Summary
Il sistema di cocultivazione idroponico descritto supporta piante intatte con schermi a maglie metalliche e cocultivala con batteri. I tessuti vegetali, i batteri e le molecole secrete possono quindi essere raccolte separatamente per analisi a valle, consentendo contemporaneamente le risposte molecolari di entrambi gli host vegetali e dei microbi o dei microbiomi interattivi.
Abstract
Un disegno sperimentale che imita le interazioni microbi-vegetali naturali è molto importante per delineare i complessi processi di segnalazione plant-microbe. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Fornisce un eccellente sistema di modelli per studiare la patogenesi batterica e le interazioni vegetali. Studi precedenti sulle interazioni plant- Agrobacterium si sono basate in gran parte sulle colture di sospensione delle cellule vegetali, la ferita artificiale delle piante, o l'induzione artificiale di fattori di virulenza di microbi o difese vegetali da sostanze chimiche sintetiche. Tuttavia, questi metodi sono distinti dalla naturale segnalazione in pianta , dove le piante e i microbi riconoscono e reagiscono in maniera spaziale e temporale. Questo lavoro presenta un sistema di cocultivazione idroponica in cui le piante intatte sono supportate da schermi di maglie metalliche e cocultivate con Agrobacterium . In questo sistema di cocultivazione, nessun fitotormone sintetico o chimico che induce micrÈ integrata la virulenza o la difesa vegetale. Il sistema di cocultivazione idroponica somiglia molto alle interazioni microbi-vegetali naturali e alla homeostasi di segnalazione in planta . Le radici delle piante possono essere separate dal mezzo contenente Agrobacterium e la segnalazione e le risposte sia degli host vegetali che dei microbi interagenti possono essere studiati contemporaneamente e sistematicamente. In qualsiasi momento / intervallo di tempo, i tessuti vegetali oi batteri possono essere raccolti separatamente per varie analisi "omiche", dimostrando il potere e l'efficacia di questo sistema. Il sistema di coltivazione idroponica può essere facilmente adattato per studiare: 1) la segnalazione reciproca di diversi sistemi vegetali-microbici, 2) la segnalazione tra un host vegetale e più specie microbiche ( cioè consorzi microbiali o microbiomi), 3) come sono implicati i nutrienti e le sostanze chimiche Nella segnalazione di microrganismi vegetali e 4) come i microbi interagiscono con gli host vegetali e contribuiscono alla tolleranza vegetale a bioticiR sollecitazioni abiotiche.
Introduction
I microbi associati all'impianto svolgono un ruolo importante nel ciclo biogeochimico, nella bioremediazione, nella mitigazione del cambiamento climatico, nella crescita vegetale e nella salute, e nella tolleranza alle tensioni alle tensioni biotiche e abiotiche. I microrganismi interagiscono con le piante sia direttamente attraverso il contatto cellulare a parete cellulare che indirettamente tramite secrezione chimica e segnalazione 1 , 2 , 3 . Come organismi sessili, le piante hanno sviluppato meccanismi diretti e indiretti per resistere all'infezione da agenti patogeni. Le difese dirette comprendono le difese strutturali e l'espressione delle proteine di difesa, mentre le difese indirette includono la produzione secondaria del metabolita vegetale e l'attrazione degli organismi antagonisti agli invasori patogeni 4 , 5 . Gli essudati radici derivanti dalle piante, le secrezioni, le mucillagini, i mucigel e i lisati alterano le proprietà fisico-chimiche della rizosfera per attirare o respingereMicrobi verso i loro ospiti 6 . La composizione chimica della secrezione radicale è specie-specifica, servendo così come un filtro selettivo che consente a certi microrganismi in grado di riconoscere tali composti a fiorire nella rizosfera 6 . Pertanto, le specie microbiche compatibili possono essere stimolate ad attivare e migliorare le loro associazioni, sia a vantaggio che a detrimento dell'ospite vegetale 1 .
La comprensione delle interazioni tra pianta e microbe nella rizosfera è fondamentale per aumentare la produttività delle piante e il funzionamento dell'ecosistema, in quanto la maggior parte delle esposizioni microbiche e chimiche si verifica nella struttura radice e nell'interfaccia del suolo-aria 2 , 6 , 7 , 8 . Tuttavia, l'esame delle interazioni tra piante e micro-piani sotterranee e le risposte reciproche è stata una sfida a causa del suo intrigante Complessa e dinamica e la mancanza di adeguati modelli sperimentali con struttura radicale naturale e morfologia vegetale in condizioni di crescita strettamente controllabili. Come uno dei fitopatogeni più pesantemente studiati, Agrobacterium infetta un'ampia gamma di piante con importanza agricola e orticola, tra cui la ciliegia, la mela, la pera, l'uva e la rosa 9 . Agrobacterium è un organismo di modello importante per la comprensione delle interazioni patogeno-patogeno ed è un potente strumento di trasformazione delle piante e di ingegneria degli impianti 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
Le interazioni molecolari delle piante- Agrobacterium sono state ben studiate per diversi decenni e l'attuale comprensione della patogenicità di Agrobacterium è estesa 9 ,F "> 11 , 15 , 16. La patogenicità di Agrobacterium è in gran parte attribuita alle sue capacità evolute di percepire i segnali derivanti dalle piante, con conseguente fine modulazione del suo programma di virulenza e comunicazione cellulare da cellule, il cosiddetto sensore quorum 17 . Il programma di virulenza di Agrobacterium è regolato da diversi segnali disponibili nella rizosfera e coinvolge due set di sistemi a 2 componenti, il sistema ChvG / I e il sistema VirA / G. Le condizioni acide nella rizosfera attivano la trascrizione di chvG / I , virA / G , E molti altri geni coinvolti nella patogenicità di Agrobacterium , compresi virE0 , virE1 , virH1 , virH2 e geni del sistema di secrezione di tipo VI (T6SS) 18 . '-dimetossiacetofenone), attivare la VSistema 2-componente irA / G attraverso i meccanismi di segnalazione della fosforilazione 19 . VirA / G quindi attiva l'intera regolazione vir , con conseguente trasferimento e integrazione di un frammento di DNA batterico ~ 20 kb chiamato DNA di trasferimento (T-DNA) dal suo tumore-inducente (Ti) plasmide nel nucleo di pianta 16 . T-DNA porta i geni responsabili della sintesi degli ormoni vegetali indole-3-acetico (IAA) ( iaaM e iaaH ) e citochinina ( ipt ) e una volta espressi in cellule vegetali, si producono grandi quantità di questi fitotomi. Ciò si traduce in una proliferazione anomala del tessuto e nello sviluppo del tumore delle piante, noto come malattia della corona, che è un problema cronico e risorgente per le piante 9 , 11 , 20 . L'IAA agisce anche collettivamente con acido salicilico e acido gamma-ammino butirrico per reprimere la virulenza di Agrobacterium o per ridurre l' Agrobacteriu M quorum sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Per contrastare questa repressione, T-DNA porta anche dei geni per la biosintesi opina, che attiva Agrobacterium quorum sensing per promuovere la patogenicità di Agrobacterium e serve anche come fonte nutritiva per il patogeno 22 , 23 .
Nonostante una comprensione approfondita delle interazioni di Agrobacterium- Plant e del trasferimento di T-DNA risultante nell'ospite della pianta, gli eventi complessi di segnalazione nella fase iniziale dell'interazione sono meno ben compresi. Ciò è dovuto in parte alle limitazioni degli approcci convenzionali per indagare la segnalazione Agrobacterium- Plant. Le colture di sospensione delle cellule vegetali e ferite artificiali specifiche del sito vengono comunemente utilizzate per studiare le interazioni tra microbi e piante molecolari 24 ,. ef "> 26, 27 Tuttavia, sospensioni cellulari mancare tipica morfologia delle piante, in particolare celle di sospensione pianta non hanno strutture radicolari e essudati radicali, che sono molto importanti per l'attivazione chemiotassi microbica e virulenza 28, 29 Il mantenimento della morfologia delle piante. E la struttura delle radici è stata affrontata da piante ferite artificiali che facilitano l'infezione specifica del sito, con conseguente individuazione di geni correlati alla difesa vegetale indotta nel tessuto vegetale direttamente infetto 30 , 31. Tuttavia, ferita artificiale è significativamente diversa dall'infezione patogena in natura , In particolare in quanto ferita porta ad accumulo di acido jasmone (JA) che interferisce sistematicamente con la segnalazione e la difesa naturale delle piante 26. Inoltre, sono tipicamente impiegate sostanze chimiche sintetiche per indurre artificialmente le risposte dell'organismo vegetaleO la virulenza del patogeno. Anche se l'integrazione di tali composti chimici che riflettono concentrazioni in planta è possibile, tale integrazione non rende conto della diffusione di essudati radici gradualmente nella rizosfera circostante, che genera un gradiente chemotattico rilevato dai microbi 28 , 32 . Data la limitazione degli approcci convenzionali per studiare le interazioni tra pianta e microbe, l'accuratezza e la profondità dei dati ottenuti potrebbero essere ostacolati e restrittivi e le conoscenze generate dagli approcci convenzionali non possono essere tradotte direttamente in planta . Molti aspetti della segnalazione di pianta- Agrobacterium non sono ancora pienamente compresi, in particolare nella fase iniziale delle interazioni, quando i sintomi della malattia non sono ancora stati sviluppati.
Per modificare le limitazioni degli approcci convenzionali, questo lavoro presenta un sistema idroponico poco costoso, strettamente controllabile e flessibileSistema di ocultivazione che consente ai ricercatori di acquisire approfondimenti sui complessi percorsi di segnalazione e risposta nella fase iniziale delle interazioni molecolari delle piante-microbe. L'idroponica è stata ampiamente usata per studiare le sostanze nutritive vegetali, gli essudati radici, le condizioni di crescita e gli effetti della tossicità metallica sulle piante 33 , 34 . Ci sono diversi vantaggi di modelli idroponici, tra cui i piccoli requisiti spaziali, l'accessibilità di vari tessuti vegetali, il controllo stretto delle condizioni nutrizionali / ambientali e il controllo di parassiti / malattie. I sistemi idroponici sono anche meno limitanti per la crescita delle piante rispetto alle tecniche di placcatura agar / phytoagar, che in genere limitano la crescita dopo 2-3 settimane. Importante, il mantenimento delle strutture vegetali intere facilita la secrezione naturale della radice necessaria per la chemiotassi microbica e l'induzione della virulenza 8 , 29 . Il sistema descriIl letto qui è più semplice e meno intensivo rispetto alle alternative 33 , 34 . Utilizza meno parti e non richiede strumenti diversi dalle forbici standard. Utilizza la maglia metallica (in contrapposizione al nylon 33 ) come un forte supporto per la crescita delle piante e un semplice metodo di aerazione in condizioni sterili mediante agitazione per supportare la crescita microbica. Inoltre, il sistema può utilizzare maglie metalliche di varie dimensioni per sostenere la crescita vegetale, che accoglie diverse specie vegetali senza limitare la larghezza delle loro radici.
Nel sistema di coltivazione idroponica qui presentato, le piante vengono coltivate in un sistema idroponico sterile dove le radici vegetali secernono composti organici che sostengono la crescita dei batteri inoculati. In questo sistema di cocultivazione non vengono aggiunti prodotti chimici artificiali, come ormoni vegetali, elicitor di difesa o sostanze chimiche che inducono la virulenza, che riflette la cella naturale-signostasi dell'omeostasi durante le interazioni plant-microbe. Con questo sistema di cocultivazione idroponica è stato possibile determinare simultaneamente l'espressione genica nel tessuto radicale Arabidopsis thaliana Col-0 su infezione da Agrobacterium , nonché l'attivazione di geni Agrobacterium dopo cocultivazione con Arabidopsis . È stato inoltre dimostrato che questo sistema è idoneo a studiare l'attaccamento di Agrobacterium alle radici vegetali, nonché al profilo di segreto radicale di pianta, dopo la cocultivazione (infezione) con Agrobacterium ( Figura 1 ).
Figura 1: Panoramica del Sistema di Cocultivazione Idroponica, con analisi del campione. Le piante sono coltivate in cima alla maglia (germogli al di sopra della maglia), con le radici immerse in mezzo idroponico che viene quindi inoculato con batteri fO cocultura. I tessuti e i batteri delle piante vengono quindi separati per le estrazioni e le analisi simultanee. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 35 .
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Protocol
1. Pianificazione sperimentale
- Determinare gli obiettivi specifici dell'esperimento.
- Leggete l'intero protocollo di seguito. Determinate quali sezioni sono rilevanti per gli obiettivi specifici e se è necessario apportare qualsiasi modifica. Vedere sotto per esempi.
- Considerate se gli esperimenti utilizzeranno le piante A. thaliana e il batterio A. tumefaciens , come sotto, o un'altra combinazione plant-microbe.
NOTA: Mentre possono essere utilizzate varie specie vegetali, lo spessore delle radici vegetali può richiedere una maglia di diversa grandezza (fase 3.3) ei parametri di crescita (punti 3.10-3.11 e 4.4) e dimensioni del serbatoio idroponico e volume medio 4.2) può anche richiedere la regolazione ( Figura 2 ). I microbi possono essere facilmente inoculati come culture pura, specie miste (consorzi) o da campioni ambientali (microbiomi), ma qualsiasi cambiamento può influenzare il protocollo, in particolare la fase 4.5. - Considera ilTipi di esperimenti che verranno utilizzati per analizzare i campioni.
NOTA: La microscopia a fluorescenza (fase 5) richiede organismi che sono etichettati con un costruttore di reporter fluorescenti.
- Considerate se gli esperimenti utilizzeranno le piante A. thaliana e il batterio A. tumefaciens , come sotto, o un'altra combinazione plant-microbe.
- Disegnare controlli appropriati. Includere i serbatoi idroponici senza piantine inoculate con batteri di controllo e serbatoi con piantine di controllo che non sono inoculate con batteri.
- Pianificare esperimenti con il numero appropriato di semi e vasche idroponiche. Considerate i controlli, i replicanti biologici (minimo 3) e quantità di tessuti necessari per tutte le analisi.
- Determinare la durata appropriata della cocultivazione per gli obiettivi sperimentali (fase 4.8).
- Revisione di tutti i passaggi di seguito, come richiesto.
Figura 2. Esempi di altre piante che potrebbero essere coltivate nel sistema idroponico, supportate da un P Latform di Metal Mesh. Compatibilità di una serie di maglie metalliche per una varietà di semi di piante e coltivazione. ( A ) Acciaio inossidabile tipo 304 saldato 3 × 3 mesh × .047 "filo di diaframma per Vicia faba . ( B ) Acciaio inossidabile tipo 304 saldato 4 × 4 mesh × .035" filo di diaframma per Zea mays . ( C ) Filettatura in acciaio inossidabile tipo 304 di saldatura 4 × 4 mesh × .032 per Glycine max (soia) ( D ) Acciaio inossidabile tipo 304 saldato 6 × 6 mesh × .047 "filo di diaframma per Raphanus sativus (inverno ravanello). ( E ) Acciaio inossidabile tipo 304 saldato 6 × 6 maglia × .047 "filo di diametro per Triticum spp. ( F ) Acciaio inossidabile tipo 304 saldato 6 × 6 mesh × .035" filo di diaframma per Cucumis sativus . Questa cifra è stata modificata dal riferimento 35 .955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Sterilizzazione della superficie di semina vegetale
- Vortice (ad alta velocità) circa 200 semi di A. thaliana con 500 μL di acqua deionizzata in un tubo di microcentrifuga. Per le specie vegetali con semi più grandi, utilizzare un tubo di grandi dimensioni per facilitare la sterilizzazione superficiale.
- Centrifugare questo a circa 9.000 xg per 30 s in una microcentrifuga a tavola. Rimuovere l'acqua (supernatante) usando una pipetta.
- Aggiungere 300 μl di ipoclorito di sodio al 2% ai semi e al vortice. Lasciare a temperatura ambiente per 1 min. Per le specie di piante con semi più grandi, utilizzare volumi più grandi per coprire i semi.
- Centrifugare a circa 9.000 xg per 30 s in una microcentrifuga a tavola. Rimuovere la soluzione di ipoclorito di sodio usando una pipetta.
- Aggiungere 500 μl di acqua sterile e deionizzata ai semi e vortice. Centrifugare a circa 9.000 xg per30 s e rimuovere l'acqua utilizzando una pipetta sterile.
- Ripetere il passo 2.5 un ulteriore 4 volte.
- Aggiungere 500 μl di etanolo al 70% ai semi e al vortice. Lasciare a temperatura ambiente per 1 min.
- Centrifugare a circa 9.000 xg per 30 s in una microcentrifuga a tavola. Rimuovere il 70% di etanolo usando una pipetta.
- Ripetere il passo 2.5 per ulteriori 5 volte.
- Resuspendere i semi sterilizzati in 500 μl di acqua sterile e ultrapure.
3. Germinazione dei semi e coltivazione semi-solida delle piante
- Preparare mezzo semi-solido Murashige e Skoog (MS): 2,165 g / L Sali basali MS; 10 g / l di saccarosio; 0,25 g / L MES; E 59 ml / L miscela vitaminica B5, pH 5,75, con phytoagar da 4 g / l.
- Autoclave il mezzo MS. Versare 25 ml di esso in ogni piatto profondo Petri sterile (100 x 25 mm 2 ).
- Per ogni piatto di Petri, tagliare un quadrato di 90 x 90 mm di maglia in acciaio inox.
NOTA: La maglia consigliata per A. thaliana < / Em> ha un grado di 304 (standard standard), un numero di maglie (numero di fori per pollice lineare) di 40 x 40 e un diametro di 0.01 "(0,0254 cm) di filo. Per i serbatoi idropinici più grandi O piattaforme più alte. - Piegare gli angoli di ogni maglia quadrata abbastanza in modo che la maglia si inserisca all'interno della piastra di Petri. Piegare gli angoli ad un angolo di 90 ° rispetto alla massa della maglia per consentire la maglia di essere appoggiata dagli angoli, lasciando abbastanza spazio sotto per lo sviluppo della radice ( Figura 3a ).
- Mettere le casse di maglia tagliate in un bicchiere, coprire con foglio di alluminio e sterilizzare autoclavaggio con un ciclo a secco di 30 minuti.
- Una volta che il mezzo si è solidificato nei piatti di Petri e la maglia è sterile, posizionare ogni quadrato di mesh sterilizzato sulla parte superiore del mezzo semi-solido, con gli angoli piegati rivolti verso il basso.
- Spingere la maglia in modo che gli angoli penetrano nel mezzo e la massa della maglia tocca la superficie superiore del mezzo (> Figura 3b).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento da 200 μl per preparare singoli semi di A. thaliana sterilizzati in superficie (i semi resteranno sulla punta della pipetta a causa della forza di vuoto) e trasferire delicatamente ogni seme in cima alla maglia. Posizionare i semi in modo che siano distanziati appropriatamente per esigenze sperimentali ( ad esempio, 4 6 semi / piastra).
- Sigillare le piastre Petri con i coperchi, collocando nastro chirurgico poroso attorno ai bordi.
- Stratificare i semi posizionando l'intero piatto di Petri a 4 ° C per 2 d nel buio ( ad esempio, avvolgere in foglio per simulare l'oscurità).
- Coltivare i semi nel piatto di Petri a 22-24 ° C con un fotoperiodo di 16 ore per 10-14 giorni ( Figura 3c ).
Figura 3: Sistema di coltivazione idroponica di piante-microbe. La pausa sinistraNel rappresenta un diagramma di flusso che descrive i sei passi fondamentali per l'assemblaggio e il funzionamento del sistema di coltivazione idroponica. Il pannello a destra mostra i materiali sperimentali, le attrezzature e le procedure operative per il sistema di cocultivazione idroponica durante lo studio delle interazioni Arabidopsis-Agrobacterium . Sono mostrati ora la fase di inoculazione e la fase finale per il campionamento di piante o batteriche. Questa cifra è stata modificata dal riferimento 35 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Sistema di coltivazione idroponica
- Preparare il liquido Murashige e Skoog (MS): 2,165 g / L Sali basali MS, 10 g / L saccarosio, 0,25 g / L MES e 59 ml / L Vitamina B5, pH 5,75.
- Autoclave il mezzo. Versare 18 ml di esso in ogni vetro cilindrico sterile o in un serbatoio di plastica trasparente (piatti cristallizzanti, 100 x 80 mm2) con coperchi sterili.
NOTA: Presterilizzare i serbatoi e i coperchi avvolgendoli in foglio di alluminio e autoclavaggio. - In un cappuccio di flusso sterilizzato utilizzare pennini sterili per trasferire delicatamente ogni quadrato di maglie con piantine di 10-14 giorni dal mezzo semi-solido ad un serbatoio cilindrico idroponico ( Figura 3d ). Sigillare i coperchi sui serbatoi utilizzando un nastro chirurgico poroso.
- Coltivare le piantine sulla maglia nel serbatoio per 72 h a 22-24 ° C, con un fotoperiodo di 16 ore e scuotere a 50 giri / min per l'aerazione ( Figura 3e ).
NOTA: Questo permette alle piante di adattarsi all'ambiente idroponico prima dell'inoculazione (cocultivazione) con i microrganismi. Questo periodo di attesa permetterà inoltre che la contaminazione accidentale del microbico sia evidente prima dell'inoculazione.- Iniziare il passo successivo il giorno prima della fine del periodo di incubazione.
- Crescere A. tumefaciens in mezzo AB(0,5% w / v estratto di lievito, 0,5% w / v triptone, 0,5% w / v saccarosio, 50 mM MgSO 4 , pH 7,0) a 28 ° C con agitazione durante la notte fino a che la coltura raggiunge una densità ottica finale di 1,0 a 600 Nm (OD 600 ), misurata usando uno spettrofotometro, con un mezzo iniettato AB in bianco.
NOTA: Un OD 600 di 1,0 equivale a circa 10 9 cellule / mL. - Lavare tre volte l' A. tumefaciens in un uguale volume di NaCl 0,85%. Riposare in un volume uguale di acqua doppia distillata sterile.
- Prima dell'inoculazione, esaminare attentamente il serbatoio con le piante per assicurare che non vi sia contaminazione; Il mezzo nelle vasche non contaminate dovrebbe essere chiaro e trasparente.
- Scartare qualsiasi serbatoio con liquido nuvoloso (contaminazione) e numerare il resto dei serbatoi. Campeggiare una piccola quantità (20 μL) di mezzo idroponico da ogni serbatoio numerato e posizionarlo su un piatto di Petri riempito con brodo Luria (LB). covareIl piatto a 28 ° C.
- Immediatamente aggiungere 50 μL di sospensione A. tumefaciens (circa 5 x 10 7 cellule, stimate dall'OD 600 ) in ogni serbatoio idroponico numerato. Coltivare i piante A. thaliana e A. tumefaciens a 22-24 ° C con un fotoperiodo di 16 ore e scuotere a 50 giri / min ( Figura 3f ).
- Esaminare la lastra di LB macchiata dal punto 4.7.1. Dopo 12 e 28 ore di incubazione per verificare la sterilità dei serbatoi. Se c'è una contaminazione, non utilizzare il corrispondente serbatoio numerato (inoculato con batteri) per ulteriori saggi a valle.
- Se si desidera, monitorare la crescita di A. tumefaciens ad intervalli regolari rimuovendo un campione di mezzo dal serbatoio e misurando l'OD 600 usando uno spettrofotometro con mezzo da un controllo inoculato come vuoto ( Figura 4 ).
NOTE: I sintomi della malattia di pianta dovrebbero essere evidenti dopo 7 giorni ( Figura 5 ). - Separare le radici A. thaliana dalla sospensione batterica sollevando la piastra maglia; La tempistica di questo passaggio dipende dai processi a valle. Vedere i passaggi 5-8 per i dettagli.
- Se si utilizzano radici per analisi successive, sciacquare rapidamente le radici in acqua doppia-distillata. Se si utilizza foglie o altri tessuti, tagliare il tessuto. Per le analisi RNA, procedere immediatamente al punto 7.1.
Figura 4: Crescita del Agrobacterium nel Sistema di Cocultivazione Idroponica. La crescita di Agrobacterium in presenza o in assenza di un host vegetale ( Arabidopsis ) è stata monitorata ogni 4 h. Le cellule di Agrobacterium sono state coltivate in mezzo AB / O, lavate 3x con NaCl 0,85% e inoculate nel sistema idroponico, con o wCon co-coltura Arabidopsis , da un OD 600 iniziale di circa 0,1. I valori di OD 600 sono i mezzi di tre repliche biologiche, con deviazioni standard ( OD 600 di 1,0 = 1 x 10 9 cellule / mL).
Figura 5: Fenotipi vegetali rappresentativi e sintomi di malattie osservabili durante la cocultivazione. Entro 4 giorni dopo l'inoculazione, nessun sintomo di malattia è visibile ( A ) rispetto alle piante noninoculate ( B ). Dopo 7 d di Cocultivazione (infezione), i sintomi della malattia sono osservati nelle piante infette ( C ), mentre le piante noninoculate rimangono sane ( D ).
5. Microscopia a fluorescenza
- Utilizzare A. tumefaciens che ospita un costruttore di reporter per una proteina autofluorescente perLa configurazione del cocultivazione al punto 4.5 .
NOTA: Qui viene utilizzato un plasmide pJP2 modificato che esprime pCherry, un derivato di dsRed 36 . - A seguito di un'appropriata co-coltura ( ad esempio, 48 h) al punto 4.8, separare le singole radici secondarie (rami laterali della radice principale) usando forbici sterili.
- Sciacquare le radici in acqua distillata per rimuovere il materiale legato leggermente. Immergere ogni radice in 30 μl di acqua su uno scivolo a microscopio e coprire con una copertura in vetro.
- Sigillare i bordi della copertura con smalto per prevenire la disidratazione delle radici.
- Visualizzare l'attaccamento di A. tumefaciens alle radici A. thaliana mediante microscopia a fluorescenza.
NOTA: Qui un microscopio confocale con eccitazione da un laser da helium-neon (He-Ne) 543/594 nm viene utilizzato per visualizzare la fluorescenza rossa di pCherry a 590-630 nm in un obiettivo invertito di obiettivo 63X con apertura numerica di 1,4 (
Figura 6: Attacco di origine di Agrobacterium , determinato dalla microscopia confocale. Agrobacterium pCherry rosso fluorescenza-marcato è stato visualizzato a 590-630 nm, con eccitazione da un elio-neon (He-Ne) 543/594 nm laser. La visualizzazione è stata condotta in base a un obiettivo invertito 63X con obiettivo apertura numerica di 1,4. Barre scala = 11 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
6. Analisi batterica del trascritto
- Dopo una appropriata co-coltura ( ad esempio, 8 h) nel passaggio 4.8, separare le radici dal mezzo idroponico come nel punto 4.9. Trasferire 1,5 ml del mezzo idroponico in un micro di 1,5 mlCentrifugare e centrifugare a 12.000 xg per 2 minuti per far pelliccare le cellule.
- Rimuovere il surnatante. Trasferire altri 1,5 mL di mezzo idroponico nello stesso tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 12,000 g per 2 minuti per far pelliccare le cellule.
- Rimuovere il surnatante.
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui congelando i campioni a -80 ° C fino all'uso. - Estrarre l'RNA dalle cellule A. tumefaciens utilizzando i metodi standard 37 o un kit di isolamento e purificazione commerciale RNA con trattamento DNasi per evitare la contaminazione del DNA.
NOTA: il protocollo può essere interrotto qui congelando aliquote di RNA a -80 ° C fino all'uso. - Utilizzare l'RNA isolato per una varietà di analisi utilizzando metodi standard, tra cui quelli seguenti.
- Utilizzare un microarray commerciale secondo il protocollo del produttore per rilevare set di gene differenzialmente espressi in cocultivato contro il controllocultura.
- Utilizzare la reazione quantitativa della catena polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) per rilevare l'espressione di geni specifici o per convalidare i dati di microarray 38 .
7. Analisi del trascritto delle piante
- Dopo una appropriata cocultivazione ( ad esempio, 8 h) nel passaggio 4.8, separare le radici dal mezzo idroponico, come nel punto 4.9, oppure separare altri tessuti come necessario. Immediatamente collocare circa 150 mg di radici o di altri tessuti vegetali in azoto liquido.
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui congelando i campioni a -80 ° C fino all'uso. - Mescolare i campioni congelati in polvere in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello.
- Estrarre l'RNA dalla polvere utilizzando i metodi standard 39 oppure un kit di isolamento e purificazione commerciale RNA con trattamento DNasi per evitare la contaminazione del DNA.
NOTA: il protocollo può essere interrotto qui congelando aliquote di RNA a-80 ° C fino all'uso. - Utilizzare l'RNA isolato per una varietà di analisi utilizzando metodi standard, tra cui quelli seguenti.
- Utilizzare un microarray commerciale secondo il protocollo del produttore per individuare gruppi gene che sono espressi differenzialmente nelle piante co-coltivate rispetto alle centrali di controllo.
- Utilizzare qRT-PCR per rilevare l'espressione differenziale di geni specifici o per convalidare i dati di microarray 38 .
8. Profilo segreto
- Dopo una appropriata co-coltura ( ad es., 72 ore) nel punto 4.8, separare le radici dal mezzo idroponico come nel punto 4.9. Sterilizzare i 18 ml di mezzo idroponico passandolo attraverso un filtro pori da 0,2 μm in tubi conici da 50 ml.
- Freeze i campioni a -80 ° CO / N.
- Allentare i tappi sui tubi conici da 50 ml e posizionarli in una macchina per liofilizzazione per 36 h. Procedere per memorizzare o elaborare i campioni (come desCriptato di seguito) per l'analisi HPLC e il rilevamento dei composti.
NOTA: il protocollo può essere sospeso qui. - Riposare ogni campione in 5 ml di acqua doppia distillata in un tubo di prova sigillabile.
- Aggiungere 5 ml di acetato di etile e mescolare invertendo il tubo più volte.
- Lasciare separare le fasi a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire la parte superiore (fase organica) in un nuovo contenitore pipettando. Se necessario, raggruppa più frazioni organiche.
- Asciugare sotto un leggero flusso di gas azoto (~ 45 min).
- Riposizionare il campione in una soluzione appropriata per HPLC ( es. Metanolo al 100%).
- Eseguire HPLC secondo i metodi standard 40 .
- Rilevare i composti con mezzi appropriati.
NOTA: ionizzazione elettrospray Time-of-Flight Spettrometria di Massa (ESI-TOF-MS) 40 è qui utilizzato.
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Representative Results
Crescita nel sistema di coltivazione idroponica
La curva di crescita di A. tumefaciens C58 ha dimostrato una fase di ritardo significativa nelle prime 16 ore di cocultivazione, seguita da una crescita molto stabile quando co-coltivata con A. thaliana Col-0, fino ad un massimo di OD 600 di circa 0.9 a partire da 48 h postinoculation. Al contrario, essenzialmente nessuna crescita batterica è stata osservata nella coltura di controllo senza A. thaliana ( Figura 4 ). Questi risultati suggeriscono che senza sostanze nutritive aggiuntive fornite artificialmente, i composti chimici secchi di radici possono supportare la crescita di Agrobacterium nel sistema di coltivazione idroponica. La fase significativa di ritardo durante le prime 16 ore di cocultivazione può essere attribuita alla percezione host molto complessa e alla secrezione radicale graduale sulla cocultivazione con il patogeno./ P>
Le piante A. thaliana coculturate non hanno mostrato sintomi di malattia durante i primi 3 giorni, relativamente agli impianti di controllo coltivati in assenza di A. tumefaciens ( Figura 5a , 5b ). Tuttavia, dopo 5 giorni di cocultivazione, le differenze sono diventate gradualmente visibili e le piante di controllo macchiate sono state più ecologiche e più sane. Dopo 7 giorni di cocultivazione con Agrobacterium , il tessuto vegetale ha mostrato la clorosi e la necrosi, nonché la fioritura precoce ( Figura 5 c, 5 d ). La fioritura iniziale di Arabidopsis è una conseguenza generale dell'infezione da una serie di patogeni filogeneticamente disparati 41 , 42 .
Visualizzazione microscopica dell'adesione Agrobacterium alle radici delle piante
A. tumefaciens etichettato con la fluorescenza rossa pCherry è stato localizzato alla struttura di radice di pianta con una forma tipica rod-filamentosa, 0,5 μm di larghezza e 3-5 μm di lunghezza ( Figura 6 ). La maggior parte delle cellule batteriche sono state verticalmente attaccate alla superficie della parete cellulare, in accordo con i risultati precedenti che Agrobacterium si lega alla parete cellulare in modo polare 32 .
Questi risultati suggeriscono che il sistema di cocultivazione idroponica può essere utilizzato per studiare la dinamica batterica in planta , come l'attaccamento alla struttura radicale e il processo di infezione, in tempo reale. Infatti, in assenza di altri microbi, questo sistema di cocultivazione fornisce una piattaforma priva di rumore per l'osservazione diretta dell'accoppiamento batterio-pianta in pianta . Attivazione di trascrizioni di virulenza di Agrobacterium
Dopo 8 ore di cocultivazione, le cellule A. tumefaciens sono state raccolte per l'isolamento di RNA e i livelli di trascrizione dei geni rappresentativi di virulenza sono stati valutati con qRT-PCR ( Figura 7 ). L'espressione dei geni di virulenza di ropB, virA, virD1, virH1, virE0 e chvG è stata significativamente aumentata durante la co-coltura con l'host della pianta rispetto al controllo senza A. thaliana . In particolare, l'abbondanza di mRNA è aumentata del 100% per chvG , del 70% per virD1 , del 94% per virA , del 40% per virE0 , del 330% per il ropB e del 48% per virH1 .
Questi risultati suggeriscono che, senza supplemeNtation con prodotti chimici che inducono la virulenza sintetica, le sostanze chimiche che escono nel sistema di coltivazione idroponica sono in grado di attivare la programmazione della virulenza di Agrobacterium . L'induzione dei geni di virulenza di Agrobacterium è indicativa della risposta Agrobacteria ai segnali derivanti dalle piante nel sistema di coltivazione idroponica. È molto interessante che Agrobacterium ropB e chvG sono indotte su cocoltivazione con Arabidopsis, come studi precedenti hanno indicato che questi geni sono indotti da condizioni acide 18, ma non da acetosiringone, un noto composto virulenza inducono 19. Questo risultato suggerisce che composti non identificati dalle radici Arabidopsis sono in grado di indurre l'espressione ropB e chvG . Tuttavia, tali prodotti chimici che inducono la virulenza devono essere ulteriormente identificati.
Figura 7. Attivazione della Virulenza Agrobacterium nel Sistema di Cocultivazione idroponica. I livelli di mRNA di sei fattori di virulenza di Agrobacterium sono stati misurati quantitativamente da qRT-PCR. L'abbondanza di trascritti del fattore di virulenza è stata normalizzata a quella dei trascrizioni rRNA 16S. I dati rappresentano i mezzi ± deviazione standard (barre di errore) di 3 repliche biologiche, con valori P ottenuti dal t-test dello studente.
Espressione dei trascritti di pianta
L'analisi di qRT-PCR è stata effettuata per cinque geni precedentemente dimostrati essere espressi differenzialmente in A. thaliana (dati non pubblicati). Come previsto, qRT-PCR ha confermato che l' AGP 30 (AT2G33790) e NAS 1 (AT5G04950) sono stati ridotti (rispettivamente 97 e 89%) mentre HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) e ELIP 1 (AT3G22840) sono stati regolati (rispettivamente per 3.800, 540 e 510%) in ciascuna delle 3 repliche rispetto ai controlli ( Figura 8 ).
Figura 8: qRT-PCR di A. thaliana Root Transcripts. L'abbondanza di ciascun trascritto di mRNA è stato normalizzato a quello di At Transcripts di ACTIN II. I dati sono le medie di 3 repliche biologiche ± la deviazione standard (barre di errore), con valori P ottenuti dal t-test dello studente.
Modifiche per ospitare profili di secrezione
I composti derivanti dalla radice sono stati notevolmente differenziati tra le specie vegetali 6 , 8 . roEsudati includono i segnali molecolari che provocano varie risposte di segnalazione durante le interazioni plant-microbe 1 , 43 . Tuttavia, le differenze nei profili progressive secrezione ospitante nel tempo a seguito dell'interazione microbi sono molto meno compresi, tranne che i composti radice secrete sono indispensabili per l'attrazione di batteri benefici 29. Dopo 72 ore di cocultivazione con A. tumefaciens C58, sono state determinate differenze nei profili secretomi A. thaliana Col-0 utilizzando analisi LC-MS in modalità ionica positiva e confronti con non inoculati A. thaliana Col-0 ( cioè in assenza di Agrobacterium ). È stato osservato un chiaro spostamento nel segreto, con nuovi composti che si presentano come risultato dell'inoculazione di Agrobacterium ( Figura 9 ). Complessivamente, 35 composti sono stati rafforzati comparativamente nel segreto del piano iniettato AgrobacteriumTs, mentre 76 sono aumentati nel segreto di piante noninoculate ( Figura 9 ). Questi ultimi rappresentano probabilmente composti che A. tumefaciens C58 avrebbe incontrato prima dell'infezione. Sebbene questi composti non siano stati identificati e la secrezione differenziale di composti derivanti da radici specifici non è stata determinata nel contesto di questo studio, l'analisi segreta ha dimostrato differenze rilevabili nei profili di secrezione di ospite utilizzando questo sistema di cocultivazione idroponica.
Figura 9: Analisi Secretome di A. thaliana Col-0. L'analisi dei profili di segretezza A. thaliana Col-0 è stata completata in tripple per campioni macchiati e inoculati. Le aree di picco per i 138 segnali di massa unici (composti) trovati nei profili di secrezione in ciascun gruppo di trattamento sono stati calcolati in media eI valori medi sono stati utilizzati per calcolare la differenza di abbondanza di ciascun composto (mock-inoculato meno inoculato) al fine di visualizzare le differenze nei composti rilevabili. I composti con grandi valori di differenza negativa erano più abbondanti nel segreto di piante inoculate, mentre quelle con grandi differenze positive erano più abbondanti nel segreto di piante imbocciate.
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Discussion
Data la natura graduale della secrezione radicale, la concentrazione di sostanze chimiche che inducono la virulenza prodotta in planta ei loro effetti sulle interazioni dinamiche tra pianta e microbici si verificano in gradienti spaziali e temporali. In questo sistema di co-coltivazione idroponica, non è completato alcun fitotormone sintetico o chimico che induce virulenza di microbi o difese delle piante. Al contrario, utilizzando approcci convenzionali, l'aggiunta di sostanze chimiche sintetiche, come il acetosyringone, crea un picco improvviso, artificiale in concentrazioni. Pertanto, questo sistema di cocultivazione idroponica simula maggiormente l'ambiente naturale, in cui i microbi e le piante ospite riconoscono e reagiscono in maniera spaziale e temporale.
Qui è stato possibile dimostrare che i geni della virulenza di Agrobacterium sono stati attivati dopo la co-coltura con Arabidopsis . Ciò suggerisce che le sostanze naturali derivate dalle piante inducono la virulenza di Agrobacterium . Futuro eÈ necessaria la necessità di identificare tali prodotti chimici e verificare se tra questi sia il composto acetosyringone che induce virulenza. Inoltre, sono stati osservati cambiamenti sostanziali nell'espressione genica di root di Arabidopsis e nei profili secretomici su cocultivazione con Agrobacterium , dimostrando il potenziale del sistema di cocultivazione idroponica per studiare le risposte dell'organismo vegetale e profili di secrezione durante le interazioni plant-microbe. Infatti, utilizzando la tecnica di cocultivazione idroponica, è possibile studiare l'espressione genica e i profili secretomi degli host vegetali in qualsiasi fase che porta ad interazione microbica e successiva, che contribuirà a chiarire come queste modifiche trascrizionali o segretarie agevolino o scoraggino le successive interazioni tra pianta e microbe .
Oltre a studiare la segnalazione Arabidopsis - Agrobacterium , il sistema di coltivazione idroponica può essere adattato allo studio di altri importanti sistemi di pianta-microbici. Può essere usato perSpiegare le risposte delle piante ad una grande varietà di microrganismi patogeni o benefici, agendo individualmente o collettivamente e studiare l'attaccamento e le risposte microbiche a diversi host di piante in condizioni relativamente "naturali". Il mantenimento della morfologia tipica della piantina è importante per chiarire le interazioni molecolari delle piante-microbe. Nel caso di altri batteri, funghi o patogeni erbivori, possono essere integrati ulteriori nutrienti per supportare la crescita microbica durante la coltivazione.
Tuttavia, esistono alcuni parametri da prendere in considerazione per la coltivazione con diversi sistemi vegetali-microbici. A seconda della dimensione del seme e della morfologia della radice, può essere richiesta la maglia metallica con fori più grandi e un contenitore di crescita più grande per i semi e le piantine più grandi per garantire che le strutture di radice si sviluppino pienamente al di sotto della superficie della maglia e che sparano i tessuti proliferando sopra. Può anche essere necessario modificare l'installazione per includere una piattaforma superiore. Questo potrebbe essere compiuto bTagliando una piazza più grande della maglia e piegandola più lontano dagli angoli, sollevando la superficie della maglia più in alto dal fondo del contenitore, o tagliando la maglia a forma di croce greca e piegando ogni lembo alle fessure. Naturalmente, esistono limitazioni per ogni sistema, e quello presentato qui non sarà utile per le piante più grandi che vengono coltivate per periodi più lunghi ( ad esempio, maturo mais). Inoltre, alcuni organismi possono richiedere una maggiore aerazione di quanto si ottiene agitando quando si utilizza questo sistema.
Certo, è molto difficile o addirittura impossibile progettare un sistema in un laboratorio che replica esattamente e perfettamente le dinamiche interazioni tra pianta e microbe che si verificano in natura. Sebbene la coltivazione idroponica più vicino rappresenti condizioni naturali nella rizosfera, almeno concettualmente, con strutture radicali intatte e morfologia vegetale, non ci sono microrganismi del terreno o del suolo nel sistema. Tuttavia, questo sistema può essere adattatoPer soddisfare diverse esigenze, come studiare i microbiomi in un ambiente controllabile e imparare come le piante oi microbi percepiscono e rispondono a diversi stimoli biotici o abiotici. Questo sistema di cocultivazione idroponica può anche facilitare la comprensione dei microbiomi e delle loro funzioni in idroponica o negli ecosistemi. Questo è molto importante per la gestione delle malattie e la salute delle piante per l'industria idroponica della serra o per l'ecologia acquatica delle piante e dei microbi.
Inoltre, questo sistema di coltivazione idroponica può essere adattato per studiare la bioremediazione e per chiarire i relativi processi metabolici e le vie regolatorie nei microbi o nelle piante. Inoltre, questo sistema di cocultivazione idroponica agevola l'indagine sugli effetti di sostanze nutritive (segnali chimici) e / o sintetici (sintetici) preesistenti e segnali / composti chimici sui microbi o gli addetti alle piante 44 . La disponibilità di tessuti ad impatto indiretta (ad es0; Foglie, tiro) nel sistema di coltivazione idroponica offre l'opportunità di esplorare altri processi difensivi di piante, come la priming vegetale, e come questi segnali vengono trasdotti.
La parte più critica di questo sistema di co-coltura è di prevenire la contaminazione. In particolare, il trasferimento di piante dal mezzo semi-solido nel serbatoio deve essere fatto molto attentamente per prevenire la contaminazione del mezzo idropico. È quindi necessario che questo passaggio sperimentale sia effettuato in condizioni sterili in un armadio di sicurezza bio e gli esperimenti devono aspettare 2-3 giorni dopo il trasferimento prima che venga inoculato alcun microrganismo per l'esperimento.
In sintesi, il sistema di cocultivazione idroponica amplia varie limitazioni degli approcci convenzionali mantenendo la morfologia tipica della pianta e l'integrità delle strutture radicate in tutto il processo sperimentale. Inoltre, il sistema evita i supplementiSu sostanze chimiche sintetiche, come gli ormoni delle piante o sostanze chimiche che inducono la difesa / virulenza. Così, essa imita più da vicino l'ambiente naturale, in cui i microbi e le piante ospite riconoscono e rispondono in maniera spaziale e temporale. Questo sistema di cocultura può essere adattato per studiare diversi sistemi vegetali-microbici in condizioni più "naturali" e gestibili, anche con microbi endofitici o epifiti. Possono essere esaminati vari aspetti delle interazioni in pianta , come la patogenesi, la simbiosi o la promozione della crescita delle piante. Il sistema di cocultivazione idroponica può offrire nuove conoscenze nelle risposte fisiologiche, biochimiche e molecolari di entrambe le piante e dei microbi. In un determinato momento / intervallo o fase di crescita, i batteri o le piante che crescono nel sistema di coltivazione idroponica possono essere campionati separatamente per varie analisi "omiche", tra cui transcriptomics vegetali e microbici, metabolomica vegetale e microbica, segreto vegetale e microbico e bioremediatisopra. Inoltre, questo sistema di co-coltura idroponica può essere adattato per studiare le interazioni tra padroni di pianta e microbiomi in un ambiente controllabile. In sintesi, i vantaggi della coltivazione idroponica rappresentano un sistema superiore per scoprire l'interazione e la segnalazione delle interazioni molecolari di piante e microbe.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Brian Weselowski e Alexander W. Eastman per il loro aiuto e la loro utile discussione. Ringraziamo anche i dottori. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui e Greg Thorn per il loro aiuto, discussioni utili e lettura critica del manoscritto. Questa ricerca è stata finanziata dall'Agricoltura e Agri-Food Canada, dal Growing Forward-AgriFlex (numero RBPI numero 2555) e dal progetto Growing Forward II numero 1670, condotto dagli autori come parte delle loro funzioni. Questo studio è stato anche parzialmente finanziato dalla ZC Yuan di Grant RGPIN-2015-06052 del Ricercatore di Scienze Naturali e di Ingegneria del Canada (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
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