留まる）を作り、各種子をメッシュの上に静かに移す。実験的な必要性のために適切に間隔を置くように種を置く（ 例えば、 4 6種子/プレート）。
- ペトリプレートを蓋でシールし、多孔質の外科用テープを端に置く。
- ペトリ皿全体を暗所で2℃で4℃に置くことにより種を層別化する（ 例えば、暗色を模倣するためにはすずめんを包む）。
- ペトリ皿中の種子を22〜24℃で16時間の光周期で10〜14日間培養する（ 図3c ）。
図3：水耕植物 - 微生物共培養システム。左翼nelは、水耕栽培共生システムの組み立てと操作の6つの重要なステップを概説するフローチャートを表しています。右のパネルは、 シロイヌナズナとアグロバクテリウムの相互作用を研究する際の、水耕共培養システムの実際の実験材料、装置、および操作手順を示しています。植物または細菌のサンプリングのための接種工程および最終工程を示す。この数字は参考文献35から変更されています。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
4.水耕共培養システム
- 液体のMurashige and Skoog（MS）培地：2.165g / L MS基礎塩、10g / Lスクロース、0.25g / L MES、および59mL / L B5ビタミン混合物、pH5.75を調製する。
- 培地をオートクレーブします。各滅菌円筒ガラスまたは透明プラスチックタンクに18 mLの溶液を注ぎます（結晶化皿、100 x 80 mm2）滅菌蓋を使用してください。
注：タンクと蓋をアルミ箔で包み、オートクレーブで予備滅菌します。 - 滅菌フローフードで、滅菌鉗子を使用して、10〜14日齢の苗を各メッシュの正方形に半固体培地から水耕栽培の円筒形タンクに静かに移す（ 図3d ）。多孔質手術用テープを使用して蓋をタンクに密封する。
- タンク内のメッシュ上の苗を22-24℃、72時間、16時間の光周期で栽培し、通気用に50rpmで振盪する（ 図3e ）。
注：これは、植物が微生物による接種（共培養）前に水耕環境に適応することを可能にする。この待機期間はまた、接種前に偶発的な微生物汚染が明らかになるようにする。- インキュベーション期間の終了前日に次のステップを開始します。
- AB培地中のA.ツメファシエンスを増殖させる培養物が600℃で1.0の最終光学濃度に達するまで、28℃で一晩振盪しながら（0.5％w / v酵母抽出物、0.5％w / vトリプトン、0.5％w / vスクロース、50mM MgSO 4 、pH7.0）ブランクとして未接種のAB培地を用いて分光光度計を使用して測定した場合の、10nm（OD 600 ）である。
注：1.0のOD 600は約10 9細胞/ mLに相当する。 - A. tumefaciensを等量の0.85％NaClで3回洗浄する。同量の滅菌二重蒸留水に再懸濁する。
- 接種の前に、苗を注意深く調べて汚染がないことを確認する。汚染されていないタンク内の培地は透明で透明でなければならない。
- 濁った液体（汚染）が入っているタンクはすべて廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。各番号付きタンクから少量（20μL）の水耕培地をサンプリングし、それをLuriaブロス（LB）で満たしたペトリ皿上にスポットする。インキュベート28℃で皿。
- 直ちに、 A. tumefaciens懸濁液（OD 600から推定される約5×10 7細胞） 50μLを各番号の水耕槽に加える。 シロイヌナズナの実生およびA.ツメファシエンスを22〜24℃で16時間の光周期および50rpmで振とうして共培養する （ 図3f ）。
- ステップ4.7.1のスポットされたLBプレートを調べる。 12時間および28時間のインキュベーション後にタンクの無菌性を確認した。汚れがある場合は、さらに下流のアッセイに対応する番号付きのタンク（バクテリアを接種したもの）を使用しないでください。
- 必要に応じて、定期的にA. tumefaciensの増殖を、タンクから培地のサンプルを取り出し、非接種対照の培地を含む分光光度計を用いてブランクとしてOD 600を測定することによりモニターする（ 図4 ）。
NOTE：植物病害の症状は7日後に明らかにすべきである（ 図5 ）。 - メッシュプレートを持ち上げて細菌懸濁液からA.thalianaの根を分離する;このステップのタイミングは下流プロセスに依存する。詳細については、手順5-8を参照してください。
- その後の分析に根を使用する場合は、二重蒸留水で素早くすすいでください。葉などの組織を使用している場合は、組織を切断します。 RNA分析の場合は、直ちにステップ7.1に進んでください。
図4：水耕性共培養システムにおけるアグロバクテリウムの増殖。植物宿主（ シロイヌナズナ ）の存在下または非存在下でのアグロバクテリウムの増殖を4時間ごとにモニターした。 アグロバクテリウム細胞をAB培地O / N中で生育させ、0.85％NaClで3回洗浄し、水耕栽培システムに接種した。シロイヌナズナの共培養なしに、約0.1の初期OD 600から。 OD 600値は、3つの生物学的複製の平均であり、標準偏差（1.0のOD 600 = 1×10 9細胞/ mL）を有する。
図5：共培養中の代表的な植物の表現型および観察可能な疾患の症状。接種後4日以内に、接種されていない植物（ B ）と比較して病徴は見られない（ A ）。共感染（感染）の7日後、感染した植物（ C ）では病徴が認められ、非接種の植物は健康なままである（ D ）。
5.蛍光顕微鏡
- 自己蛍光タンパク質のためのレポーター構築物を有するA.ツメファシエンスをステップ4.5の共培養設定。
注：ここでは、dsRed 36の誘導体であるpCherryを発現する改変pJP2プラスミドを使用します。 - ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 48時間）後、滅菌はさみを用いて個々の二次根（主根の側枝）を分離する。
- 二重蒸留水で根をすすいで、ゆるく結合した物質を除去する。顕微鏡スライド上に30μLの水に各根を沈め、ガラスカバースリップで覆う。
- 根の脱水を防ぐために、カバースリップの縁をマニキュアでシールする。
- 蛍光顕微鏡によるシロイヌナズナの根にA. tumefaciensの添付ファイルを可視化します。
注：ここでは、ヘリウム - ネオン（He-Ne）543/594nmレーザーからの励起を伴う共焦点顕微鏡を使用して、開口数1.4の反転63X水レンズ対物レンズの下で590-630nmのpCherry赤色蛍光を視覚化する
図6：共焦点顕微鏡法で測定したアグロバクテリウム根の付着。 pCherry赤色蛍光標識アグロバクテリウムは、ヘリウム - ネオン（He-Ne）543/594nmレーザーからの励起で、590〜630nmで視覚化された。視覚化は、開口数1.4の逆数63X水レンズ対物レンズの下で行った。スケールバー=11μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
6.細菌転写物分析
- ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 8時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離する。 1.5mLの水耕培地を1.5mLのマイクロチューブを遠心分離し、12,000×gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。
- 上清を除去する。別の1.5mLの水耕培地を同じ1.5mL微量遠心管に移し、12,000gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。
- 上清を除去する。
注記：プロトコールは、使用するまで-80℃でサンプルを凍結させることで一時停止することができます。 - DNA汚染を避けるために、標準的な方法37またはDNase処理を伴う適切な市販のRNA単離および精製キットを使用して、 A.tumefaciens細胞からRNAを抽出する。
注記：このプロトコールは、使用するまで-80℃でRNAのアリコートを凍結することにより一時停止することができます。 - 以下のような標準的な方法を用いて、様々な分析に単離されたRNAを使用してください。
- 共培養した対照と対照とで差異的に発現する遺伝子セットを検出するために製造業者のプロトコールに従って市販のマイクロアレイを使用する文化。
- 特定の遺伝子の発現を検出するために、またはマイクロアレイデータ38を検証するために、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を使用します。
7.植物転写物分析
- ステップ4.8で適切な同時培養（ 例えば 8時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離し、または必要に応じて他の組織を分離する。直ちに約150mgの根やその他の植物組織を液体窒素に入れます。
注記：プロトコールは、使用するまで-80℃でサンプルを凍結させることで一時停止することができます。 - 凍結したサンプルを乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉末に粉砕する。
- DNA汚染を避けるために、標準的な方法39またはDNase処理を伴う適切な市販のRNA単離/精製キットを使用して、粉末からRNAを抽出する。
注：RNAの一部を凍結することでプロトコールを一時停止することができます。-80℃で使用するまで。 - 以下のような標準的な方法を用いて、様々な分析に単離されたRNAを使用してください。
- 市販のマイクロアレイを製造業者のプロトコールに従って使用して、対照植物に対して共培養されたもので差次的に発現される遺伝子セットを検出する。
- qRT-PCRを使用して、特定の遺伝子の差次的な発現を検出するか、マイクロアレイデータを検証します38 。
8.秘密のプロファイリング
- ステップ4.8で適切な共培養（ 例えば、 72時間）後、ステップ4.9のように水耕培地から根を分離する。 0.2mLの細孔フィルターを通して50mLのコニカルチューブに通すことにより、18mLの水耕培地を滅菌する。
- サンプルを-80℃CO / Nで凍結する。
- 50 mLコニカルチューブ上のキャップを緩め、凍結乾燥機に36時間置いてください。サンプルの保管または処理を続行する（desHPLC分析および化合物検出のために以下に記載する）。
注記：ここではプロトコルを一時停止することができます。 - シール可能な試験管内で、各サンプルを5mLの二重蒸留水に再懸濁する。
- 酢酸エチル5 mLを加え、チューブを数回反転させて混合する。
- 相を室温で5分間分離させる。
- 上部（有機相）をピペットで新しい容器に移す。必要に応じて、複数の有機物画分をプールする。
- 穏やかな窒素気流下で乾燥させる（約45分）。
- HPLC用の適切な溶液（ 例えば、 100％メタノール）中でサンプルを再懸濁する。
- 標準的な方法40に従ってHPLCを行う。
- 適切な手段で化合物を検出する。
注：エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析（ESI-TOF-MS） 40がここで使用されます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
水耕栽培共生システムの成長
A. tumefaciens C58の増殖曲線は、同時培養の最初の16時間で有意なラグ期を示し、 A. thaliana Col-0と共生培養したときに非常に安定した増殖、約0.9の最大OD 600まで48時間後に接種する。対照的に、本質的に細菌増殖はA. thalianaのない対照培養で観察されなかった（ 図4 ）。これらの結果は、人工的に供給される追加の栄養素がなければ、植物根を分泌する化合物が、水耕栽培共生系においてアグロバクテリウムの成長を支えることができることを示唆している。同時培養の最初の16時間の間の有意な遅延相は、病原体と共存する際のかなり複雑な宿主の知覚および徐々の根分泌に起因する可能性がある。/ p>
共培養したA. thaliana植物は、 A.tumefaciensの不在下で増殖させた対照植物と比較して、最初の3日間は病徴を示さなかった（ 図5a 、 5b ）。しかし、5日間の同時培養後、徐々に相違が見られ、模擬処理された対照植物はより緑色で健康的であった。 アグロバクテリウムによる共存培養の7日後、植物組織はクロロシスおよび壊死ならびに初期開花を示した（ 図 5c、 5d ）。 シロイヌナズナにおける早期開花は、系統発生的に異なる病原体41,42の範囲による感染の一般的な結果です。
アグロバクテリウムの植物根への微視的可視化
A.ツメファシエンスは、典型的な棒状または線状の形状を有する植物根構造に局在していた幅0.5μm、長さ3~5μmであった（ 図6 ）。 アグロバクテリウムが細胞壁に極性様式で結合するという以前の所見によれば、細菌細胞の大部分は根細胞壁の表面に垂直に付着していた32 。
これらの結果は、水耕性共培養システムが、根の構造への付着および感染プロセスなどの、プラナにおける細菌動態をリアルタイムで研究するために使用できることを示唆している。実際に、他の微生物が存在しない場合、この共培養システムは、プラナの細菌 - 植物付着を直接観察するためのノイズのないプラットフォームを提供する。 アグロバクテリウム ビルレンス転写物の 活性化
共培養の8時間後、 A.ツメファシエンス細胞をRNA単離のために採取し、代表的なビルレンス遺伝子の転写レベルをqRT-PCRによって評価した（ 図7 ）。毒性遺伝子ropB、virA、virD1、virH1、virE0 、およびchvGの発現は、 A.thalianaを含まない対照と比較して、植物宿主との共生培養の間に有意に上方制御された。具体的には、mRNAの存在量はropB 330％だけ、virE0 40％だけ、 ビラ 94％だけ、virD1 70％だけ、 は、chvg 100％増加、及びvirH1 48％です。
これらの結果は、サプリメントなしでは合成毒性誘発化学物質との組み合わせにより、水耕性共培養系における化学物質を分泌する植物は、 アグロバクテリウムビルレンスのプログラミングを活性化することができる。 アグロバクテリウム病原性遺伝子の誘導は、水耕性共共生系における植物由来シグナルに対するアグロバクテリウム応答の指標である。以前の研究は、これらの遺伝子は、アセトシリンゴン、よく知られた毒性を誘導する化合物19によって酸性条件18はなくによって誘導されることが示されているように、 アグロバクテリウムropBとは、chvgは、 シロイヌナズナとの共培養により誘導されることは非常に興味深いです。この結果は、 シロイヌナズナの根からの同定されていない化合物がropBおよびchvGの発現を誘導することができることを示唆している。しかしながら、そのような病原性誘導化学物質は、さらに同定されなければならない。
図7.水耕共培養システムにおけるアグロバクテリウム病原菌の活性化。 6つのアグロバクテリウムビルレンス因子のmRNAレベルをqRT-PCRによって定量的に測定した。豊富な毒性因子転写物は、16S rRNA転写物のそれに正規化された。データは、3つの生物学的反復の平均±標準偏差（誤差バー）を表し、 P値は生徒のt検定によって得られる。
植物転写産物の発現
以前にA.thaliana （ 示唆されていないデータ）において示差的に発現されることが示された5つの遺伝子について、qRT-PCR分析を行った。予想されるように、QRT-PCRは、AGP 30（AT2G33790）及びNAS 1（AT5G04950）はHSP一方（それぞれ、97および89％によって）ダウンレギュレートされたことが確認され対照群（ 図8 ）に対して、3つの複製物のそれぞれにおいて、21（AT4G27670）、 PGIP1 （AT5G06860）、およびELIP1 （AT3G22840）がアップレギュレートされた（それぞれ3,800,540および510％）。
図8： A. thaliana根の転写物のqRT-PCR。各mRNA転写産物の量は、 ACTIN II転写産物のそれに正規化された。データは、3回の生物学的反復±標準偏差（誤差バー）の平均であり、 P値は生徒のt検定によって得られる。
分泌プロフィールを変更するための変更
根由来の化合物は、大部分の植物種6,8間で異なることが示されています。 RoOT滲出物は、植物微生物相互作用1、43中の様々なシグナル伝達応答を誘発する分子シグナルを含みます。しかし、微生物相互作用後の経時的な宿主分泌プロファイルの進歩的な差は、根分泌化合物が有益な細菌の誘引に不可欠であることを除いて、はるかに理解されていない29 。 A.ツメファシエンス C58との同時培養の72時間後、陽イオンモードLC-MS分析および非接種A. thaliana Col-0（ すなわち アグロバクテリウムの非存在下での）との比較を用いてA.thaliana Col-0分泌プロファイルの相違を確立した）。分泌細胞の明らかなシフトが観察され、 アグロバクテリウム接種の結果として新しい化合物が現れた（ 図9 ）。 アグロバクテリウム接種計画の分泌株では、全体で35種類の化合物が比較的増強されていた非接種植物の分泌物において76が増強された（ 図9 ）。後者は、 A.ツメファシエンス C58が感染する前に遭遇するであろう化合物を表す可能性が高い。これらの化合物は同定されておらず、特定の根由来化合物の分泌の差異はこの研究の文脈では決定されなかったが、分泌分析はこの水耕共培養系を用いた宿主分泌プロフィールの検出可能な差を実証した。
図9： A. thaliana Col-0根の秘密の分析。 A. thaliana Col-0分泌プロファイルの分析は、擬似接種および接種したサンプルについて三重に完了した。各処置群の分泌プロファイルに見出された138の固有の質量シグナル（化合物）のピーク面積を平均し、検出可能な化合物の差異を視覚化するために、平均値を各化合物（模擬接種マイナス接種量）の存在量の差を計算するために使用した。大きな差異値を有する化合物は、接種植物の分泌物においてより豊富であり、大きな差異を有する化合物は、模擬接種植物の分泌物においてより豊富であった。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
根分泌の漸進的な性質を考慮すると、 プラナで生産されたビルレンス誘発化学物質の濃度および動的植物 - 微生物相互作用に対するそれらの効果は、空間的および時間的勾配において生じる。この水耕栽培共生システムでは、微生物毒性または植物防御を誘導する合成植物ホルモンまたは化学物質は補充されない。対照的に、従来のアプローチを用いて、アセトシリンゴンのような合成化学物質の添加は、突然の人為的な濃度のスパイクを生成する。したがって、この水耕共培養系は、微生物および宿主植物が空間的および時間的様式で認識し応答する自然環境をより厳密に模倣する。
ここで、 アグロバクテリウム毒性遺伝子がシロイヌナズナとの共生培養で活性化されたことを実証することができた。これは、天然植物由来の化学物質がアグロバクテリウム病原性を誘導することを示唆している。将来のeこれらの化学物質を同定し、毒性誘発化合物アセトシリンゴンがその中に含まれているかどうかを確認するために、ffortが必要である。さらに、 アグロバクテリウムと共存培養すると、 シロイヌナズナの根の遺伝子発現および分泌機構のプロファイルの変化が観察され、植物 - 微生物相互作用中の植物宿主応答および分泌プロフィールを研究するための水耕共培養系の可能性を実証した。実際、水耕性共培養技術を用いて、植物宿主の遺伝子発現および分泌型プロファイルは、これらの転写または分泌型変化がどのように後続の植物 - 微生物相互作用を促進または阻止するかを解明するのに役立つ微生物相互作用に至るまで、 。
シロイヌナズナ - アグロバクテリウムシグナリングを研究することに加えて、水耕性共培養システムは、他の重要な植物微生物系を研究するために適応させることができる。それは個々にまたは集合的に作用し、比較的「自然な」状態で異なる植物宿主への微生物の付着および応答を研究するために、広範な病原性または有益な微生物に対する植物応答を解明する。典型的な苗型形態の維持は、分子植物 - 微生物相互作用を明らかにするために重要である。他のバクテリア、真菌、またはヘルビボ病原体の場合、共存する間に微生物の増殖を助けるために追加の栄養素が補充されてもよい。
しかしながら、異なる植物微生物系と共生するために考慮すべきいくつかのパラメータがある。種子の大きさや根の形態によっては、より大きい種子や苗木の場合、根の構造がメッシュ表面の下で完全に発達し、芽の上に増殖することを確実にするために、また、より高いプラットフォームを含むように設定を変更する必要があります。これは達成することができたbメッシュのより大きな四角形を切断し、それを角からさらに曲げる、メッシュの表面をコンテナの底から高くする、またはギリシャ十字の形でメッシュをカットし、各フラップをくぼみで曲げる。もちろん、すべてのシステムには限界があり、ここに提示されているものは、より長期間栽培されるより大きな植物（ 例えば、成熟したトウモロコシ）には有用ではありません。さらに、いくつかの生物は、このシステムを使用するときに振盪することによって提供されるよりも多くの通気を必要とすることがある。
確かに、自然界で起こる動的な植物 - 微生物の相互作用を正確かつ完全に再現するシステムを実験室で設計することは、非常に困難であるか、または不可能でさえある。水耕性共存培養は根圏における自然条件をより密接に表しているが、根本的な根の構造と植物の形態学をもって、少なくとも概念的には、系内に土壌微生物や土壌微生物は存在しない。しかし、このシステムは、制御可能な環境で微生物を研究し、植物や微生物が異なる生物的または非生物的な刺激をどのように知覚し応答するかを学ぶなど、さまざまなニーズを満たすことができます。この水耕共培養システムはまた、水耕栽培または生態系における微生物およびそれらの機能の理解を促進し得る。これは、水耕栽培温室産業のための疾病管理と植物の健康、または植物や微生物の水生生態にとって非常に重要です。
さらに、この水耕共培養システムは、バイオレメディエーションを研究し、微生物または植物の関連する代謝プロセスおよび調節経路を解明するために適合させることができる。さらに、この水耕共培養システムは、既存の（アレロケミカル）および/または適用された（合成）栄養素および化学的シグナル/化合物が微生物または植物宿主に及ぼす影響を調査するのを容易にする44 。間接的に影響を与える植物組織の利用可能性（ すなわち、0;葉、シュート）は、植物プライミングなどの他の植物防御プロセス、およびこれらのシグナルがどのように形質導入されるかを探索する機会を提供する。
この共同栽培システムの最も重要な部分は、汚染を防ぐことです。特に、半固体培地からタンクへの植物の移動は、水媒体の汚染を防ぐために非常に慎重に行わなければならない。したがって、この実験ステップは、生物安全キャビネット内の滅菌条件下で実施する必要があり、実験のために微生物を接種する前に実験者は移入後2〜3日待たなければならない。
要約すると、水耕性共共生システムは、典型的な植物の形態学および実験的プロセスを通して植物の根の構造の完全性を維持することによって、従来のアプローチの様々な制限を改善する。加えて、システムは補足を避ける植物ホルモンまたは防御/毒性誘発化学物質などの合成化学物質を使用しています。したがって、微生物や宿主植物が空間的および時間的な仕方で認識し応答する自然環境をより忠実に模倣する。この共培養システムは、エンドファイトまたは着生微生物を含むより「自然な」かつ管理しやすい条件で、異なる植物微生物系を研究するために適合させることができる。 プラナにおける相互作用の様々な局面、例えば病原体、共生または植物の成長促進を調べることができる。水耕性共培養システムは、植物および微生物の両方の生理学的、生化学的および分子的応答に新しい洞察を提供することができる。任意の所与の時点/間隔または成長段階において、水耕共培養系で増殖する細菌または植物は、植物および微生物転写ポリメラーゼ、植物および微生物代謝産物、植物および微生物分泌物、および生物学的媒介物を含む様々な「オミックス」分析に。さらに、この水耕性共培養システムは、制御可能な環境における植物宿主と微生物との間の相互作用を研究するために適合させることができる。要約すると、水耕共培養の利点は、分子植物 - 微生物相互作用およびシグナル伝達を明らかにするための優れたシステムの例である。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
Brian WeselowskiとAlexander W. Eastmanに感謝し、彼らの助けと役に立つ議論をしていただきたいと思います。私たちはDrsにも感謝したいと思います。 Eugene W. Nester、Lingrui Zhang、Haitao Shen、Yuhai Cui、Greg Thornの協力を得て、有用な議論と原稿の批評を読んだ。この研究は、農業および農業食品カナダ、Growing Forward-AgriFlex（RBPI番号2555）およびGrowing Forward IIプロジェクト番号1670（その職務の一環として著者が実施したもの）によって資金提供されました。この研究はまた、ZC Yuanに授与されたカナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）Discovery Grant RGPIN-2015-06052によって部分的に資金提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
- Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
- Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
- Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
- Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
- Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
- Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
- Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- Gelvin, S. B.
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
- Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
- Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
- Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
- Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
- Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
- Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
- León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J.
- Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
- Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
- Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
- Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
- Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
- Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
- Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
- Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
- Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).
