Summary
Het beschreven hydroponische cocultivatiesysteem ondersteunt intacte planten met metalen maasschermen en cocultivateert ze met bacteriën. Plantweefsel, bacteriën en gescheiden moleculen kunnen vervolgens afzonderlijk worden geoogst voor stroomafwaartse analyses, waarbij tegelijkertijd wordt toegelaten dat de moleculaire reacties van zowel plantaardige hosts als interactieve microben of microbiomen worden onderzocht.
Abstract
Een experimenteel ontwerp dat natuurlijke plant-microbe interacties nabootst, is zeer belangrijk om de complexe plant-microbe signaleringsprocessen te definiëren. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Biedt een uitstekend model systeem om bacteriële pathogenese en plantinteracties te bestuderen. Vorige studies van plant -Agrobacterium interacties hebben grotendeels gebaseerd op plantencel suspensie culturen, het kunstmatige wonden van planten, of de kunstmatige inductie van microbiële virulentie factoren of plantenverdediging door synthetische chemicaliën. Deze methoden onderscheiden zich echter van de natuurlijke signalering in planta , waar planten en microben herkennen en reageren op ruimtelijke en temporele manieren. Dit werk presenteert een hydroponisch cocultivatiesysteem waar intacte planten worden ondersteund door metalen maasschermen en gecocultiveerd met Agrobacterium . In dit cocultivatiesysteem bestaat geen synthetische fytohormoon of chemische stof die micr induceertObalieve virulentie of plantenverdediging wordt aangevuld. Het hydroponische cocultivatiesysteem lijkt op natuurlijke plant-microbe interacties en signaleert homeostase in planta . Plantwortels kunnen gescheiden worden van het medium dat Agrobacterium bevat , en de signalen en reacties van zowel de plantgastheren als de interactieve microben kunnen gelijktijdig en systematisch worden onderzocht. Bij een bepaald tijdstip / interval kunnen plantweefsels of bacteriën afzonderlijk worden geoogst voor diverse "omics" -analyses, die de kracht en werkzaamheid van dit systeem tonen. Het hydroponische cocultivatiesysteem kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen: 1) de wederzijdse signalering van diverse plantmicrobysystemen, 2) signalering tussen een plantengas en meerdere microbiële soorten ( dwz microbiële consortia of microbiomen), 3) hoe voedingsstoffen en chemicaliën betrokken zijn In plant-microbe signalering, en 4) hoe microben interactie hebben met plantaardige hosts en bijdragen aan plantentolerantie voor biotische oR abiotische stress.
Introduction
Plantgerelateerde microben spelen belangrijke rollen in biogeochemische cycli, bioremediëring, vermindering van klimaatverandering, plantengroei en gezondheid en plantentolerantie tegen biotische en abiotische stress. Micro-organismen interageren met planten, zowel direct door plantencelwandcontact en indirect via chemische afscheiding en signalering 1 , 2 , 3 . Als sessiele organismen hebben planten directe en indirecte mechanismen ontwikkeld om infectie door pathogenen te weerstaan. Directe verdediging omvat structurele verdediging en de expressie van verdedigingseiwitten, terwijl indirecte verdediging de productie van secundaire plantenmetabolieten omvat en de aantrekkingskracht van organismen antagonistisch tegen invallende pathogenen 4 , 5 . Plantaardige wortel exudaten, afscheidingen, mucilages, mucigel en lysaten veranderen de fysisch-chemische eigenschappen van de rhizosfeer om te trekken of af te kerenMicroben naar hun gastheren 6 . De chemische samenstelling van wortelafscheiding is speciesspecifiek, en dient daarbij als selectief filter dat bepaalde micro-organismen in staat stelt om dergelijke verbindingen te herkennen om in de rhizosfeer 6 te bloeien. Zo kunnen compatibele microbiële soorten worden gestimuleerd om hun associaties te activeren en te verbeteren, hetzij tot voordeel of nadelen van de plantengas 1 .
Het begrijpen van plant-microbe-interacties in de rhizosfeer is essentieel voor het verbeteren van de productiviteit van het plant en het functioneren van het ecosysteem, aangezien een meerderheid van de microbiële en chemische blootstelling zich voordoet bij de wortelstructuur en de bodem-luchtinterface 2 , 6 , 7 , 8 . Het onderzoek naar ondergrondse plant-microbe interacties en wederzijdse reacties is echter een uitdaging als gevolg van het intrigerende Complexe en dynamische natuur en het ontbreken van geschikte experimentele modellen met natuurlijke wortelstructuur en plantmorfologie onder strak beheersbare groeivoorwaarden. Als een van de meest bestudeerde fytopathogenen infecteert Agrobacterium een breed scala aan planten met agrarisch en tuinbouw belang, waaronder kersen, appel, peer, druif en roos 9 . Agrobacterium is een belangrijk model organisme voor het interpreteren van plant-pathogeen interacties en is een krachtig instrument in plantentransformatie en planttechniek 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
Moleculaire plant- Agrobacterium interacties zijn al jarenlang bestudeerd en het huidige begrip van Agrobacterium pathogeniciteit is uitgebreid 9 ,F.> 11 , 15 , 16. De pathogeniciteit van Agrobacterium wordt grotendeels toegeschreven aan de evoluerende mogelijkheden van het opnemen van plantaardige afgeleid signalen, wat resulteert in de fijne modulatie van het virulentieprogramma en de cel-naar-celcommunicatie, zogenaamd quorum sensing 17 . Het Agrobacterium virulence programma wordt geregeld door verschillende signalen die beschikbaar zijn in de rhizosfeer en omvatten twee sets van 2-componenten systemen, het ChvG / I-systeem en het VirA / G-systeem. Acide condities in de rhizosfeer activeren de transcriptie van chvG / I , virA / G , En verscheidene andere genen die betrokken zijn bij Agrobacterium pathogeniciteit, waaronder virE0 , virE1 , virH1 , virH2 en genen van het type VI-afzettingssysteem (T6SS) 18. Plantafledde fenolverbindingen, waaronder acetosyringon (4'-hydroxy-3 ', 5 '-dimethoxyacetofenon), activeer de VIrA / G 2-componenten systeem via fosforylatie signaal mechanismen 19 . VirA / G activeert dan het volledige vir- regulon, wat resulteert in de overdracht en integratie van een ~ 20 kb bacterieel DNA fragment genaamd transfer DNA (T-DNA) van zijn tumorinducerende (Ti) plasmide in de plantencel 16 . T-DNA draagt genen die verantwoordelijk zijn voor de synthese van plantaardige hormonen indool-3-azijnzuur (IAA) ( iaaM en iaaH ) en cytokinine ( ipt ), en eenmaal uitgedrukt in plantencellen worden grote hoeveelheden van deze fytohormonen geproduceerd. Dit resulteert in abnormale weefsel proliferatie en ontwikkeling van plantentumor, bekend als kroon galziekte, die een chronisch en resurgent probleem is voor planten 9 , 11 , 20 . IAA handelt ook collectief met salicylzuur en gamma-aminoboterzuur om de Agrobacterium virulentie te onderdrukken of om Agrobacteriu te verminderen M kworum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Om deze onderdrukking tegen te gaan, draagt T-DNA ook genen voor opine biosynthese, die Agrobacterium quorum detecteert om de pathogeniteit van Agrobacterium te bevorderen en dient ook als voedingsbron voor het pathogeen 22 , 23 .
Ondanks een algemeen diepgaand begrip van Agrobacterium- plantinteracties en de resulterende T-DNA-overdracht in de plantaardige gastheer, zijn de complexe signaleringsgebeurtenissen in het beginstadium van interactie minder goed begrepen. Dit komt gedeeltelijk door de beperkingen van conventionele benaderingen om Agrobacterium- plantensignaal te onderzoeken. Plantcelsuspensieculturen en kunstmatige site-specifieke wonden worden vaak gebruikt voor het bestuderen van moleculaire plant-microbe-interacties 24 ,Ef,> 26 , 27. Echter, cel suspensies hebben typische plantmorfologie, in het bijzonder hebben plantaardige suspensiecellen geen wortelstructuren en wortel exudaten, die zeer belangrijk zijn voor het activeren van microbiële chemotaxis en virulentie 28 , 29. Het behoud van plantmorfologie En wortelstructuur is aangepakt door kunstmatig wondende planten, waardoor plaatselijke specifieke infectie wordt vergemakkelijkt, wat resulteert in het detecteren van geïnduceerde plantenverdediging gerelateerde genen in direct geïnfecteerd plantweefsel 30 , 31. Maar kunstmatige wonden is significant verschillend van pathogeeninfectie in de natuur , Met name omdat wonden leidt tot accumulatie van jasmonzuur (JA), die systematisch inbreuk maakt op natuurlijke plantensignalen en verdediging 26. Bovendien worden synthetische chemicaliën typisch gebruikt om kunstmatige reacties kunstmatig in te leidenOf pathogen virulentie. Hoewel de aanvulling van zulke chemische verbindingen die weerspiegelen van concentraties in planta mogelijk is, is deze toevoeging niet in de geringe mate van diffusie van wortel exudaten in de omringende rhizosfeer, die een chemotactische gradiënt genereert door microbes 28 , 32 genereert. Gezien de beperkingen van conventionele benaderingen om plant-microbe-interacties te bestuderen, kan de nauwkeurigheid en diepte van de verkregen gegevens worden belemmerd en restrictief, en de kennis die voortvloeit uit de conventionele benaderingen kan niet direct in planta vertaald worden. Veel aspecten van planten- Agrobacterium signalering zijn nog niet volledig begrepen, vooral in het vroege stadium van interacties, wanneer de ziektebeelden nog niet zijn ontwikkeld.
Om de beperkingen van conventionele benaderingen te wijzigen, presenteert dit werk een goedkope, goed beheersbare en flexibele hydroponische cOcultivatie systeem dat de onderzoekers in staat stelt diepere inzichten te krijgen in de complexe signalering- en reactiewegen bij de eerste fase van moleculaire plant-microbe interacties. Hydroponics is veel gebruikt om plantaardige voedingsstoffen, wortel exudaten, groeivoorwaarden en de effecten van metallische toxiciteit op planten 33 , 34 te bestuderen. Er zijn verschillende voordelen van hydroponische modellen, met inbegrip van de kleine ruimtelijke eisen, de toegankelijkheid van verschillende plantenweefsels, de strakke controle van de nutriënten / milieuomstandigheden en de bestrijding van de plaag / ziekte. Hydroponische systemen zijn ook minder beperkend voor plantengroei in vergelijking met agar / phytoagar plating technieken, die de groei meestal beperken na 2-3 weken. Belangrijk is dat het onderhoud van planten in de planten de natuurlijke wortesecretie vereiste die nodig is voor microbiële chemotaxis en virulentieinductie 8 , 29 . Het systeem beschrijftBed hier is eenvoudiger en minder arbeidsintensief dan de alternatieven 33 , 34 . Het maakt gebruik van minder onderdelen en vereist geen andere gereedschappen dan standaardscharen. Het gebruikt metaalnetwerk (in tegenstelling tot nylon 33 ) als een sterke ondersteuning voor plantengroei en een eenvoudige methode van beluchting onder steriele omstandigheden door schudden om microbiële groei te ondersteunen. Daarnaast kan het systeem metaalmaas van verschillende maten gebruiken om plantengroei te ondersteunen, die diverse plantensoorten herbergt zonder de breedte van hun wortels te beperken.
In het hier gepresenteerde hydroponische cocultivatiesysteem worden planten gekweekt in een steriel hydroponisch systeem waar de plantenwortels organische verbindingen scheiden die de groei van geïmpliceerde bacteriën ondersteunen. In dit cocultivatiesysteem worden geen kunstmatige chemicaliën, zoals plantaardige hormonen, verdedigingselectie, of virulentie-inducerende chemicaliën aangevuld, die de natuurlijke cel weerspiegeltSignalerende homeostase tijdens plant-microbe interacties. Met dit hydroponische cocultivatiesysteem was het mogelijk om gen expressie in Arabidopsis thaliana Col-0 wortelweefsel gelijktijdig te bepalen bij infectie door Agrobacterium , evenals de activatie van Agrobacterium genen bij cocultivatie met Arabidopsis . Verder werd aangetoond dat dit systeem geschikt is om Agrobacterium- bijlage aan plantenwortels te bestuderen, evenals het wortelgeheimprofiel van de plant, bij cocultivatie (infectie) met Agrobacterium ( Figuur 1 ).
Figuur 1: Overzicht van het Hydroponic Cocultivation System, met voorbeeldanalyses. Planten worden op de maas gekweekt (scheuten boven het maas), met de wortels gedompeld in hydroponisch medium dat vervolgens met bacteriën fOf coculture. Plantweefsels en bacteriën worden vervolgens gescheiden voor gelijktijdige extracties en analyses. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 35 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Experimentele planning
- Bepaal de specifieke doelen van het experiment.
- Lees het volledige protocol hieronder door. Bepaal welke secties relevant zijn voor de specifieke doelen en of wijzigingen nodig zijn. Zie hieronder voor voorbeelden.
- Overweeg of de experimenten A. thaliana planten en A. tumefaciens bacterie, zoals hieronder, of een andere plant-microbe combinatie zullen gebruiken.
OPMERKING: Hoewel verschillende plantensoorten kunnen worden gebruikt, kan de dikte van de plantenwortels een ander formaat hebben (stap 3.3) en de groeiparameters (stappen 3.10-3.11 en 4.4) en hydroponische tankgrootte en mediumvolume (stap 4.2) kan ook aanpassing vereisen ( figuur 2 ). Microben kunnen gemakkelijk worden geïoculeerd als pure culturen, gemengde soorten (consortia), of uit milieuproeven (microbiomen), maar eventuele wijzigingen kunnen het protocol beïnvloeden, met name stap 4.5. - Houd rekening met deSoorten experimenten die gebruikt worden om de monsters te analyseren.
OPMERKING: Fluorescentiemicroscopie (stap 5) vereist organismen die zijn gemerkt met een fluorescent reporterconstruct.
- Overweeg of de experimenten A. thaliana planten en A. tumefaciens bacterie, zoals hieronder, of een andere plant-microbe combinatie zullen gebruiken.
- Ontwerp passende controles. Inclusief hydroponische tanks zonder zaailingen die worden geococuleerd met controlebacteriën en tanks met controle zaailingen die niet met bacteriën worden geënt.
- Bepaal experimenten met het juiste aantal zaden en hydroponische tanks. Overweeg controles, biologische replicaten (3 minimum) en hoeveelheden weefsel nodig voor alle analyses.
- Bepaal de juiste lengte van de cocultivatie voor de experimentele doelen (stap 4.8).
- Herhaal onderstaande stappen, indien nodig.
Figuur 2. Voorbeelden van andere planten die kunnen worden gekweekt in het hydroponische systeem, ondersteund door een P Latvorm van Metal Mesh. Compatibiliteit van een set metalen mazen voor een verscheidenheid aan plantenzaden en teelt. ( A ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 3 × 3 mesh × .047 "dia draad voor Vicia faba . ( B ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 4 × 4 mesh × .035" dia draad voor Zea mays . ( C ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 4 × 4 mesh × .032 "dia draad voor Glycine max (soja). ( D ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 6 × 6 mesh × .047" dia draad voor Raphanus sativus (winter radijs). ( E ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 6 × 6 mesh × .047 "dia draad voor Triticum spp. ( F ) Roestvrij staal type 304 lasmesh 6 × 6 mesh × .035" dia draad voor Cucumis sativus . Dit cijfer is gewijzigd van referentie 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
2. Sterilisatie van de zaadoppervlak van het zaad
- Vortex (bij hoge snelheid) ongeveer 200 zaden van A. thaliana met 500 μl gedeïoniseerd water in een microcentrifugebuis. Voor plantensoorten met grotere zaden, gebruik een grote buis om de oppervlakte sterilisatie te vergemakkelijken.
- Centrifugeer dit bij ongeveer 9.000 xg gedurende 30 s in een tafelmicrocentrifuge. Verwijder het water (supernatant) met een pipet.
- Voeg 300 μL 2% natriumhypochloriet toe aan de zaden en vortex. Laat 1 minuut op kamertemperatuur staan. Voor plantensoorten met grotere zaden, gebruik grotere hoeveelheden om de zaden te bedekken.
- Centrifugeer bij ongeveer 9.000 xg gedurende 30 s in een tafelmicrocentrifuge. Verwijder de natriumhypochlorietoplossing met behulp van een pipet.
- Voeg 500 μL steriel, gedeïoniseerd water toe aan de zaden en vortex. Centrifugeer bij ongeveer 9.000 xg voor30 s en verwijder het water met een steriele pipet.
- Herhaal stap 2.5 nog eens 4 keer.
- Voeg 500 μL 70% ethanol toe aan de zaden en de werveling. Laat 1 minuut op kamertemperatuur staan.
- Centrifugeer bij ongeveer 9.000 xg gedurende 30 s in een tafelmicrocentrifuge. Verwijder de 70% ethanol met een pipet.
- Herhaal stap 2.5 nog eens 5 keer.
- Resuspendeer de gesteriliseerde zaden in 500 μL steriel, ultrauw water.
3. Zaadkieming en halfzijdige cultivatie van planten
- Bereid semi-vast Murashige en Skoog (MS) medium: 2.165 g / L MS basale zouten; 10 g / l sucrose; 0,25 g / l MES; En 59 ml / L B5 vitamine mix, pH 5,75, met 4 g / L phytoagar.
- Autoclaaf het MS-medium. Giet 25 ml ervan in elke steriele diepe Petri-schotel (100 x 25 mm 2 ).
- Voor elke Petri-schotel, snijd een 90 x 90 mm vierkant van roestvrijstaal mesh uit.
OPMERKING: De aanbevolen maas voor A. thaliana < / Em> heeft een cijfer van 304 (standaard cijfer), maasgetelling (aantal gaten per lineair inch) van 40 x 40 en een draaddiameter van 0,01 inch (0,0254 cm). Een grotere mazenhoek is nodig voor grotere hydropinische tanks Of hoger platforms. - Beweeg de hoeken van elk vierkante maas net zo dat het maas in de Petri plaat past. Beweeg de hoeken 90 ° bij de grootste deel van het maas om het maas door de hoeken op te zetten, waardoor voldoende ruimte onder de wortelontwikkeling ligt ( Figuur 3a ).
- Zet de gesneden mazen in een beker, bedek met aluminiumfolie en steriliseer door autoclaving met een 30 min droogcyclus.
- Zodra het medium in de petrischalen is gestolven en het gaas steriel is, plaats elke gesteriliseerde mazenplein bovenop het semi-vaste medium, met de gebogen hoeken naar beneden gericht.
- Duw het gaas zo dat de hoeken het medium binnendringen en het grootste deel van het gaas raakt aan het bovenste oppervlak van het medium (> Figuur 3b).
- Gebruik een 200 μL transferpipette om afzonderlijke oppervlakgesteriliseerde A. thaliana- zaden op te stellen (zaden blijven op de punt van de pipet wegens vacuümkracht) en zet zachtjes elk zaad op de maas over. Plaats de zaden zodanig dat ze geschikt zijn voor experimentele behoeften ( bijv. 4 zaden / bord).
- Verzegel de Petri-platen met deksels en plaats poreuze chirurgische tape rond de randen.
- Stratifereer de zaden door de hele Petri-schotel bij 4 ° C te plaatsen voor 2 d in het donker ( bijv. Wikkel in de tinfoel om de duisternis te simuleren.)
- Kweek de zaden in de petrischaal bij 22-24 ° C met een 16 uur fotoperiode gedurende 10-14 dagen ( Figuur 3c ).
Figuur 3: Hydroponisch Plant-Microbe Cocultivation System. De linker paNel staat voor een stroomdiagram waarin de zes belangrijke stappen worden beschreven bij het monteren en bedienen van het hydroponische co-cultivatie systeem. Het juiste paneel demonstreert de werkelijke experimentele materialen, apparatuur en operationele procedures voor het hydroponische cocultivatiesysteem bij het bestuderen van Arabidopsis-Agrobacterium- interacties. De inentingsstap en de laatste stap voor plant- of bacteriële bemonstering worden nu getoond. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 35 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Hydroponic Cocultivation System
- Bereiding vloeibare Murashige en Skoog (MS) medium: 2.165 g / L MS basale zouten, 10 g / L sucrose, 0,25 g / L MES, en 59 ml / L B5 vitamine mix, pH 5,75.
- Autoclaaf het medium. Giet 18 ml ervan in elk steriel cilindrisch glas of heldere plastic tank (kristalliserende afwas, 100 x 80 mm2) met steriele deksels.
OPMERKING: Presteriliseer de tanks en deksels door ze in aluminiumfolie te verpakken en autoclaving te maken. - In een gesteriliseerde stoomkap gebruiken steriele pincetjes om elke mazenkwartier zachtjes over te brengen met 10-14 dagen oude zaailingen van het semi-vaste medium naar een hydroponische cilindrische tank ( Figuur 3d ). Zet de deksels op de tanks met poreuze chirurgische tape.
- Kweek de zaailingen op het maas in de tank gedurende 72 uur bij 22-24 ° C, met een 16 uur fotoperiode en schudden bij 50 rpm voor beluchting ( Figuur 3e ).
OPMERKING: Hierdoor kunnen planten zich aanpassen aan het hydroponische milieu voorafgaand aan inenting (cocultivatie) met micro-organismen. Deze wachttijd zal ook toevallige microbiële besmetting toestaan voor de inenting.- Begin de volgende stap de dag voor het einde van de incubatieperiode.
- Grow A. tumefaciens in AB medium(0,5% w / v gistextract, 0,5% w / v trypton, 0,5% w / v sucrose, 50 mM MgSO4, pH 7,0) bij 28 ° C onder schudden overnacht totdat de kweek een uiteindelijke optische dichtheid van 1,0 bij 600 bereikt Nm (OD 600 ), gemeten met behulp van een spectrofotometer, met ongeïnoculeerd AB-medium als een blanco.
OPMERKING: een OD 600 van 1,0 is gelijk aan ongeveer 10 9 cellen / ml. - Was de A. tumefaciens driemaal in een gelijk volume van 0,85% NaCl. Resuspendeer in een gelijke hoeveelheid steriel dubbel gedistilleerd water.
- Vóór de inenting moet de tank met zaailingen zorgvuldig worden nagegaan om te voorkomen dat er sprake is van verontreiniging; Het medium in de onontreinigde tanks moet helder en transparant zijn.
- Gooi een tank weg met bewolkte vloeistof (verontreiniging) en nummer de rest van de tanks. Proef een kleine hoeveelheid (20 μL) hydroponisch medium uit elke genummerde tank en spot het op een petrischaal vol Luria bouillon (LB). IncuberenHet gerecht bij 28 ° C.
- Voeg onmiddellijk 50 μL van de A. tumefaciens suspensie (ongeveer 5 x 107 cellen, geschat van de OD 600 ) in elke genummerde hydroponische tank. Cocultivate de A. thaliana zaailingen en A. tumefaciens bij 22-24 ° C met een 16 uur fotoperiode en schudden bij 50 rpm ( Figuur 3f ).
- Onderzoek de gevlekte LB-plaat uit stap 4.7.1. Na 12 en 28 uur incubatie om de steriliteit van de tanks te verifiëren. Als er sprake is van vervuiling, gebruik dan niet de bijbehorende genummerde tank (ingeënt met bacteriën) voor verdere downstream assays.
- Indien gewenst, controleer de groei van A. tumefaciens met regelmatige tussenpozen door een monster medium uit de tank te verwijderen en de OD 600 te meten met behulp van een spectrofotometer met medium van een niet geïnoculeerde controle als een blanco ( Figuur 4 ).
NEETE: Symptomen bij plantenziekten moeten na 7 dagen zichtbaar zijn ( figuur 5 ). - Afzonderlijke A. thaliana wortels uit de bacteriële suspensie door de maasplaat op te heffen; De timing van deze stap is afhankelijk van downstream processen. Zie stap 5-8 voor details.
- Als u wortels gebruikt voor latere analyses, spoelt u de wortels snel in dubbel gedestilleerd water. Als u blad of ander weefsel gebruikt, snijd het weefsel af. Voor RNA-analyses ga dan meteen door naar stap 7.1.
Figuur 4: Agrobacteriumgroei in het hydroponische cocultivatiesysteem. Agrobacteriumgroei in de aanwezigheid of afwezigheid van een plantaardige gastheer ( Arabidopsis ) werd elke 4 uur bewaakt. Agrobacteriumcellen werden gegroeid in AB medium O / N, gewassen 3x met 0,85% NaCl, en geënt in het hydroponische systeem, met of wZonder Arabidopsis co-cultivatie, vanaf een initiële OD 600 van ongeveer 0,1. De OD 600 waarden zijn de middelen van drie biologische replicaten, met standaardafwijkingen ( OD 600 van 1.0 = 1 x 10 9 cellen / ml).
Figuur 5: Representatieve plantfenotypen en symptomen waargenomen ziektes tijdens cocultivatie. Binnen 4 dagen na inenting zijn geen ziektesymptomen zichtbaar ( A ) in vergelijking met niet-geïnoculeerde planten ( B ). Na 7 d van Cocultivation (infectie) worden ziektebeelden waargenomen bij besmette planten ( C ), terwijl niet-geïnoculeerde planten gezond blijven ( D ).
5. Fluorescentiemicroscopie
- Gebruik A. tumefaciens voor een autofluorescerend eiwit voor een reporterconstructieDe cocultivatie setup in stap 4.5 .
OPMERKING: hier wordt een gemodificeerd pJP2 plasmide-expressie pCherry, een derivaat van dsRed 36 , gebruikt. - Na een passende co-cultivatie ( bijv. 48 uur) in stap 4.8, afzonderlijke afzonderlijke secundaire wortels (zijtakken van de hoofdwortel) met behulp van steriele scharen.
- Spoel de wortels in dubbel gedestilleerd water om losgebonden materiaal te verwijderen. Onderdompel elke wortel in 30 μL water op een microscoopschuif en bedek met een glazen deklaag.
- Verzegel de randen van de deklaag met nagellak om de uitdroging van de wortels te voorkomen.
- Visualiseer de bijlage van A. tumefaciens naar A. thaliana wortels door fluorescentiemicroscopie.
OPMERKING: hier wordt een confocale microscoop met excitatie van een helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser gebruikt om pCherry rode fluorescentie bij 590-630 nm te visualiseren onder een omgekeerde 63X waterlensdoelstelling met een numerieke diafragma van 1,4 (
Figuur 6: Agrobacterium Root Attachment, bepaald door Confocal Microscopy. Het pCherry-rood-fluorescentie-gemarkeerde Agrobacterium werd bij 590-630 nm visualiseerd, met excitatie van een helium-neon (He-Ne) 543/594 nm laser. Visualisatie werd uitgevoerd onder een omgekeerde 63X waterlens doelstelling met een numerieke diafragma van 1.4. Schaalstaven = 11 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
6. Bacteriële transcriptieanalyses
- Na een passende co-cultivatie ( bijv. 8 uur) in stap 4.8, scheid de wortels uit het hydroponische medium zoals in stap 4.9. Vervoer 1,5 ml van het hydroponische medium naar een 1,5 ml microCentrifugebuis en centrifuge bij 12.000 xg gedurende 2 minuten om de cellen te pelletiseren.
- Verwijder de supernatant. Verplaats nog eens 1,5 ml van het hydroponische medium naar dezelfde 1,5 ml microcentrifuge-buis en centrifugeer bij 12.000 g gedurende 2 minuten om de cellen te pelletiseren.
- Verwijder de supernatant.
OPMERKING: het protocol kan hierbij worden onderbroken door de monsters te bevriezen bij -80 ° C tot gebruik. - Extracteer het RNA uit de A. tumefacienscellen met behulp van standaardmethoden 37 of een geschikte commerciële RNA isolatie- en zuiveringsset met DNase-behandeling om DNA-besmetting te vermijden.
OPMERKING: het protocol kan hierbij worden onderbroken door vriezende delen van RNA bij -80 ° C tot gebruik te maken. - Gebruik het geïsoleerde RNA voor een verscheidenheid aan analyses met behulp van standaardmethoden, inclusief het volgende.
- Gebruik een commercieel microarray volgens het protocol van de fabrikant om genen te detecteren die verschillend uitgedrukt worden in gecocultiveerde versus controlecultuur.
- Gebruik kwantitatieve Real-Time Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) om de expressie van specifieke genen te detecteren of om microarray data 38 te valideren.
7. Plant Transcript Analyses
- Na een passende cocultivatie ( bijv. 8 uur) in stap 4.8, scheid de wortels van het hydroponische medium, zoals in stap 4.9, of scheid ander weefsels indien nodig. Plaats ongeveer 150 mg wortels of ander plantweefsel in vloeibare stikstof.
OPMERKING: het protocol kan hierbij worden onderbroken door de monsters te bevriezen bij -80 ° C tot gebruik. - Maal de bevroren monsters aan een poeder in vloeibare stikstof met een mortel en stamper.
- Extract RNA uit het poeder met behulp van standaardmethoden 39 of een geschikte commerciële RNA isolatie- en zuiveringsset met DNase-behandeling om DNA-besmetting te vermijden.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken door het bevriezen van alinea's van RNA bij-80 ° C tot gebruik. - Gebruik het geïsoleerde RNA voor een verscheidenheid aan analyses met behulp van standaardmethoden, inclusief het volgende.
- Gebruik een commerciële microarray volgens het protocol van de fabrikant om genen te detecteren die verschillend uitgedrukt worden in co-cultivated versus controle planten.
- Gebruik qRT-PCR om differentiële expressie van specifieke genen te detecteren of om microarray data 38 te valideren.
8. Secretome Profiling
- Na een passende co-cultivatie ( bijv. 72 uur) in stap 4.8, scheid de wortels uit het hydroponische medium zoals in stap 4.9. Steriliseer het 18 ml hydroponisch medium door het door een 0,2 μm poriefilter in 50 ml conische buizen over te brengen.
- Bevroren de monsters bij -80 ° C / N.
- Los de kappen los op de 50 ml kegelbuizen en plaats ze 36 uur in een vriesdroger. Ga door om de monsters op te slaan of te verwerken (zoals desHieronder beschreven) voor HPLC analyse en verbinding detectie.
OPMERKING: het protocol kan hier worden onderbroken. - Resusteer elk monster in 5 ml dubbel gedestilleerd water in een afdichtbare proefbuis.
- Voeg 5 ml ethylacetaat toe en meng het door meerdere keren de buis om te keren.
- Laat de fasen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur scheiden.
- Breng de bovenkant (organische fase) naar een nieuwe container door pipettering. Indien nodig, pool meerdere organische fracties.
- Droog onder een zachte stroom stikstofgas (~ 45 min).
- Het monster opnieuw opschorten in een geschikte oplossing voor HPLC ( bijv. 100% methanol).
- Voer HPLC uit volgens standaardmethoden 40 .
- Ontdek verbindingen op passende wijze.
OPMERKING: Tijdens de vlucht-massaspectrometrie (ESI-TOF-MS) 40 wordt hier gebruik gemaakt van elektrosprayononisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Groei in het hydroponische co-cultivatie systeem
De groeicurve van A. tumefaciens C58 vertoonde een significante lagfase in de eerste 16 uur van cocultivatie, gevolgd door een zeer stabiele groei bij co-cultivatie met A. thaliana Col-0, tot een maximum OD 600 van ongeveer 0,9 vanaf 48 uur postinoculatie. Daarentegen werd in hoofdzaak geen bacteriële groei waargenomen in de controle kweek zonder A. thaliana ( Figuur 4 ). Deze resultaten suggereren dat, zonder extra voedingsstoffen die kunstmatig worden geleverd, plantaardige wortelsecretische chemische verbindingen de groei van Agrobacterium in het hydroponics-cocultivatiesysteem kunnen ondersteunen. De significante lagfase gedurende de eerste 16 uur van cocultivering kan worden toegeschreven aan de vrij complexe gasterverspanning en geleidelijke wortelsecretie bij cocultivering met het pathogeen. </ P>
Cocultivated A. thaliana planten vertoonden geen ziekte symptomen gedurende de eerste 3 dagen, ten opzichte van controle planten gekweekt in de afwezigheid van A. tumefaciens ( Figuur 5a , 5b ). Na 5 dagen van cocultivatie werden echter verschillen geleidelijk zichtbaar en de mock-behandelde controle planten waren groener en gezonder. Na 7 dagen van cocultivering met Agrobacterium , vertoonde plantweefsel chlorose en necrose, evenals vroege bloei ( Figuur 5c, 5 d ). Vroeg bloeien in Arabidopsis is een algemeen gevolg van infectie door een reeks van filogenetisch uiteenlopende pathogenen 41 , 42 .
Microscopische visualisatie van Agrobacterium attachment op plantaardige wortels
A. tumefaciens gemerkt met pCherry rode fluorescentie gelokaliseerd aan de plantenwortelstructuur met een typische stangachtige of filamentvormige vorm, ongeveer 0,5 μm in breedte en 3-5 μm in lengte ( figuur 6 ). De meeste bacteriële cellen werden verticaal bevestigd aan het oppervlak van de wortelcelwand, in overeenstemming met eerdere bevindingen dat Agrobacterium op polaire wijze 32 aan de celwand bindt.
Deze resultaten suggereren dat het hydroponische cocultivatiesysteem kan worden gebruikt om bacteriële dynamiek in planta , zoals de bevestiging van de wortelstructuur en het infectieproces, in real-time te bestuderen. In feite, in afwezigheid van andere microben, biedt dit cocultivatiesysteem een geluidsvrij platform voor de directe observatie van bacterie-installatiebijlage in planta . Activatie van transcripten van Agrobacterium virulentie
Na 8 uur van cocultivatie werden A. tumefacienscellen geoogst voor RNA-isolatie, en de transcriptie-niveaus van de representatieve virulentiegenen werden geëvalueerd met qRT-PCR ( Figuur 7 ). De expressie van de virulentiegenen ropB, virA, virD1, virH1, virE0 en chvG werden significant gecorrigeerd tijdens de co-cultivatie met de plantgastheer , in vergelijking met de controle zonder A. thaliana . In het bijzonder verhoogde het overvloed van mRNA met 100% voor chvG , bij 70% voor virD1 , bij 94% voor virA , bij 40% voor virE0 , bij 330% voor ropB en bij 48% voor virH1 .
Deze resultaten suggereren dat, zonder aanvullingenNtatie met synthetische virulentie-inducerende chemicaliën, plantenafscheidende chemische stoffen in het hydroponische cocultivatiesysteem zijn in staat om Agrobacterium virulence programmering te activeren. De inductie van Agrobacterium virulentie genen is indicatief voor de Agrobacteria respons op plantafledende signalen in het hydroponische cocultivatiesysteem. Het is erg interessant dat Agrobacterium ropB en chvG geïnduceerd worden bij cocultivatie met Arabidopsis, aangezien eerdere studies hebben aangetoond dat deze genen geïnduceerd zijn door zure condities 18 , maar niet door acetosyringon, een bekende virulentie-inducerende verbinding 19 . Dit resultaat suggereert dat niet geïdentificeerde verbindingen uit Arabidopsis- wortels in staat zijn ropB- en chvG- expressie te induceren. Zulke virulentie-inducerende chemicaliën moeten echter verder worden geïdentificeerd.
Figuur 7. Activatie van Agrobacterium Virulence in het Hydroponic Cocultivation System. De mRNA-niveaus van zes Agrobacterium virulentiefactoren werden kwantitatief gemeten door qRT-PCR. De overvloed van virulentiefactor transcripten werd genormaliseerd aan die van de 16S rRNA transcripten. De data vertegenwoordigen de middelen ± standaardafwijking (foutbalken) van 3 biologische replicaten, met P- waarden verkregen door de student's t-test.
Uitdrukking van plantaardige transcripties
QRT-PCR analyse werd uitgevoerd voor vijf genen die eerder werden getoond in differentiaal uitgedrukt in A. thaliana (ongepubliceerde data). Zoals verwacht, bevestigde qRT-PCR dat AGP 30 (AT2G33790) en NAS 1 (AT5G04950) werden gereguleerd (respectievelijk 97 en 89%), terwijl HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) en ELIP 1 (AT3G22840) werden in elk van de 3 replicaten versus de controles (respectievelijk 3,800, 540 en 510%) gereguleerd ( Figuur 8 ).
Figuur 8: qRT-PCR van A. thaliana Root Transcripts. De overvloed van elk mRNA transcript werd genormaliseerd met die van At ACTIN II transcripten. De gegevens zijn de gemiddelden van 3 biologische replicaten ± de standaardafwijking (foutbalken), met P- waarden verkregen door de t-toets van de student.
Wijzigingen in gastheerafscheidingsprofielen
Wortel-afgeleide verbindingen zijn aangetoond dat ze grotendeels verschillen tussen plantensoorten 6 , 8 . roOt exudaten omvatten moleculaire signalen die verschillende signalerende reacties oproepen tijdens plant-microbe interacties 1 , 43 . Progressieve verschillen in gastersecretieprofielen over de tijd na microbe-interactie zijn echter veel minder begrepen, behalve dat wortelgezette verbindingen essentieel zijn voor de aantrekking van gunstige bacteriën 29 . Na 72 uur cocultivering met A. tumefaciens C58 werden verschillen in A. thaliana Col-0 secretome profielen vastgesteld met behulp van positieve ionmodus LC-MS analyse en vergelijkingen met niet geïnoculeerde A. thaliana Col-0 ( dwz in afwezigheid van Agrobacterium ). Een duidelijke verschuiving in secretoom werd waargenomen, waarbij nieuwe verbindingen verschijnen als gevolg van Agrobacterium- inoculatie ( Figuur 9 ). In totaal werden 35 verbindingen verbeterd in het geheim van Agrobacterium- geïnoculeerde planTs, terwijl 76 werden verbeterd in het geheim van niet-geïnoculeerde planten ( Figuur 9 ). Deze laatste vertegenwoordigen waarschijnlijk verbindingen die A. tumefaciens C58 tegenkomen vóór infectie. Hoewel deze verbindingen niet geïdentificeerd werden en de differentiële afscheiding van specifieke wortel afgeleide verbindingen niet werd bepaald binnen de context van deze studie, demonstreerde de geheimanalyse detecteerbare verschillen in gastresecretieprofielen met gebruikmaking van dit hydroponische cocultivatiesysteem.
Figuur 9: A. thaliana Col-0 Root Secretome Analyse. Analyse van A. thaliana Col-0 secretome profielen werd in triplicaat voor mock-inoculated en inoculated samples voltooid. Hoogtepunten voor de 138 unieke massasignalen (verbindingen) die in de afscheidingsprofielen werden gevonden in elke behandelingsgroep werden gemiddeld gemeten, enDe gemiddelde waarden werden gebruikt om het verschil in overvloed van elke verbinding te berekenen (mock-inoculated minus inoculated) om verschillen in detecteerbare verbindingen te visualiseren. Verbindingen met grote negatieve verschilwaarden waren meer overvloedig in het geheim van ingeënte planten, terwijl die met grote positieve verschillen meer in het geheim van mock-geïnoculeerde planten waren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien de geleidelijke aard van wortelafscheiding, vinden de concentraties van virulentie-inducerende chemicaliën in planta en hun effecten op dynamische plant-microbe interacties plaats in ruimtelijke en temporale gradiënten. In dit hydroponische co-cultivatie systeem wordt geen synthetische fytohormoon of chemische stof die microbiële virulentie of plantenverdediging veroorzaakt, aangevuld. In tegenstelling hiermee, met behulp van conventionele benaderingen, voegt de toevoeging van synthetische chemicaliën, zoals acetosyringon, een plotselinge kunstmatige stijging toe in concentraties. Daarom naboots dit hydroponische cocultivatiesysteem het natuurlijk milieu, waar microbes en gastheerplanten op ruimtelijke en temporele manieren herkennen en reageren.
Hier was het mogelijk om aan te tonen dat Agrobacterium virulentie genen werden geactiveerd bij co-cultivatie met Arabidopsis . Dit suggereert dat natuurlijke plantaardige afkomstige chemicaliën Agrobacterium virulentie veroorzaken. Toekomstige eFfort is nodig om deze chemicaliën te identificeren en te verifiëren of de virulentie-inducerende verbinding acetosyringon erin bestaat. Daarnaast werden substantiële veranderingen in Arabidopsis- wortelgenuitdrukking en geheimprofielen waargenomen bij cocultivering met Agrobacterium , waarbij het potentieel van het hydroponische cocultivatiesysteem werd aangetoond om plantengasresponsen en afscheidingsprofielen tijdens plant-microbe-interacties te bestuderen. Met behulp van de hydroponische cocultivatietechniek kunnen genuitdrukkings- en secretome profielen van plantaardige hosts worden bestudeerd in elk stadium dat tot en met microbiële interactie leidt, wat zal helpen bij het verklaren hoe deze transcriptie- of secretomeveranderingen de volgende plant-microbe interacties vergemakkelijken of afbreken .
Naast het bestuderen van Arabidopsis - Agrobacterium signalering, kan het hydroponische cocultivatiesysteem aangepast worden om andere belangrijke plant-microbe systemen te bestuderen. Het kan gebruikt wordenToelichten van plantenresponsen op een grote verscheidenheid aan pathogene of voordelige micro-organismen die individueel of collectief optreden en microbiële binding en responsen op verschillende plantaardige hosts in relatief "natuurlijke" omstandigheden bestuderen. Het behoud van typische zaailing morfologie is belangrijk voor het verduidelijken van moleculaire plant-microbe interacties. Bij andere bacteriën, schimmels of herbivorische pathogenen kunnen aanvullende voedingsstoffen worden aangevuld om microbiële groei te ondersteunen tijdens de cocultivatie.
Er zijn echter een paar parameters om te overwegen voor cocultivatie met verschillende plant-microbe systemen. Afhankelijk van de grootte van de zaad en de wortelmorfologie kan het metalen gaas met grotere gaten en een grotere groeibouder nodig zijn voor grotere zaden en zaailingen om ervoor te zorgen dat wortelstructuren volledig ontwikkelen onder het gaasoppervlak en dat schieten weefsels hierover vermenigvuldigen. De installatie kan ook veranderd moeten worden om een hoger platform te omvatten. Dit zou kunnen worden bereikt bY snijd een groter vierkant maas en buig het verder van de hoeken om het maasoppervlak hoger van de bodem van de container te verhogen of door het mazen in de vorm van een Grieks kruis te snijden en elke klep aan de inkepingen te buigen. Natuurlijk zijn er beperkingen voor elk systeem, en de hier gepresenteerde waarde zal niet bruikbaar zijn voor grotere planten die langere perioden worden gekweekt ( bijvoorbeeld volwassen maïs). Bovendien kunnen sommige organismen meer beluchting vereisen dan bij het gebruik van dit systeem schudden.
Het is uiteraard heel moeilijk of zelfs onmogelijk om een systeem in een laboratorium te ontwerpen dat de dynamische plant-microbe-interacties die in de natuur voorkomen, precies en perfect repliceren. Hoewel de hydroponische cocultivering de natuurlijke omstandigheden in de rhizosfeer beter vertegenwoordigt, in ieder geval conceptueel, met intacte wortelstructuren en plantmorfologie, zijn er geen bodem- of bodemmicro-organismen in het systeem. Dit systeem kan echter aangepast wordenOm aan verschillende behoeften te voldoen, zoals om microbiomen in een beheersbare omgeving te bestuderen en te leren hoe planten of microben waarnemen en reageren op verschillende biotische of abiotische stimuli. Dit hydroponische cocultivatiesysteem kan ook het begrip van microbiomen en hun functies in hydroponica of ecosystemen vergemakkelijken. Dit is zeer belangrijk voor ziektebeheer en plantengezondheid voor de hydroponische broeikasindustrie of voor de aquatische ecologie van planten en microben.
Daarnaast kan dit hydroponische cocultivatiesysteem aangepast worden om bioremediëring te bestuderen en de relevante metabolische processen en regulerende pathways in microben of planten te verduidelijken. Bovendien vergemakkelijkt dit hydroponische cocultivatiesysteem onderzoek naar de effecten van pre-existing (allelochemicals) en / of toegepaste (synthetische) voedingsstoffen en chemische signalen / verbindingen op microben of plantaardige hosts 44 . De beschikbaarheid van plantweefsels indirect beïnvloedt ( dwz0; Blad, schiet) in het hydroponische cocultivatiesysteem biedt de mogelijkheid om andere plantenverdedigende processen, zoals plantenpompen, te onderzoeken en hoe deze signalen worden getransduceerd.
Het meest kritische deel van dit co-cultivatie systeem is het voorkomen van vervuiling. In het bijzonder moet de overdracht van planten uit het semi-vaste medium in de tank zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om de vervuiling van het hydropic medium te voorkomen. Het is daarom noodzakelijk dat deze experimentele stap onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast uitgevoerd wordt en experimenteren moeten 2-3 dagen na de overdracht wachten voordat enige micro-organismen voor het experiment worden ingeënt.
Samengevat vergemakkelijkt het hydroponische cocultivatiesysteem verschillende beperkingen van conventionele benaderingen door het behoud van typische plantmorfologie en de integriteit van plantaardige wortelstructuren gedurende het experimentele proces. Bovendien vermijdt het systeem het supplementatiOp synthetische chemicaliën, zoals plantaardige hormonen of verdovings- / virulentie-inducerende chemicaliën. Zo naboots het de natuurlijke omgeving nauwkeuriger, waar microbes en gastheerplanten op ruimtelijke en temporele manieren herkennen en reageren. Dit cocultivatiesysteem kan aangepast worden om verschillende plant-microbe systemen in meer "natuurlijke" en beheersbare omstandigheden te bestuderen, inclusief endofytische of epifytische microben. Verschillende aspecten van interacties in planta , zoals pathogenese, symbiose of plantengroeibevordering, kunnen worden onderzocht. Het hydroponische cocultivatiesysteem biedt nieuwe inzichten in de fysiologische, biochemische en moleculaire reacties van zowel planten als microben. Bij een bepaald tijdstip / interval of groeistadium kunnen bacteriën of planten die groeien in het hydroponische cocultivatiesysteem afzonderlijk worden bemonsterd voor diverse "omics" -analyses, waaronder plant- en microbiële transcriptomics, plant- en microbiële metabolomics, plant- en microbiële secretomie en bioremediatieop. Bovendien kan dit hydroponische co-verbouwingssysteem aangepast worden om de interacties tussen plantenheren en microbiomen in een beheersbare omgeving te bestuderen. Samenvattend illustreren de voordelen van de hydroponische cocultivatie een superieure systeem voor het onthullen van moleculaire plant-microbe interactie en signalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Brian Weselowski en Alexander W. Eastman voor hun hulp en nuttige discussie. We willen ook Drs bedanken. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui en Greg Thorn voor hun hulp, nuttige discussies en kritisch lezen van het manuscript. Dit onderzoek is gefinancierd door Agriculture and Agri-Food Canada, Growing Forward-AgriFlex (RBPI nummer 2555) en Growing Forward II project nummer 1670, dat door de auteurs als onderdeel van hun taken wordt uitgevoerd. Deze studie werd ook gedeeltelijk gefinancierd door de Natuurwetenschappen en Technische Onderzoeksraad van Canada (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 toegekend aan ZC Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
- Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
- Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
- Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
- Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
- Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
- Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
- Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- Gelvin, S. B.
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
- Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
- Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
- Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
- Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
- Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
- Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
- León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J.
- Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
- Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
- Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
- Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
- Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
- Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
- Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
- Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
- Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).
