Summary
O sistema de cocultivação hidropônico descrito suporta plantas intactas com telas de malha metálica e as coculata com bactérias. O tecido vegetal, as bactérias e as moléculas segregadas podem então ser colhidas separadamente para análises a jusante, permitindo simultaneamente que as respostas moleculares de ambos os hospedeiros de plantas e micróbios ou microbiomas interativos sejam investigadas.
Abstract
Um projeto experimental que imita as interações planta-microbio natural é muito importante para delinear os complexos processos de sinalização de plantas e micróbios. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Fornece um excelente sistema modelo para estudar a patogênese bacteriana e as interações das plantas. Estudos prévios das interações de plantas e antibacterianos dependeram em grande parte das culturas de suspensão de células vegetais, do ferimento artificial de plantas ou da indução artificial de fatores de virulência microbiana ou defesas de plantas por produtos químicos sintéticos. No entanto, esses métodos são distintos da sinalização natural in planta , onde plantas e micróbios reconhecem e respondem de maneiras espaciais e temporais. Este trabalho apresenta um sistema de cocultivação hidropônica onde as plantas intactas são suportadas por telas de malha metálica e coculadas com Agrobacterium . Neste sistema de cocultivação, nenhuma fitohormona sintética ou química que induz micr.A virulência obial ou a defesa da planta são complementadas. O sistema de cocultivação hidropônica parece muito parecido com as interações planta-micróbio natural e sinalização da homeostase na planta . As raízes das plantas podem ser separadas do meio contendo Agrobacterium , e a sinalização e as respostas dos hospedeiros da planta e dos micróbios que interagem podem ser investigadas simultaneamente e sistematicamente. Em qualquer ponto / intervalo de tempo dado, os tecidos ou bactérias da planta podem ser colhidos separadamente para várias análises "ôticas", demonstrando o poder e a eficácia deste sistema. O sistema de co-cultura hidropónica pode ser facilmente adaptado para estudar: 1) a sinalização recíproca dos diversos sistemas de planta e microorganismos, 2) a sinalização entre uma planta hospedeira e várias espécies microbianas (ou seja consórcio microbiano ou microbiomas), 3) como nutrientes e produtos químicos estão implicados Na sinalização de microbios vegetais e 4) como os micróbios interagem com os hospedeiros da planta e contribuem para a tolerância das plantas ao biotico oEstresses abióticos.
Introduction
Os micróbios associados à planta desempenham papéis importantes no ciclismo biogeoquimico, na biorremediação, na mitigação das alterações climáticas, no crescimento e na saúde das plantas e na tolerância das plantas aos estresses bióticos e abióticos. Os microorganismos interagem com as plantas diretamente através do contato da parede celular da planta e indiretamente através de secreção química e sinalização 1 , 2 , 3 . Como organismos sésseis, as plantas desenvolveram mecanismos diretos e indiretos para resistir à infecção por agentes patogênicos. As defesas diretas incluem defesas estruturais e a expressão de proteínas de defesa, enquanto que as defesas indiretas incluem a produção secundária de metabólitos das plantas e a atração de organismos antagônicos aos patógenos invasores 4 , 5 . Os exsudados de raiz derivados de plantas, secreções, mucilagens, mucigel e lisados alteram as propriedades físico-químicas da rizosfera para atrair ou repelirMicróbios em relação aos seus anfitriões 6 . A composição química da secreção de raízes é específica da espécie, servindo assim como um filtro seletivo que permite que certos microrganismos capazes de reconhecer esses compostos florescerem na rizósfera 6 . Assim, espécies microbianas compatíveis podem ser estimuladas para ativar e melhorar suas associações, quer para benefício ou prejuízo do hospedeiro da planta 1 .
Compreender as interações planta-microbio na rizósfera é fundamental para melhorar a produtividade da planta e o funcionamento do ecossistema, uma vez que a maioria da exposição microbiana e química ocorre na estrutura radicular e na interface solo-ar 2 , 6 , 7 , 8 . No entanto, o exame das interações subterrâneas de plantas e micróbios e respostas recíprocas tem sido um desafio devido à sua intrigante Natureza complexa e dinâmica e falta de modelos experimentais adequados com estrutura radicular natural e morfologia da planta sob condições de crescimento bem controláveis. Como um dos agentes farmacêuticos mais bem estudados, Agrobacterium infecta uma grande variedade de plantas com importância agrícola e horticultural, incluindo cereja, maçã, pera, uva e rosa 9 . Agrobacterium é um organismo modelo importante para a compreensão das interações planta-patógeno e é uma ferramenta poderosa na transformação de plantas e engenharia de plantas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
As interacções Molecular Plant- Agrobacterium foram bem estudadas há várias décadas e a compreensão atual da patogenicidade de Agrobacterium é extensa 9 ,F. "> 11 , 15 , 16. A patogenicidade de Agrobacterium é em grande parte atribuída às suas capacidades evoluídas de percepção de sinais derivados de plantas, resultando na modulação fina de seu programa de virulência e comunicação célula a célula, o chamado sensor de quorum 17 . O programa Agrobacterium virulence é regulado por vários sinais disponíveis na rizosfera e envolve dois conjuntos de sistemas de 2 componentes, o sistema ChvG / I eo sistema VirA / G. As condições ácidas na rizósfera ativam a transcrição de chvG / I , virA / G , E vários outros genes envolvidos na patogenicidade de Agrobacterium , incluindo virE0 , virE1 , virH1 , virH2 e genes do sistema de secreção de tipo VI (T6SS) 18. Compostos fenólicos derivados de plantas, incluindo a aceossiringona (4'-hidroxi-3 ', 5 '-dimetoxiacetofenona), ative o VSistema IrA / G de 2 componentes através de mecanismos de sinalização de fosforilação 19 . VirA / G ativa então todo o regulador vir , resultando na transferência e integração de um fragmento de DNA bacteriano de ~ 20 kb chamado DNA de transferência (DNA-T) do plasmídeo indutor de tumor (Ti) para o núcleo da planta 16 . T-DNA carrega genes responsáveis pela síntese dos hormônios vegetais ácido indol-3-acético (IAA) ( iaaM e iaaH ) e citoquinina ( ipt ), e uma vez expressa em células vegetais, produzem-se grandes quantidades dessas fitohormonas. Isso resulta em proliferação anormal de tecidos e desenvolvimento de tumores vegetais, conhecida como doença coronária, que é um problema crônico e ressurgente para as plantas 9 , 11 , 20 . IAA também atua coletivamente com ácido salicílico e ácido gamma-amino butírico para reprimir a virulência de Agrobacterium ou para reduzir Agrobacteriu M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Para contrariar essa repressão, o T-DNA também contém genes para a biossíntese de opina, que ativa o Agrobacterium quorum detectando para promover a patogenicidade de Agrobacterium e também serve como fonte de nutrientes para o patógeno 22 , 23 .
Apesar de uma compreensão geral e profunda das interações de plantas de Agrobacterium e da transferência de T-DNA resultante para o hospedeiro da planta, os complexos eventos de sinalização na fase inicial de interação são menos bem compreendidos. Isto é parcialmente devido às limitações das abordagens convencionais para investigar a sinalização das plantas de Agrobacterium . As culturas em suspensão de células vegetais e os ferimentos artificiais específicos do local são comumente usados para estudar interações moleculares de plantas e micróbios 24 ,. ef "> 26, 27 No entanto, as suspensões de células não possuem morfologia da planta normal, em particular, as células em suspensão planta não tem estruturas de raiz e exsudatos de raízes, que são muito importantes para a activação de quimiotaxia microbiana e virulência 28, 29 A manutenção da morfologia da planta. E a estrutura da raiz foi abordada por feridas artificiais, o que facilita a infecção específica do local, resultando na detecção de genes induzidos por defesa da planta em tecido de plantas infectadas diretamente 30 , 31. Contudo, o ferimento artificial é significativamente diferente da infecção por patógenos na natureza , Particularmente como ferimento leva ao acúmulo de ácido jasmônico (JA), que interfere sistematicamente com a sinalização e defesa de plantas naturais 26. Além disso, os produtos químicos sintéticos são tipicamente usados para induzir artificialmente as respostas do hospedeiro da plantaOu virulência de patógenos. Embora seja possível a suplementação de compostos químicos que refletem as concentrações em planta , essa suplementação não explica gradualmente a difusão de exsudatos radiculares na rizósfera circundante, o que gera um gradiente quimiotático detectado pelos micróbios 28 , 32 . Dadas as limitações das abordagens convencionais para estudar as interações planta-microbio, a precisão e a profundidade dos dados obtidos podem ser impedidas e restritivas e o conhecimento gerado a partir das abordagens convencionais pode não se traduz diretamente na planta . Muitos aspectos da sinalização das plantas - Agrobacterium ainda não são totalmente compreendidos, particularmente no estágio inicial das interações, quando os sintomas da doença ainda não se desenvolveram.
Para alterar as limitações das abordagens convencionais, este trabalho apresenta um c hidroponico barato, bem controlável e flexívelSistema de ocultivação que permite aos pesquisadores obter informações mais aprofundadas sobre as vias complexas de sinalização e resposta no estágio inicial das interações de plantas-micróbios moleculares. O hidroponia tem sido amplamente utilizado para estudar nutrientes de plantas, exsudatos radiculares, condições de crescimento e os efeitos da toxicidade metálica nas plantas 33 , 34 . Existem várias vantagens dos modelos hidropônicos, incluindo os pequenos requisitos espaciais, a acessibilidade de vários tecidos vegetais, o controle rigoroso das condições nutrientes / ambientais e o controle de pragas / doenças. Os sistemas hidropônicos também são menos limitantes para o crescimento das plantas em comparação com as técnicas de revestimento em ágar / fitoagulação, que geralmente restringem o crescimento após 2-3 semanas. Importante, a manutenção de estruturas de plantas inteiras facilita a secreção de raízes naturais necessárias para a quimiotaxia microbiana e indução de virulência 8 , 29 . O sistema descriA cama aqui é mais simples e menos intensiva em mão-de-obra do que as alternativas 33 , 34 . Ele usa menos peças e não requer ferramentas além das tesouras padrão. Ele usa malha de metal (em oposição ao nylon 33 ) como um forte suporte para o crescimento da planta e um método simples de aeração sob condições estéreis através de agitação para suportar o crescimento microbiano. Além disso, o sistema pode usar malhas metálicas de vários tamanhos para suportar o crescimento da planta, que acomoda diversas espécies de plantas sem restringir a largura de suas raízes.
No sistema de cocultivação hidropônica apresentado aqui, as plantas são cultivadas em um sistema hidropônico estéril onde as raízes das plantas secretam compostos orgânicos que suportam o crescimento de bactérias inoculadas. Neste sistema de cocultivação, não são suplementados produtos químicos artificiais, como hormonas de plantas, elicitores de defesa ou produtos químicos indutores de virulência, que refletem a célula natural- assinalando a homeostase durante as interações planta-micróbio. Com este sistema de cocultivação hidropônica, foi possível determinar simultaneamente a expressão gênica no tecido da raiz de Col-0 de Arabidopsis thaliana após a infecção por Agrobacterium , bem como a ativação de genes de Agrobacterium após a cocultivação com Arabidopsis . Demonstrou-se ainda que este sistema é adequado para estudar a ligação de Agrobacterium às raízes das plantas, bem como o perfil secreto da raiz da planta, após a cocultivação (infecção) com Agrobacterium ( Figura 1 ).
Figura 1: Visão geral do sistema de cocultivação hidropônica, com análises de amostras. As plantas são cultivadas em cima da malha (brotos acima da malha), com as raízes imersas em meio hidropônico que é então inoculado com bactérias fOu coculture. Os tecidos vegetais e as bactérias são então separados para extrações e análises simultâneas. Esta figura foi modificada a partir da referência 35 .
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Protocol
1. Planejamento Experimental
- Determine os objetivos específicos da experiência.
- Leia todo o protocolo abaixo. Determine quais seções são relevantes para os objetivos específicos e se as modificações precisam ser feitas. Veja abaixo exemplos.
- Considere se as experiências usarão plantas de A. thaliana e bactéria de A. tumefaciens , como abaixo, ou outra combinação planta-micróbio.
NOTA: Embora várias espécies de plantas possam ser utilizadas, a espessura das raízes da planta pode exigir uma malha de tamanho diferente (etapa 3.3) e os parâmetros de crescimento (etapas 3.10-3.11 e 4.4) e tamanho do tanque hidropônico e volume médio (passo 4.2) também pode exigir o ajuste ( Figura 2 ). Os micróbios podem ser facilmente inoculados como culturas puras, espécies misturadas (consórcios), ou de amostras ambientais (microbiomas), mas qualquer alteração pode afetar o protocolo, particularmente o passo 4.5. - Considere aTipos de experimentos que serão usados para analisar as amostras.
NOTA: A microscopia de fluorescência (passo 5) requer organismos que são rotulados com uma construção repórter fluorescente.
- Considere se as experiências usarão plantas de A. thaliana e bactéria de A. tumefaciens , como abaixo, ou outra combinação planta-micróbio.
- Designe controles apropriados. Inclua tanques hidropônicos sem mudas que são inoculados com bactérias de controle e tanques com mudas de controle que não são inoculadas com bactérias.
- Planeje experiências com o número apropriado de sementes e tanques hidropônicos. Considere controles, replicações biológicas (3 no mínimo) e quantidades de tecido necessárias para todas as análises.
- Determine o comprimento apropriado de cocultivação para os objetivos experimentais (passo 4.8).
- Revise as etapas abaixo, conforme necessário.
Figura 2. Exemplos de outras plantas que poderiam ser cultivadas no sistema hidropônico, suportadas por um P Latform of Metal Mesh. Compatibilidade de um conjunto de malhas metálicas para uma variedade de sementes e cultivo de plantas. ( A ) Aço inoxidável tipo 304 soldas 3x3 mesh x .047 "fio de diâmetro para Vicia faba . ( B ) aço inoxidável tipo 304 weldmesh 4 × 4 mesh x .035" fio de diâmetro para Zea mays . ( C ) Fibra de aço inoxidável tipo 304 4 × 4 mesh x .032 "fio de diâmetro para Glycine max (soja). ( D ) aço inoxidável tipo 304 solda 6x6 mesh x .047" fio de diâmetro para Raphanus sativus (inverno rabanete). ( E ) Fibra de aço inoxidável tipo 304 de aço inoxidável 6 × 6 mesh x .047 "fio de diâmetro para Triticum spp. ( F ) Fio de aço inoxidável tipo 304 soldado 6 × 6 mesh × .035" fio de diâmetro para Cucumis sativus . Esta figura foi modificada a partir da referência 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
2. Esterilização da superfície das sementes de plantas
- Vortex (a alta velocidade) aproximadamente 200 sementes de A. thaliana com 500 μL de água desionizada em um tubo de microcentrífuga. Para espécies de plantas com sementes maiores, use um tubo grande para facilitar a esterilização da superfície.
- Centrifugue isso em aproximadamente 9.000 xg por 30 s em uma microcentrífuga de mesa. Remova a água (sobrenadante) usando uma pipeta.
- Adicione 300 μL de hipoclorito de sódio a 2% às sementes e ao vórtice. Deixe à temperatura ambiente durante 1 min. Para espécies de plantas com sementes maiores, use volumes maiores para cobrir as sementes.
- Centrifugar aproximadamente 9,000 xg por 30 s em uma microcentrífuga de mesa. Remova a solução de hipoclorito de sódio usando uma pipeta.
- Adicione 500 μL de água esterilizada e desionizada às sementes e ao vórtice. Centrifugar aproximadamente 9.000 xg para30 s e remova a água usando uma pipeta estéril.
- Repita a etapa 2.5 mais 4 vezes.
- Adicione 500 μL de etanol a 70% às sementes e ao vórtice. Deixe à temperatura ambiente durante 1 min.
- Centrifugar aproximadamente 9,000 xg por 30 s em uma microcentrífuga de mesa. Remova o etanol a 70% com uma pipeta.
- Repita a etapa 2.5 mais 5 vezes.
- Ressuspender as sementes esterilizadas em 500 μL de água estéril e ultrapura.
3. Germinação de sementes e cultivo semi-sólido de plantas
- Preparar meio semi-sólido Murashige e Skoog (MS): 2.165 g / L MS sais basais; 10 g / L de sacarose; 0,25 g / L MES; E 59 mL / L de mistura de vitamina B5, pH 5,75, com 4 g / L de fitofoma.
- Autoclave o meio MS. Despeje 25 mL em cada placa de Petri profunda estéril (100 x 25 mm 2 ).
- Para cada prato de Petri, corte um quadrado de 90 x 90 mm de malha de aço inoxidável.
NOTA: A malha recomendada para A. thaliana < / Em> tem um grau de 304 (grau padrão), contagem de malha (número de furos por polegada linear) de 40 x 40 e um diâmetro de fio de 0,01 "(0,0254 cm). É necessário um quadrado de malha maior para tanques hidropínicos maiores Ou plataformas mais elevadas. - Dobre os cantos de cada malha quadrada apenas o suficiente para que a malha se encaixe dentro da placa de Petri. Dobre os cantos em um ângulo de 90 ° para a maior parte da malha para permitir que a malha seja apoiada pelos cantos, deixando espaço suficiente para o desenvolvimento da raiz ( Figura 3a ).
- Coloque os quadrados de malha cortados em uma taça, cubra com papel alumínio e esterilize-se por autoclave usando um ciclo seco de 30 min.
- Uma vez que o meio se solidifique nas placas de Petri e a malha é estéril, coloque cada quadrado de malha esterilizada sobre o meio semi-sólido, com os cantos dobrados voltados para baixo.
- Empurre a malha para que os cantos penetrem no meio e a maior parte da malha toca a superfície superior do meio (> Figura 3b).
- Use uma pipeta de transferência de 200 μL para elaborar sementes individuais de esterilização de A. thaliana (as sementes permanecerão na ponta da pipeta devido à força do vácuo) e transferir cuidadosamente cada semente na parte superior da malha. Coloque as sementes para que elas estejam adequadamente apropriadas para necessidades experimentais ( por exemplo, 4 6 sementes / placa).
- Selar as placas de Petri com tampas, colocando fita cirúrgica porosa nas bordas.
- Estratificar as sementes colocando toda a placa de Petri a 4 ° C durante 2 dias no escuro ( por exemplo, envolva em papel alumínio para simular a escuridão).
- Cultive as sementes na placa de Petri a 22-24 ° C com um fotoperíodo de 16 h por 10-14 dias ( Figura 3c ).
Figura 3: Sistema de cocultivação com micróbios hidropônicos. O pa esquerdaNel representa um fluxograma que descreve as seis etapas principais na montagem e operação do sistema de co-cultivo hidropônico. O painel direito demonstra os materiais experimentais reais, equipamentos e procedimentos operacionais para o sistema de cocultivação hidropônica ao estudar as interações Arabidopsis-Agrobacterium . O passo de inoculação e o passo final para amostragem vegetal ou bacteriana são agora mostrados. Esta figura foi modificada a partir da referência 35 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Sistema de cocultivação hidropônica
- Prepare meio líquido Murashige e Skoog (MS): 2.165 g / L de sais basais de MS, sacarose a 10 g / L, MES a 0,25 g / L e mistura vitamínica B5 de 59 mL / L, pH 5,75.
- Autoclave o meio. Despeje 18 ml de dentro de cada vidro cilíndrico estéril ou tanque de plástico transparente (pratos de cristalização, 100 x 80 mm2) com tampas estéreis.
NOTA: Preserlicize os tanques e as tampas, envolvendo-as em papel alumínio e em autoclave. - Em uma capa de fluxo esterilizada, use fórceps estéreis para transferir suavemente cada quadrado de malha com mudas de 10-14 dias do meio semi-sólido para um tanque cilíndrico hidropônico ( Figura 3d ). Selar as tampas nos tanques usando fita cirúrgica porosa.
- Cultive as mudas na malha no tanque por 72 h a 22-24 ° C, com um fotoperíodo de 16 h e agitando a 50 rpm para aeração ( Figura 3e ).
NOTA: Isso permite que as plantas se adaptem ao ambiente hidropônico antes da inoculação (cocultivação) com microorganismos. Este período de espera também permitirá que a contaminação microbiana acidental seja aparente antes da inoculação.- Comece o próximo passo no dia anterior ao final do período de incubação.
- Crescer A. tumefaciens em meio AB(0,5% w / extracto v de levedura, 0,5% w / v de triptona, 0,5% w / v de sucrose, MgSO4 50 mM, pH 7,0) a 28 ° C com agitação durante a noite, até a cultura atingir uma densidade óptica final de 1,0 a 600 Nm (OD 600 ), medido usando um espectrofotômetro, com meio AB não inoculado como um branco.
NOTA: Uma OD 600 de 1.0 é equivalente a aproximadamente 10 9 células / mL. - Lave o A. tumefaciens três vezes em um volume igual de 0,85% de NaCl. Ressuspender em um volume igual de água destilada estéril.
- Antes da inoculação, examine cuidadosamente o tanque com mudas para garantir que não haja contaminação; O meio nos tanques não contaminados deve ser claro e transparente.
- Descarte qualquer tanque com líquido nublado (contaminação) e conte o resto dos tanques. Mude uma pequena quantidade (20 μL) de meio hidropônico de cada tanque numerado e localmente em uma placa de Petri cheia com caldo de Luria (LB). IncubarO prato a 28 ° C.
- Imediatamente, adicione 50 μL da suspensão de A. tumefaciens (aproximadamente 5 x 10 7 células, estimadas a partir da OD 600 ) em cada tanque hidropônico numerado. Cocultivar as mudas de A. thaliana e A. tumefaciens a 22-24 ° C com fotoperíodo de 16 h e agitação a 50 rpm ( Figura 3f ).
- Examine a placa LB manchada a partir do passo 4.7.1. Após 12 e 28 h de incubação para verificar a esterilidade dos tanques. Se houver qualquer contaminação, não use o tanque numerado correspondente (inoculado com bactérias) para outros ensaios a jusante.
- Se desejado, monitore o crescimento de A. tumefaciens em intervalos regulares, removendo uma amostra de meio do tanque e medindo a OD 600 usando um espectrofotômetro com meio de um controle não inoculado como vazio ( Figura 4 ).
NÃOTE: Os sintomas da doença da planta devem ser evidentes após 7 d ( Figura 5 ). - Separar as raízes de A. thaliana da suspensão bacteriana levantando a placa de malha; O tempo deste passo depende dos processos a jusante. Veja os passos 5-8 para obter detalhes.
- Se estiver usando raízes para análises subsequentes, enxágue rapidamente as raízes em água de dupla destilação. Se estiver usando folha ou outro tecido, corte o tecido. Para análises de ARN, avance imediatamente para o passo 7.1.
Figura 4: Crescimento de Agrobacterium no Sistema de Cocultivação Hidropônica. O crescimento de Agrobacterium na presença ou ausência de um hospedeiro vegetal ( Arabidopsis ) foi monitorado a cada 4 h. As células de Agrobacterium foram cultivadas em meio AB médio O / N, lavou-se 3x com NaCl a 0,85% e foi inoculado no sistema hidropônico, com ou wSem cultivo de Arabidopsis , a partir de uma OD 600 inicial de cerca de 0,1. Os valores de OD 600 são o meio de três repetições biológicas, com desvios padrão ( OD 600 de 1,0 = 1 x 10 9 células / mL).
Figura 5: Fenômenos de plantas representativos e sintomas de doenças observáveis durante a cocultivação. Dentro de 4 d após a inoculação, nenhum sintoma de doença é visível ( A ) em comparação com plantas não inoculadas ( B ). Após 7 d de Cocultivação (infecção), os sintomas da doença são observados em plantas infectadas ( C ), enquanto as plantas não inoculadas permanecem saudáveis ( D ).
5. Microscopia de fluorescência
- Use A. tumefaciens que abriga uma construção repórter para uma proteína autofluorescente paraA configuração de cocultivação no passo 4.5 .
NOTA: Um plasmídeo pJP2 modificado que expressa pCherry, um derivado de dsRed 36 , é usado aqui. - Após um co-cultivo apropriado ( por exemplo, 48 h) no passo 4.8, separe as raízes secundárias individuais (ramos laterais da raiz principal) usando tesouras estéril.
- Enxaguar as raízes em água duplamente destilada para remover o material livremente encadernado. Submergir cada raiz em 30 μL de água em um slide de microscópio e cobrir com uma lamínula de vidro.
- Selar as bordas da lamínula com esmalte de unhas para evitar a desidratação das raízes.
- Visualize o anexo de A. tumefaciens às raízes de A. thaliana por microscopia de fluorescência.
NOTA: Aqui, um microscópio confocal com excitação a partir de um laser de Helium-Neon (He-Ne) 543/594 nm é usado para visualizar a fluorescência vermelha em 590-630 nm sob um objetivo invertido de lente de água 63X com uma abertura numérica de 1,4 (
Figura 6: Anexo de Raiz de Agrobacterium , Determinado por Microscopia Confocal. O Agrobacterium rotulado com fluorescência vermelha de pCherry foi visualizado a 590-630 nm, com excitação de um laser de Helium-Neon (He-Ne) 543/594 nm. A visualização foi realizada sob um objetivo invertido de lente de água 63X com uma abertura numérica de 1,4. Barras de escala = 11 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Análises de Transcritas Bacterianas
- Após uma co-cultura adequada ( por exemplo, 8 h) no passo 4.8, separe as raízes do meio hidropónico como no passo 4.9. Transfira 1,5 mL do meio hidropônico para um microato de 1,5 mLTubo de centrífuga e centrifugação a 12 000 xg durante 2 minutos para sedimentar as células.
- Remova o sobrenadante. Transferir mais 1,5 mL do meio hidropónico para o mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugar a 12 000 g durante 2 minutos para sedimentar as células.
- Remova o sobrenadante.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando as amostras a -80 ° C até o uso. - Extrair o ARN das células de A. tumefaciens utilizando métodos padrão 37 ou um kit de purificação e purificação de ARN comercial adequado com tratamento de DNase para evitar a contaminação por DNA.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando alíquotas de ARN a -80 ° C até o uso. - Use o RNA isolado para uma variedade de análises usando métodos padrão, incluindo o seguinte.
- Use um microarray comercial de acordo com o protocolo do fabricante para detectar conjuntos de genes que são diferencialmente expressos em cocultivados versus controlecultura.
- Use uma Reação em cadeia quantitativa em tempo real da polimerase (qRT-PCR) para detectar a expressão de genes específicos ou para validar dados de microarrays 38 .
7. Análises da Transcrição da Planta
- Após uma cocultivação adequada ( por exemplo, 8 h) no passo 4.8, separe as raízes do meio hidropônico, como no passo 4.9, ou separe outros tecidos conforme necessário. Imediatamente, coloque aproximadamente 150 mg de raízes ou outros tecidos vegetais em nitrogênio líquido.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando as amostras a -80 ° C até o uso. - Moer as amostras congeladas para um pó em nitrogênio líquido usando uma argamassa e pilão.
- Extrair o ARN do pó usando métodos padrão 39 ou um kit de purificação e purificação de ARN comercial adequado com tratamento de DNase para evitar a contaminação do DNA.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui congelando alíquotas de RNA no-80 ° C até o uso. - Use o RNA isolado para uma variedade de análises usando métodos padrão, incluindo o seguinte.
- Use um microarray comercial de acordo com o protocolo do fabricante para detectar conjuntos de genes que são diferencialmente expressos nas plantas co-cultivadas versus controle.
- Use qRT-PCR para detectar a expressão diferencial de genes específicos ou para validar dados de microarrays 38 .
8. Perfil do Secretome
- Seguindo um co-cultivo apropriado ( por exemplo, 72 h) no passo 4.8, separe as raízes do meio hidropónico como no passo 4.9. Esterilize os 18 mL de meio hidropônico passando-o através de um filtro de poro de 0,2 μm para tubos cônicos de 50 mL.
- Congele as amostras a -80 ° CO / N.
- Solte as tampas nos tubos cônicos de 50 mL e coloque-os em uma máquina de liofilização por 36 h. Proceda para armazenar ou processar as amostras (como desCribado abaixo) para análise de HPLC e detecção de compostos.
NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. - Ressuspender cada amostra em 5 mL de água destilada no tubo de ensaio selável.
- Adicione 5 mL de acetato de etilo e misture invando o tubo várias vezes.
- Permitir que as fases se separem à temperatura ambiente durante 5 min.
- Transfira a parte superior (fase orgânica) para um novo recipiente por pipetagem. Se necessário, coloque múltiplas frações orgânicas.
- Secar sob um fluxo suave de gás nitrogênio (~ 45 min).
- Re-suspenda a amostra em uma solução apropriada para HPLC ( por exemplo, 100% de metanol).
- Execute HPLC de acordo com métodos padrão 40 .
- Detectar compostos por meios apropriados.
NOTA: A Espectrometria de Massa de Tempo de Vôo de Ionização por Eletropray (ESI-TOF-MS) 40 é usada aqui.
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Representative Results
Crescimento no sistema de co-cultivo hidropônico
A curva de crescimento de A. tumefaciens C58 demonstrou uma fase de atraso significativo no inicial 16 h de co-cultura, seguido por um crescimento muito estável quando co-cultivadas com A. thaliana Col-0, até uma OD máxima de 600 de cerca de 0,9 a partir de 48 horas pós-inoculação. Em contraste, essencialmente nenhum crescimento bacteriano foi observado na cultura de controle sem A. thaliana ( Figura 4 ). Esses resultados sugerem que, sem nutrientes adicionais fornecidos artificialmente, os compostos químicos secretos das raízes da planta são capazes de suportar o crescimento de Agrobacterium no sistema de cocultivação hidropônica. A fase de atraso significativo durante as 16 horas iniciais de cocultivação pode ser atribuída à percepção de hospedeiro bastante complexa e à secreção gradual das raízes após a cocultivação com o patógeno. </ P>
As plantas de A. thaliana cocultivadas não apresentaram sintomas de doença durante os primeiros 3 dias, em relação às plantas de controle cultivadas na ausência de A. tumefaciens ( Figura 5a , 5b ). No entanto, após 5 dias de cocultivação, as diferenças gradualmente tornaram-se visíveis e as plantas de controle tratadas simuladas foram mais verdes e saudáveis. Após 7 dias de cocultivação com Agrobacterium , o tecido vegetal apresentou clorose e necrose, bem como floração precoce ( Figura 5 c, 5 d ). A floração precoce em Arabidopsis é uma conseqüência geral da infecção por uma variedade de patógenos filogenéticamente dispares 41 , 42 .
Visualização microscópica da ligação de Agrobacterium às raízes das plantas
A. tumefaciens marcado com fluorescência vermelha de pherheria foi localizado na estrutura da raiz da planta com uma forma típica de haste ou filamentosa, aproximadamente 0,5 μm de largura e 3-5 μm de comprimento ( Figura 6 ). A maioria das células bacterianas foi fixada verticalmente à superfície da parede celular radicular, de acordo com descobertas anteriores de que Agrobacterium se liga à parede celular de forma polar 32 .
Esses resultados sugerem que o sistema de cocultivação hidropônica pode ser usado para estudar a dinâmica bacteriana em planta , como a fixação à estrutura radicular e ao processo de infecção, em tempo real. Na verdade, na ausência de outros micróbios, este sistema de cocultivação fornece uma plataforma livre de ruído para a observação direta do anexo da bactéria e planta na planta . Ativação de transcrições de Agrobacterium virulence
Após 8 h de cocultivação, as células de A. tumefaciens foram colhidas para isolamento de RNA e os níveis de transcrição dos genes de virulência representativos foram avaliados por qRT-PCR ( Figura 7 ). A expressão dos genes de virulência ropB, virA, virD1, virH1, virE0 e chvG foi significativamente aumentada durante a co-cultura com o hospedeiro da planta, em comparação com o controle sem A. thaliana . Especificamente, a abundância de mRNA aumentou em 100% para chvG , em 70% para virD1 , em 94% para virA , em 40% para virE0 , em 330% para ropB e em 48% para virH1 .
Estes resultados sugerem que, sem suplementoCom produtos químicos indutores de virulência sintética, plantas que secretam produtos químicos no sistema de cocultivação hidropônica são capazes de ativar a programação de Agrobacterium virulence. A indução de genes de virulência de Agrobacterium é indicativa da resposta de Agrobacteria a sinais derivados de plantas no sistema de cocultivação hidropônica. É muito interessante que Agrobacterium ropB e chvG sejam induzidos após a cocultivação com Arabidopsis, como estudos anteriores indicaram que esses genes são induzidos por condições ácidas 18 , mas não por acetosiringona, um conhecido composto indutor de virulência 19 . Este resultado sugere que os compostos não identificados a partir de raízes de Arabidopsis são capazes de induzir a expressão ropB e chvG. Contudo, esses produtos químicos que induzem a virulência devem ser identificados.
Figura 7. Ativação de Agrobacterium Virulence no Sistema de Cocultivação Hidropônica. Os níveis de mRNA de seis fatores de virulência de Agrobacterium foram medidos quantitativamente por qRT-PCR. A abundância de transcritos do factor de virulência foi normalizada para a transcrita do ARS 16S. Os dados representam a média ± desvio padrão (barras de erro) de 3 repetições biológicas, com valores de P obtidos pelo teste t de estudante.
Expressão de transcrições de plantas
A análise de qRT-PCR foi realizada para cinco genes que anteriormente eram mostrados de forma diferencial em A. thaliana (dados não publicados). Como esperado, qRT-PCR confirmou que AGP 30 (AT2G33790) e NAS 1 (AT5G04950) foram downregulated (97 e 89%, respectivamente) enquanto que HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) e ELIP 1 (AT3G22840) foram regulados positivamente (em 3.800, 540 e 510%, respectivamente) em cada uma das 3 repetições versus os controles ( Figura 8 ).
Figura 8: qRT-PCR de A. Thaliana Root Transcripts. A abundância de cada transcrição de ARNm foi normalizada para a transcrição A ACTIN II. Os dados são as médias de 3 repetições biológicas ± o desvio padrão (barras de erro), com os valores de P obtidos pelo teste t de Student.
Alterações nos perfis de secreção do hospedeiro
Os compostos derivados de raízes demonstraram que diferem em grande parte entre as espécies de plantas 6 , 8 . RoOs exsudados incluem sinais moleculares que suscitam várias respostas de sinalização durante as interações plantas-micróbios 1 , 43 . No entanto, as diferenças progressivas nos perfis de secreção do hospedeiro ao longo do tempo após a interação dos micróbios são muito menos compreendidas, exceto que os compostos secrecionados por raízes são imperativos para a atração de bactérias benéficas 29 . Após 72 h de cocultivação com A. tumefaciens C58, as diferenças nos perfis de segredo de A. thaliana Col-0 foram estabelecidas usando análise de LC-MS de modo iônico positivo e comparações com A. thaliana Col-0 não inoculado ( isto é, na ausência de Agrobacterium ). Observou-se uma mudança clara no secretome, com novos compostos que aparecem como resultado da inoculação de Agrobacterium ( Figura 9 ). No total, 35 compostos foram comparativamente aumentados no esquema secreto do plano secreto de AgrobacteriumTs, enquanto 76 foram aprimorados no secretome de plantas não inoculadas ( Figura 9 ). Este último provavelmente representa compostos que A. tumefaciens C58 encontro antes da infecção. Embora estes compostos não tenham sido identificados e a secreção diferencial de compostos derivados específicos de raiz não tenha sido determinada no contexto deste estudo, a análise do secretome demonstrou diferenças detectáveis nos perfis de secreção de hospedeiro utilizando este sistema de cocultivação hidropônica.
Figura 9: Análise do segredo da raiz Colour de A. thaliana . A análise dos perfis de segredo Colth-0 de A. thaliana foi completada em triplicado para amostras simuladas e inoculadas. As áreas de pico para os 138 sinais de massa únicos (compostos) encontrados nos perfis de secreção em cada grupo de tratamento foram médias eOs valores médios foram utilizados para calcular a diferença na abundância de cada composto (inoculado sem inoculação menos inoculado) para visualizar diferenças em compostos detectáveis. Os compostos com grandes valores de diferença negativa foram mais abundantes no segredo das plantas inoculadas, enquanto que aqueles com grandes diferenças positivas foram mais abundantes no segredo das plantas simuladas.
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Discussion
Dada a natureza gradual da secreção de raízes, a concentração de produtos químicos indutores de virulência produzidos em planta e seus efeitos sobre interações dinâmicas de plantas e micróbios ocorrem em gradientes espaciais e temporais. Neste sistema de co-cultivo hidropônico, não é suplementada nenhuma fitohormona sintética ou química que induz virulência microbiana ou defesas de plantas. Em contraste, usando abordagens convencionais, a adição de produtos químicos sintéticos, como a acetossiringona, cria um aumento repentino e artificial das concentrações. Portanto, este sistema de cocultivação hidropônica imita de forma mais imutável o ambiente natural, onde micróbios e plantas hospedeiras reconhecem e respondem de maneira espacial e temporal.
Aqui, foi possível demonstrar que os genes Agrobacterium virulence foram ativados após co-cultivo com Arabidopsis . Isso sugere que produtos químicos derivados de plantas naturais induzem a virulência de Agrobacterium . Futuro eÉ necessário identificar esses produtos químicos e verificar se o composto induzente de virulência aceitoseringa está entre eles. Além disso, observaram-se alterações substanciais na expressão do gene da raiz de Arabidopsis e nos perfis de secreto após a cocultivação com Agrobacterium , demonstrando o potencial do sistema de cocultivação hidropônica para estudar as respostas do hospedeiro da planta e os perfis de secreção durante as interações planta-micróbio. De fato, usando a técnica de cocultivação hidropônica, os perfis de expressão gênica e secreção de hospedeiros de plantas podem ser estudados em qualquer fase que leve a e após a interação microbiana, o que ajudará a elucidar como essas transcrições ou secreções facilitam ou dissuadiram as interações subseqüentes entre plantas e micróbios .
Além de estudar a sinalização de Arabidopsis - Agrobacterium , o sistema de cocultivação hidropônica pode ser adaptado para estudar outros importantes sistemas de micróbios vegetais. Pode ser usado paraElucidar as respostas das plantas a uma grande variedade de microrganismos patogênicos ou benéficos, agir individualmente ou coletivamente e estudar a ligação microbiana e as respostas a diferentes hospedeiros de plantas em condições relativamente "naturais". A manutenção da morfologia típica das mudas é importante para esclarecer as interações moleculares de plantas e micróbios. No caso de outras bactérias, fungos ou patógenos de herbivoria, nutrientes adicionais podem ser complementados para apoiar o crescimento microbiano durante a cocultivação.
No entanto, existem alguns parâmetros a serem considerados para cocultivar com diferentes sistemas de plantas-micróbios. Dependendo do tamanho da semente e da morfologia das raízes, pode ser necessária uma malha metálica com orifícios maiores e um recipiente de maior crescimento para grandes sementes e mudas para garantir que as estruturas radiculares se desenvolvam completamente abaixo da superfície da malha e que os tecidos de lançamento proliferam acima. A configuração também pode ser alterada para incluir uma plataforma superior. Isso poderia ser realizado bCortando um quadrado maior de malha e dobrando-o para além dos cantos, para elevar a superfície da malha mais alta do fundo do recipiente ou cortando a malha na forma de uma cruz grega e dobrando cada aba nos entalhes. Claro, existem limitações para cada sistema, e o apresentado aqui não será útil para plantas maiores que são cultivadas por períodos mais longos ( por exemplo, milho maduro). Além disso, alguns organismos podem exigir mais aeração do que é provido por agitação ao usar este sistema.
É certo que é muito difícil ou mesmo impossível projetar um sistema em um laboratório que reproduza exatamente e perfeitamente as interações dinâmicas plantas-micróbios que ocorrem na natureza. Embora a cocultivação hidropônica represente mais de perto as condições naturais na rizosfera, pelo menos conceitualmente, com estruturas radiculares intactas e morfologia vegetal, não existem microrganismos do solo ou do solo no sistema. No entanto, este sistema pode ser adaptadoPara atender a diferentes necessidades, como estudar microbiomas em um ambiente controlável e aprender como as plantas ou micróbios percebem e respondem a diferentes estímulos bióticos ou abióticos. Este sistema de cocultivação hidropônica também pode facilitar a compreensão de microbiomas e suas funções em hidroponia ou ecossistemas. Isto é muito importante para o manejo da doença e para a saúde das plantas para a indústria de estufas hidropônicas ou para a ecologia aquática de plantas e micróbios.
Além disso, este sistema de cocultivação hidropônica pode ser adaptado para estudar biorremediação e para elucidar os processos metabólicos relevantes e caminhos regulatórios em micróbios ou plantas. Além disso, este sistema de cocultivação hidropônica facilita a investigação sobre os efeitos de nutrientes pré-existentes (alleloquímicos) e / ou aplicados (sintéticos) e sinais / compostos químicos em micróbios ou hospedeiros de plantas 44 . A disponibilidade de afetar indiretamente os tecidos das plantas ( ie0; Folha, tiro) no sistema de cocultivação hidropônica oferece a oportunidade de explorar outros processos defensivos da planta, como a iniciação da planta, e como esses sinais são transduzidos.
A parte mais crítica deste sistema de co-cultivo é prevenir a contaminação. Em particular, a transferência de plantas do meio semi-sólido para o tanque deve ser feita com muito cuidado para evitar a contaminação do meio hidrópico. Por conseguinte, é necessário que este passo experimental seja realizado sob condições estéreis em um gabinete de bio-segurança e os experimentadores devem esperar 2-3 dias após a transferência antes de qualquer microrganismo ser inoculado para a experiência.
Em resumo, o sistema de cocultivação hidropônica melhora várias limitações das abordagens convencionais, mantendo a morfologia típica da planta e a integridade das estruturas radiais da planta ao longo do processo experimental. Além disso, o sistema evita a suplementaçãoSobre produtos químicos sintéticos, como hormônios de plantas ou produtos químicos indutores de defesa / virulência. Assim, imita mais de perto o ambiente natural, onde microbios e plantas hospedeiras reconhecem e respondem de maneira espacial e temporal. Este sistema de cocultivação pode ser adaptado para estudar diferentes sistemas de plantas-micróbios em condições mais "naturais" e gerenciáveis, inclusive com micróbios endofíticos ou epífitos. Vários aspectos das interações in planta , como patogênese, simbiose ou promoção do crescimento das plantas, podem ser examinados. O sistema de cocultivação hidropônica pode oferecer novos conhecimentos sobre as respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares de plantas e micróbios. Em qualquer ponto de tempo / intervalo ou estágio de crescimento, as bactérias ou plantas que crescem no sistema de cocultivação hidropônica podem ser amostradas separadamente para várias análises "omicas", incluindo transcriptômicas de plantas e microbianas, metabolomicias de planta e microbiana, secreção microbiana e vegetal e bioremediatiem. Além disso, este sistema de co-cultivo hidropônico pode ser adaptado para estudar as interações entre hospedeiros de plantas e microbiomas em um ambiente controlável. Em resumo, as vantagens da cocultivação hidropônica exemplificam um sistema superior para a descoberta de interação e sinalização de plantas e micróbios moleculares.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Brian Weselowski e Alexander W. Eastman por sua ajuda e discussão útil. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui e Greg Thorn por sua ajuda, discussões úteis e leitura crítica do manuscrito. Esta pesquisa foi financiada pela Agricultura e Agroalimentar Canadá, Growing Forward-AgriFlex (RBPI número 2555) e Growing Forward II projeto número 1670, conduzido pelos autores como parte de suas funções. Este estudo também foi parcialmente financiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (CRSNG) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 concedido a ZC Yuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
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