Summary
Tarif edilen hidrofobik kokültivasyon sistemi, metal örgülü elekler ile bozulmamış bitkileri destekler ve bunları bakteriler ile birlikte yetiştirir. Bitki dokuları, bakteriler ve salgılanan moleküller daha sonra aşağı akış analizleri için ayrıca hasat edilebilmekte, aynı anda her iki bitki barınağının ve etkileşen mikropların veya mikrobiyolojilerin moleküler tepkileri araştırılabilmektedir.
Abstract
Doğal bitki-mikrop etkileşimlerini taklit eden deneysel bir tasarım, kompleks bitki-mikrop sinyalizasyon süreçlerini tanımlamak için çok önemlidir. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Bakteriyel patogenez ve bitki etkileşimlerini incelemek için mükemmel bir model sistemi sağlar. Önceki bitki -Agrobacterium etkileşimleri çalışmaları, büyük oranda bitki hücre süspansiyon kültürleri, bitkilerin suni yaralanması veya sentetik kimyasallar ile mikrobik virulans faktörlerinin veya bitki savunmalarının yapay olarak indüklenmesine dayanıyordu. Ancak bu yöntemler bitkiler ve mikroplar tanımak ve mekansal ve zamansal şekillerde tepki plantanın doğal sinyalizasyon, farklıdır. Bu çalışma bozulmamış bitkilerin metal örgülü elekler tarafından desteklendiği ve Agrobacterium ile birlikte kültürlendiği bir hidroponik kokültivasyon sistemi sunmaktadır. Bu kokültivasyon sisteminde, sentetik fitotormon veya mikraya neden olan kimyasal madde bulunmamaktadırObial virulence veya bitki savunması tamamlanmaktadır. Hidroponik kokültivasyon sistemi, doğal bitki-mikrop etkileşimlerini ve planta sinyalizasyon homeostazı yakından andırıyor. Bitki kökleri, Agrobacterium içeren ortamdan ayrılabilir ve hem bitki barınaklarının hem de etkileşen mikropların sinyal ve tepkileri aynı anda ve sistematik olarak incelenebilir. Herhangi bir zaman / aralıkta, bitki dokuları veya bakteri, bu sistemin gücünü ve etkinliğini gösteren çeşitli "omiks" analizleri için ayrıca hasat edilebilir. Hidroponik kokültivasyon sistemi, 1) çeşitli bitki-mikrobik sistemlerin karşılıklı sinyal verme, 2) bitki konakçıları ile çoklu mikrobik türler ( örneğin mikrobik konsorsiyumlar veya mikrobiyomlar) arasındaki sinyalizasyon, 3) besin maddelerinin ve kimyasalların ilişkilendirilmesi Ve 4) mikropların bitki ev sahipleriyle nasıl etkileşime girdiğini ve bitki-biyolojik olara toleransını nasıl etkilediğiniR Abiyotik stresler.
Introduction
Bitki ile ilişkili mikrop biyojeokimyasal döngü, biyolojik giderme, iklim değişikliğinin hafifletilmesi, bitki büyümesi ve sağlığı ve biyotik ve abiyotik streslere karşı bitki toleransında önemli rol oynamaktadır. Mikroorganizmalar bitkilerle doğrudan bitki hücresi duvar teması yoluyla ve dolaylı olarak kimyasal salınım ve sinyalleme 1 , 2 , 3 aracılığıyla etkileşirler. Sabit organizmalar olarak, bitkiler patojenler tarafından enfeksiyona karşı doğrudan ve dolaylı mekanizmalar geliştirmiştir. Dolaylı savunma ikincil bitki metabolit üretimini ve patojenleri 4, 5 istila antagonistik organizmaların gözde içerisinde ise direkt savunma yapısal savunma ve savunma proteinlerinin ekspresyonunu içerir. Bitki kökenli kök sızıntıları, salgıları, müsilatları, müsigel ve lizatları rizosferin fiziksel-kimyasal özelliklerini çekme veya itme için değiştirirEv sahiplerine karşı mikrop 6 . Kök sekresyonunun kimyasal bileşimi, türe özgüdür, böylelikle bu bileşiklerin tanınması için yeterli mikroorganizmaların rizosfer 6'da gelişmesine izin veren seçici bir filtre görevini görür. Böylece uyumlu bir mikrobik türler de, bitki konakçıya 1 yararına veya zararına, aktif ve ilişkilerini geliştirmek için uyarılabilir.
Mikrobiyal ve kimyasal maruziyetin büyük bir kısmı kök yapısı ve toprak-hava arayüzü 2 , 6 , 7 , 8'de gerçekleştiği için, rizosferdeki bitki-mikrop etkileşimlerini anlamak, bitki verimliliğini ve ekosistemi işlerliği güçleştirmenin anahtarıdır. Bununla birlikte, yeraltı bitki-mikrop etkileşimlerinin ve karşılıklı tepkilerin incelenmesi, ilginç bir şekilde Karmaşık ve dinamik doğası ve sıkı kontrol edilebilir büyüme koşulları altında doğal kök yapısı ve bitki morfolojisi ile uygun deneysel modellerin olmaması. En ağır çalışılan fitopatojenlere biri olan Agrobacterium kiraz, elma, armut, üzüm dahil tarım ve bahçecilik öneme sahip bitkilerin geniş bir yelpazede bozar ve 9 yükseldi. Agrobacterium anlama bitki-patojen etkileşimlerinin önemli bir model organizma ve bitki transformasyonu ve tesis mühendisliği 10, 11, 12, 13, 14 bir güçlü bir araçtır.
Moleküler bitki- Agrobacterium etkileşimleri birkaç on yıl boyunca iyi çalışılmış ve Agrobacterium patojenisitesinin mevcut anlayışı geniş kapsamlı 9 ,F "> 11 , 15 , 16. Agrobacterium patojenitesi, büyük oranda, bitki kaynaklı sinyalleri algılama yetenekleri ve bunun virulans programının ve hücre-hücre iletişiminin ince modülasyonuyla sonuçlanan, yeterlilik nütrisyonu 17 olarak adlandırılan şekilde ortaya çıktığı anlamına gelmektedir. Agrobacterium virulence programı, rizosferdeki birkaç sinyal ile düzenlenir ve iki bileşenli sistemlerden oluşan ChvG / I sistemi ve VirA / G sistemini içerir: Rizosferdeki asidik koşullar, chvG / I , virA / G'nin transkripsiyonunu aktive eder ve virE0, virE1, virH1, virH2 ve tip VI salgılama sistemine (T6SS) 18. genleri de dahil olmak üzere, Agrobacterium patojenik, kapsanan çeşitli diğer genler asetosiringon (4'-hidroksi-3' , 5 de dahil olmak üzere fenolik bileşikleri, bitki-türevi '-dimetoksiasetofenon), V'yi aktive edinIrA / G 2 komponentli sistem fosforilasyon sinyal mekanizmaları vasıtasıyla 19 . VirA / G daha sonra tüm vir regülatörünü aktive eder ve transfer DNA'sı (T-DNA) olarak adlandırılan ~ 20 kb bakteri DNA fragmanının tümör kaynaklı (Ti) plasmidinden bitki çekirdeğine 16 aktarılması ve entegrasyonu ile sonuçlanır. T-DNA, indol-3-asetik asit (IAA) ( iaaM ve iaaH ) ve sitokinin ( ipt ) bitki hormonlarının sentezinden sorumlu genleri taşır ve bir zamanlar bitki hücrelerinde eksprese edildiğinde, bu bitkisel hormonların büyük miktarları üretilir. Bu, anormal doku çoğalması ve bitki tümörü gelişimine, yani 9 , 11 , 20 nolu bitkiler için kronik ve yeniden dirilme problemi olan kron kalp hastalığı ile sonuçlanır. IAA da Agrobacterium virulence'ı baskılamak veya Agrobacteriu'yu azaltmak için salisilik asit ve gama-amino bütirik asit ile birlikte hareket eder M zayıflama algılama (QS) 17 , 21 , 22 . Bu baskıya karşı koymak için, T-DNA da Agrobacterium patojenisitesini teşvik etmek için Agrobacterium çekirdeğini aktive eden ve ayrıca patojen 22 , 23 için bir besin kaynağı olarak görev yapan opine biyosentezi genleri taşır.
Agrobacterium -plant etkileşimleri ve bitki konakçığına dönüşen T-DNA transferinin derinlemesine anlaşılmasına rağmen, etkileşimin ilk aşamasındaki kompleks sinyal olayları daha az anlaşılır. Bu, kısmen Agrobacterium -plant sinyalizasyonunu araştıran konvansiyonel yaklaşımların kısıtlamalarına bağlı. Bitki hücre süspansiyon kültürleri ve suni bölgeye özgü yaralama, moleküler bitki-mikrop etkileşimleri 24 ,Ef "> 26 , 27. Ancak, hücre süspansiyonları tipik bitki morfolojisine sahip değildir, özellikle bitki süspansiyon hücreleri kök yapısı ve kök sızıntısı içermez ve bunlar mikrobiyal kemotaksis ve virülence aktive etmek için çok önemlidir 28 , 29. Bitki morfolojisinin korunması Ve kök yapısı, doğrudan enfekte bitki dokusunda 30 , 31 endüklenen bitki savunma ile ilgili genlerin saptanmasına neden olarak, bölgeye özgü enfeksiyonu kolaylaştıran yapay olarak yaralamış bitkiler tarafından ele alınmıştır.Ancak suni yaralanma, doğadaki patojen enfeksiyonundan belirgin olarak farklıdır , Çünkü özellikle yaralanma, doğal bitki sinyalizasyonunu ve savunmasını sistemik olarak engelleyen jasmonik asit (JA) birikimine neden olarak 26. Ayrıca, sentetik kimyasal maddeler tipik olarak bitki konukçu yanıtlarını yapay olarak indüklemek için kullanılırVeya patojen virulence. Bu tür kimyasal bileşiklerin planta konsantrasyonları yansıtacak şekilde takviye edilmesi mümkün olsa da, bu takviye, kök sızıntılarının, mikroskoplar 28 , 32 tarafından algılanan bir kemotaktik gradyan oluşturan çevresindeki rizosfer içerisindeki kademeli olarak difüzyonunu hesaba katmaz. Bitki-mikrop etkileşimlerinin incelenmesine yönelik geleneksel yaklaşımların sınırlamaları göz önüne alındığında, elde edilen verilerin doğruluğu ve derinliği engellenebilir ve kısıtlayıcı olabilir ve konvansiyonel yaklaşımlardan üretilen bilgiler doğrudan planta tercüme edilemez. Bitki- Agrobacterium sinyalizasyonunun bir çok yönü, özellikle hastalık semptomları henüz gelişmediğinde, etkileşimlerin erken evresinde tam olarak anlaşılamamıştır.
Konvansiyonel yaklaşımların sınırlamalarını değiştirmek için, bu çalışma, ucuz, sıkı kontrol edilebilir ve esnek hidroponik cAraştırmacılar moleküler bitki-mikrop etkileşimlerinin ilk aşamasında karmaşık sinyalizasyon ve yanıt yollarına daha derin kavrayışlar kazandıran bir ocultivation sistemi. Hidroponik bitki besin maddeleri, kök sızıntıları, büyüme koşulları ve metal toksisitesinin bitkiler üzerindeki etkilerini incelemek için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır 33 , 34 . Küçük mekan gereksinimleri, çeşitli bitki dokularının erişilebilirliği, besin / çevre koşullarının sıkı kontrolü ve zararlı / hastalık kontrolü dahil olmak üzere hidrofobik modellerin pek çok avantajı vardır. Ayrıca, 2-3 hafta sonra büyümeyi sınırlayan agar / fitoagar kaplama teknikleriyle karşılaştırıldığında, hidrofobik sistemler bitki büyümesini daha az sınırlandırmaktadır. Önemli olarak, bütün bitki yapılarının bakım mikrobiyal kemotaksisi ve hastalık oluşturma indüksiyonu 8, 29 için gerekli doğal kök sekresyonunu kolaylaştıran. Sistem açıklamasıBurada yatak 33 ve 34 seçeneklerinden daha basit ve daha az emek-yoğun. Daha az parça kullanır ve standart makas haricinde herhangi bir alet gerektirmez. Bitki büyümesi için güçlü bir destek ve mikrobik büyümeyi desteklemek için sallayarak steril koşullar altında basit bir havalandırma yöntemi olarak metal örgü kullanır (naylon 33'e karşı). Buna ek olarak, sistem, köklerinin genişliğini sınırlamaksızın çeşitli bitki türlerini barındıran bitki büyümesini desteklemek için çeşitli ebatlarda metal örgü kullanabilir.
Burada sunulan hidroponik kokültivasyon sisteminde bitkiler, bitki köklerinin aşılanmış bakterilerin büyümesini destekleyen organik bileşikleri salgılayan steril bir hidroponik sistemde yetiştirilir. Bu ko-yetiştirme sisteminde, bitki hormonları, savunma elitörü veya virulans indükleyici kimyasallar gibi yapay kimyasallar eklenmemektedir; bu da doğal hücrenin-Bitki-mikrop etkileşimleri sırasında homeostazı işaretleme. Bu hidroponik kokültivasyon sistemi ile, Agrobacterium tarafından enfeksiyon üzerine Arabidopsis thaliana Col-0 kökü dokusunda gen ifadesinin yanı sıra Arabidopsis ile birlikte yetiştirme üzerine Agrobacterium genlerinin aktivasyonu aynı anda belirlenebilirdi. Bundan başka, bu sistem, Agrobacterium (Şekil 1) ile birlikte kültürün (enfeksiyon) üzerine, kökler, aynı zamanda, bitki kök secretome profilini bitki Agrobacterium eki incelemek için uygun olduğu gösterilmiştir.
Şekil 1: Örnek Analizlerle Hidroponik Kokültürasyon Sistemine Genel Bakış. Bitkiler, ağın üstünde yetiştirilir (ağın üstünde sürgünler), kökleri hidrofobik ortamda daldırıp daha sonra bakteri fVeya kokültür. Bitki dokuları ve bakteriler daha sonra eşzamanlı ekstraksiyon ve analizler için ayrılır. Bu rakam referans 35'den değiştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deneysel Planlama
- Deneyin spesifik hedeflerini belirleyin.
- Aşağıdaki protokolün tümünü okuyun. Hangi bölümlerin belirli hedeflerle alakalı olduğunu ve herhangi bir değişikliğin yapılması gerekip gerekmediğini belirleyin. Örnekler için aşağıya bakınız.
- Deneylerin A. thaliana bitkilerini ve A. tumefaciens bakterisini aşağıda belirtildiği gibi kullanıp kullanmayacağını veya başka bir bitki-mikrob kombinasyonunu kullanıp kullanmayacağını düşünün.
NOT: Çeşitli bitki türleri kullanılabilirken, bitki köklerinin kalınlığı farklı boyutlarda bir ağ (adım 3.3) ve büyüme parametreleri (adım 3.10-3.11 ve 4.4) ve hidroponik tank büyüklüğü ve orta hacim (adım 4.2) ayarlama da gerektirebilir ( Şekil 2 ). Mikroplar, saf kültürler, karışık türler (konsorsiyum) veya çevresel örneklerden (mikrobiyomlar) kolayca aşılanabilir, ancak herhangi bir değişiklik protokolü, özellikle de 4.5 numaralı sayfayı etkileyebilir. - Yi hesaba katNumunelerin analizinde kullanılacak deney türleri.
NOT: Floresan mikroskobu (adım 5), floresan muhabir yapısı ile etiketlenmiş organizmaları gerektirir.
- Deneylerin A. thaliana bitkilerini ve A. tumefaciens bakterisini aşağıda belirtildiği gibi kullanıp kullanmayacağını veya başka bir bitki-mikrob kombinasyonunu kullanıp kullanmayacağını düşünün.
- Uygun kontrolleri tasarlayın. Bakteri ile aşılanmamış kontrol fideleri ile kontrol bakterileri ve tanklar ile inoküle edilen fideler olmadan hidroponik tankları dahil ediniz.
- Deneyleri, uygun sayıda tohum ve hidroponik tanklar ile planlayın. Kontroller, biyolojik çoğaltmaları (en az 3) ve tüm analizler için gerekli doku miktarlarını düşünün.
- Deneysel hedefler için kokültivasyonun uygun uzunluğunu belirleyin (adım 4.8).
- Gerektiği gibi, aşağıdaki adımları gözden geçirin.
Şekil 2. Hidroponik Sistemde Üretilebilecek, P Destekli Diğer Bitkiler Örnekleri Metal Mesh'in latformu. Çeşitli bitki tohumları ve ekimi için metal kafes takımının uyumluluğu. ( A ) 304 paslanmaz çelik kaynak metali Vicia faba için 3 × 3 örgü × .047 "çap tel. ( B ) Zea mays için paslanmaz çelik 304 kaynak metali 4 × 4 örgü × .035" çap tel. (C), paslanmaz çelik, 304 tipi WELDMESH 4 X 4 örgü Raphanus sativus için çap tel (kış .032" Glycine max (soya fasulyesi). (D) paslanmaz çelik, 304 tipi WELDMESH 6 x 6 meş 0,047" x için çap tel x turp). ( E ) Paslanmaz çelik 304 tipi kaynak metalleri 6 × 6 mesh × .047 "çapında Triticum türleri için tel ( F ) Paslanmaz çelik 304 tipi kaynak metalleri Cucumis sativus için 6 × 6 gözlü × 0,35" çap tel. Bu rakam referans 35'den değiştirildi.955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
2. Bitki Tohum Yüzey Sterilizasyonu
- Bir mikro santrifüj tüpünde 500 μL deiyonize su ile A. taliana'nın yaklaşık 200 tohumunu sarın (yüksek hızda). Büyük tohumlu bitki türleri için, yüzey sterilizasyonunu kolaylaştırmak için büyük bir tüp kullanın.
- Bunu masa üstü mikrosantrifüjde 30 saniye boyunca yaklaşık 9,000 xg'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak suyu (süpernatant) çıkarın.
- Tohumlara ve girdaplara 300 μL% 2 sodyum hipoklorit ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika bırakın. Daha büyük tohumları olan bitki türleri için tohumları kaplamak için daha büyük hacimler kullanın.
- Masa üstü mikrosantrifüjde 30 saniye süreyle yaklaşık 9,000 xg'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak sodyum hipoklorit çözeltisini çıkarın.
- Tohumlara ve vortekslere 500 μL steril, deiyonize su ekleyin. Için yaklaşık 9,000 xg'de santrifüjleyin30 s yıkayın ve steril bir pipet kullanarak suyu alın.
- Adım 4'ü bir kez daha 4 kez tekrarlayın.
- Tohumlara ve vorteklere% 70 etanolden 500 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 dakika bırakın.
- Masa üstü mikrosantrifüjde 30 saniye süreyle yaklaşık 9,000 xg'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak% 70 etanol çıkarın.
- Adım 5'i 5 kez tekrarlayın.
- Sterilize edilen tohumları 500 μL steril, ultra saf suyun içinde tekrar süspanse edin.
3. Tohum Çimlenmesi ve Yarı katı Bitkiler Yetiştiriciliği
- Yarı katı Murashige ve Skoog (MS) ortamı hazırlayın: 2.165 g / L MS bazal tuzları; 10 g / L sukroz; 0.25 g / L MES; Ve 4 g / L fitoagar ile 59 mL / L B5 vitamin karışımı, pH 5.75.
- MS maddesini otoklavlayın. Her steril derin Petri çanağı (100 x 25 mm 2) içine o 25 mL dökün.
- Her bir Petri kabı için 90 x 90 mm'lik bir paslanmaz çelik örgüyü kesin.
NOT: A. thaliana < / Em> sınıfı 304 (standart kalite), örgü sayısı (doğrusal inç başına delik sayısı) 40 x 40 ve tel çapı 0.01 "(0.0254 cm) 'dir. Daha büyük hidropinik tanklar için daha büyük bir örgü kare gerekir Veya daha yüksek platformlar. - Her kafes ağının köşelerini Petri plakasının içine sığacak şekilde bükün. Köşeleri, ağın kökleri tarafından desteklenmesini sağlamak için ağın hacmine 90 ° açı ile bükün ve kök gelişimi için yeterli boşluk bırakın ( Şekil 3a ).
- Kesilmiş örgülü kareleri bir behere koyun, alüminyum folyo ile kaplayın ve otoklav ile 30 dakika kuru bir çevrim ile sterilize edin.
- Ortam Petri tabaklarında katılaştıktan ve örgü steril olduktan sonra, her sterilize edilmiş örgü kare şeklini yarı-katı ortamın üzerine, eğik köşeler aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Köpüklerin ortama girmesi ve ağ örgüsünün ortamın üst yüzeyine değmesi için örgüyü itin (> Şekil 3b).
- Tek tek yüzey sterilize edilmiş A. thaliana tohumlarını (tohumlar vakum kuvveti nedeniyle pipetin ucunda kalacak) oluşturmak için 200 μL'lik bir transfer pipeti kullanın ve her tohumun ağın üst kısmına hafifçe aktarın. Tohumları, deneysel ihtiyaçlar için uygun şekilde aralık bırakacak şekilde yerleştirin ( örneğin, 4 6 tohum / plaka).
- Petri plakalarını kapaklarla kapatın, gözenekli cerrahi bantları kenarların etrafına yerleştirin.
- Karanlıkta 2 gün süreyle tüm Petri kabını 4 ° C'ye yerleştirerek tohumları tabakalaştırın ( örn., Karanlığı taklit etmek için kabuk sarın.)
- Petri kabında tohumları 22-24 ° C'de 10-14 gün boyunca 16 saatlik bir ışık periyoduyla yetiştirin ( Şekil 3c ).
Şekil 3: Hidroponik Bitki-mikrop Cocultivation Sistemi. Sol tarafNel, hidroponik ortak kültür sistemi kurulumunda ve işletilmesinde altı ana adımı özetleyen bir akış çizelgesini temsil eder. Doğru panel, Arabidopsis-Agrobacterium etkileşimleri incelendiğinde hidroponik kokültivasyon sistemi için gerçek deney materyalleri, teçhizat ve operasyon prosedürlerini gösterir. Bitki veya bakteri örneklemesi için aşılama adımı ve son adım şimdi gösterilmiştir. Bu rakam referans 35'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
4. Hydroponic Cocultivation Sistemi
- 2.165 g / L MS bazal tuzları, 10 g / L sukroz, 0.25 g / L MES ve 59 mL / L B5 vitamini karışımı, pH 5.75, sıvı Murashige ve Skoog (MS) ortamı hazırlayın.
- Ortamı otoklavlayın. Her bir steril silikon cam veya şeffaf plastik tanka 18 mL koyun (kristalize tabaklar, 100 x 80 mm2) steril kapaklarla yıkayın.
NOT: Tankları ve kapakları alüminyum folyo ile sararak ve otoklavda önceden sterilize edin. - Sterilize edilmiş bir kaputta, steril bir forseps kullanarak, 10-14 günlük fidelerdeki her bir örgü karesini yarı katı bir ortamdan hidroponik silindirik bir tanka hafifçe aktarın ( Şekil 3d ). Gözenekli cerrahi bant kullanarak kapakları kaplara yapıştırın.
- Depoda bulunan fideleri 22-24 ° C'de 72 saat boyunca, 16 saatlik bir ışık periyoduyla ve havalandırma için 50 dev / dak'da çalkalayarak yetiştirin ( Şekil 3e ).
NOT: Bu, bitkilerin mikroorganizmalarla aşılamadan (kokültivasyon) önce hidrofobik ortama uyum sağlamalarını sağlar. Bu bekleme süresi aynı zamanda, kazara mikrobiyal kontaminasyonun aşı öncesi belirginleşmesine izin verecektir.- Kuluçka döneminin bitiminden bir önceki gün sonraki adıma başlayın.
- AB ortamında A. tumefaciens üreterekKültür 600 1.0'lik nihai optik yoğunluğa ulaşana gece boyunca kadar çalkalama ile 28 ° C'de (% 0.5 / v maya hülasası,% 0.5 w / v tripton,% 0.5 w / hac sakaroz, 50 mM MgSO 4, pH 7.0 ağırlık) Nm (OD 600 ), boşluk olarak inoküle edilmemiş AB ortamı ile bir spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür.
NOT: Bir OD 600 1.0, yaklaşık 10 9 hücre / mL'ye eşdeğerdir. - A. tumefaciens'i eşit hacimde% 0.85 NaCl ile üç kez yıkayın. Eşit hacimde steril iki damıtık suda tekrar süspanse edin.
- Aşılamadan önce, kontamine olmadığından emin olmak için tankı fideler ile dikkatlice inceleyin; Kirlenmemiş tanklardaki ortam berrak ve şeffaf olmalıdır.
- Herhangi bir tankı bulutlu sıvı ile (kontaminasyon) atın ve tankların geri kalanına sayın. Numaralı her bir tanktan küçük miktarda (20 μL) hidrofobik ortamı örnekleyin ve Luria suyu (LB) ile doldurulmuş bir petri tablasına yerleştirin. tasarlamakÇanak 28 ° C'de.
- Hemen, numaralandırılmış her biri hidroponik tanka 50 μL A. tumefaciens süspansiyonu (yaklaşık olarak 5 x 10 7 hücre, OD 600'den tahmin edilmiştir) ilave edin. A. thaliana fidelerini ve A. tumefaciens'i 22-24 ° C'de 16 saatlik bir ışık periyoduyla ve 50 rpm'de çalkalayarak birlikte kültürleyin ( Şekil 3f ).
- 4.7.1 adımında lekeli LB plakasını inceleyin. Tankların sterilliğini doğrulamak için 12 ve 28 saat inkübasyondan sonra. Herhangi bir kirlenme varsa, daha aşağı akış tahlilleri için ilgili numara deposunu (bakteri ile aşılanmış) kullanmayın.
- İstenirse, tanktan bir ortam örneği çıkararak ve aşılanmamış bir kontrol ortamı içeren bir spektrofotometre kullanarak OD 600'ü ölçerek A.tumefaciens'in düzenli aralıklarla büyümesini izleyin ( Şekil 4 ).
YOK HAYIRTE: 7 gün sonra bitki hastalık belirtileri ortaya çıkmalıdır ( Şekil 5 ). - A. levreği kaldırarak bakteryal süspansiyontan A. thaliana kökleri ayırın; Bu adımın zamanlaması aşağı akış süreçlerine bağlıdır. Ayrıntılar için 5-8. Adımlara bakın.
- Sonraki analizler için kök kullanılıyorsa, kökleri hızlıca iki damıtılmış suda yıkayın. Yaprak veya başka bir doku kullanılıyorsa, dokuyu kesin. RNA analizleri için hemen adım 7.1'e geçin.
Şekil 4: Hidroponik Kokültürasyon Sisteminde Agrobacterium Büyümesi. Bir bitki konukçusu ( Arabidopsis ) varlığında veya yokluğunda Agrobacterium büyümesi her 4 saatte bir izlenmiştir. Agrobacterium hücreleri, AB ortamı O / N içinde yetiştirildi,% 0.85'lik NaCl ile 3 kez yıkandı ve hidrofobik sisteme inoküle edildi.Arabidopsis birlikte yetiştirme haricinde, başlangıç OD 600'ü yaklaşık 0.1'dir. OD 600 değerleri standart sapmalara ( OD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 hücre / mL) sahip üç biyolojik çoğaltmanın aracıdır.
Şekil 5: Birlikte yetiştirme sırasındaki Temsilci Bitki Fenotipleri ve Gözlemlenebilir Hastalık belirtileri. İnokülasyondan 4 gün sonra, aşılanmamış bitkilerle ( B ) karşılaştırıldığında hiçbir hastalık semptomu görülmemektedir ( A ). Cocultivation (enfeksiyon) 7 gün sonra, enfekte olmuş bitkilerde ( C ) hastalık semptomları görülürken, aşılanmamış bitkiler sağlıklı kalır ( D ).
5. Flüoresan Mikroskopisi
- Bir otofloresan protein için bir raportör yapı barındıran A. tumefaciens kullanın .Adım 4.5'deki kokültivasyon kurulumu.
NOT: Burada, dsRed 36'nın bir türevi olan pCherry'i eksprese eden değiştirilmiş bir pJP2 plasmid kullanılır. - Adım 4.8'de uygun bir ortak kültür ( örn., 48 saat) takiben , steril makas kullanarak bireysel sekonder kökleri (ana kökün yan dalları) ayırın.
- Gevşek bağlı olan maddeleri çıkarmak için kökleri iki kez damıtılmış suda yıkayın. Bir mikroskop lamı üzerinde 30 mcL suya her kök daldırın ve bir cam lamel ile örtün.
- Köklerin dehidrasyonunu önlemek için lamelin kenarlarını oje ile tutun.
- A. tumefaciens'in A. thaliana köklerine olan ilavesini flüoresan mikroskobu ile görselleştirin.
NOT: Burada, bir helyum-neon (He-Ne) 543/594 nm lazerden uyarılmış bir konfokal mikroskop, pCherry kırmızı flüoresanını ters çevrilmiş 63X su objektif objektifi altında 590-630 nm'de sayısal diyafram 1,4 ile görselleştirmek için kullanılır (
Şekil 6: Agrobacterium Kök Ataşmanı, Konfokal Mikroskopi ile Belirlenmiştir. PCherry kırmızı fluoresan etiketli Agrobacterium , helyum-neon (He-Ne) 543/594 nm lazerden uyarılarak 590-630 nm'de görselleştirildi. Görselleştirme, ters çevrilmiş 63X su lens objektifi altında, 1.4 sayısal açıklığı ile gerçekleştirildi. Ölçek çubukları = 11 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
6. Bakteriyel Transkript Analizleri
- 4.8. Adımda uygun bir ortak kültür ( örn., 8 saat) takiben , 4.9. Adımdaki gibi hidrofobik ortamdan kökleri ayırın. 1.5 mL, hidrofobik ortamı, 1.5 mL'lik bir mikroileHücrelerin pelet için 2 dakika için 12.000 xg santrifüj tüp ve santrifüj.
- Süpernatanı çıkarın. Aynı 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne bir başka 1.5 mL hidrofobik ortam aktarın ve hücreleri pelet haline getirmek için 2,000 g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın.
NOT: Protokol, kullanılacak kadar -80 ° C'de örnekleri dondurarak duraklatılabilir. - RNA'yı A. tumefaciens hücrelerinden, DNA bulaşmasını önlemek için standart yöntemler 37 veya DNase muamelesi ile uygun bir ticari RNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanarak ekstrakte edin.
NOT: Protokol, burada kullanilana kadar -80 ° C'de RNA kısımlarının dondurulması ile duraklatılabilir. - İzole edilmiş RNA'yı, aşağıdakileri de içeren standart yöntemleri kullanarak çeşitli analizler için kullanın.
- Üreticinin protokolüne göre, ticari olarak üretilmiş bir mikro-seriyi, kontrol ile birlikte kültive edilen grupta farklı olarak ifade edilen gen setlerini tespit etmek için kullanınkültür.
- Spesifik genlerin ekspresyonunu saptamak veya mikrodizil verilerini doğrulamak için kantitatif Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) kullanın 38 .
7. Bitki Transkript Analizleri
- Adım 4.8'de uygun bir kokültivasyonu ( örn., 8 saat) takiben, 4.9. Adımda olduğu gibi hidrofobik ortamdan kökleri ayırın veya gerekirse diğer dokuları ayırın. Hemen 150 mg kök veya diğer bitki dokularını sıvı nitrojene yerleştirin.
NOT: Protokol, kullanılacak kadar -80 ° C'de örnekleri dondurarak duraklatılabilir. - Dondurulmuş örnekleri, bir harç ve havlu kullanarak sıvı nitrojende toz haline getirin.
- Standart metot 39 ya da DNA kirlenmesini önlemek için DNase muamelesi ile uygun bir ticari RNA izolasyon ve saflaştırma kiti kullanarak tozun RNA'sını çıkarın.
NOT: Protokol burada RNA'nın alikotları dondurularak duraklatılabilir-80 ° C kullanıma kadar. - İzole edilmiş RNA'yı, aşağıdakileri de içeren standart yöntemleri kullanarak çeşitli analizler için kullanın.
- Kontrol bitkilerine kıyasla birlikte ekili olarak farklı şekilde ifade edilen gen setlerini tespit etmek için üreticinin protokolüne göre ticari bir mikro-dizi kullanın.
- Spesifik genlerin diferansiyel ifadesini saptamak veya mikrodizil verilerini doğrulamak için qRT-PCR kullanın 38 .
8. Gizli Profil Oluşturma
- Adım 4.8'de uygun bir birlikte kültürlenmeyi ( örn., 72 saat) takiben, adım 4.9'daki gibi hidrofobik ortamdan kökleri ayırın. 0.2 mL gözenekli filtreden 50 mL konik tüplere geçirilerek 18 mL hidrofobik ortamın sterilize edilmesi.
- -80 ° CO / N'de örnekleri dondurun.
- 50 mL konik tüplerin üzerindeki başlıkları gevşetin ve 36 saat boyunca dondurarak kurutma makinesine yerleştirin. Numuneleri saklamak veya işlemek için ilerleyin (desAşağıda tasvir edildi) HPLC analizi ve bileşik tespiti için hazırlanmıştır.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir. - Her örneği mühürlenebilir bir test tüpünde 5 mL'lik çift damıtılmış suda tekrar süspanse edin.
- 5 mL etil asetat ilave edin ve tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın.
- Fazların oda sıcaklığında 5 dakika süreyle ayrılmasına izin verin.
- Pipetleme ile üst (organik faz) yeni bir kaba aktarın. Gerekirse, birden fazla organik fraksiyon havuz.
- Hafif bir azot akımı altında kurutun (~ 45 dakika).
- Numuneyi, HPLC için uygun bir çözeltide ( örn., % 100 metanol) yeniden süspanse edin.
- HPLC'yi standart yöntemlere göre 40 uygulayın .
- Bileşikleri uygun yöntemlerle tespit edin.
NOT: Elektrosprey İyonizasyon Süre Uçuş Kütle Spektrometresi (ESI-TOF-MS) 40 burada kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hidroponik birlikte işleme sisteminde büyüme
A. tumefaciens C58'in büyüme eğrisi, başlangıçtaki 16 saatlik kokültivasyonda belirgin bir gecikme fazı gösterirken bunu A. thaliana Col-0 ile birlikte uygulandığında yaklaşık olarak 0.9'dan maksimum OD 600'e kadar çok dengeli bir büyüme izledi Postokültasyondan 48 saat sonra. Aksine, A. thaliana içermeyen kontrol kültüründe esas itibariyle bakteri üremesi gözlemlenmemiştir ( Şekil 4 ). Bu sonuçlar, ilave besin maddeleri suni olarak sağlanmadığı takdirde, bitki kökünden salınan kimyasal bileşikler, suda yaşayan ağaç yetiştirme sisteminde Agrobacterium büyümesini destekleyebildiğini göstermektedir. Kokültürasyonun ilk 16 saatindeki önemli gecikme evresi, patojen ile birlikte yetiştirme üzerine oldukça karmaşık ev sahibi algısı ve aşamalı kök sekresyonuna atfedilebilir./ P>
Birlikte yetiştirilen A. thaliana bitkileri, A. tumefaciens'in yokluğunda yetiştirilen kontrol bitkileriyle karşılaştırıldığında, ilk 3 gün boyunca hastalık belirtileri göstermemiştir ( Şekil 5a , 5b ). Bununla birlikte, 5 gün süren kokültivasyondan sonra, farklar giderek görünür hale geldi ve sahte işlem gören kontrol bitkileri daha yeşil ve daha sağlıklıydı. Agrobacterium ile 7 gün süren kokültivasyondan sonra, bitki dokusu erken çiçeklenmenin yanı sıra kloroz ve nekroz gösterdi ( Şekil 5c, 5 d ). Arabidopsis'de erken çiçeklenme, bir dizi phylogenetically farklı patojenler tarafından enfeksiyonun genel bir sonucudur 41 , 42 .
Agrobacterium'un bitki köklerine yapışmasının mikroskobik olarak görselleştirilmesi
A. tumefaciens , yaklaşık olarak tipik bir çubuk benzeri veya filament şeklindeki bitki kökü yapısına lokalize edildi. Genişliği 0,5 um ve uzunluğu 3-5 um'dir ( Şekil 6 ). Bakteri hücrelerinin çoğu dikey önceki bilgilere uygun olarak, kök hücre duvarının yüzeyine bağlı olduğu bir polar bir şekilde 32 hücre duvarının Agrobacterium bağlanır.
Bu sonuçlar, hidroponik kokültivasyon sisteminin, kök yapısına bağlanma ve enfeksiyon prosesi gibi , planta bakteri dinamiklerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılabileceğini düşündürmektedir. Aslında, diğer mikropların yokluğunda, bu kokültivasyon sistemi, planta bakteri-bitki bağlanmasını doğrudan gözlemlemek için gürültülü bir platform sağlar. Agrobacterium virulence transkriptlerinin aktivasyonu
8 saatlik kokültivasyondan sonra A. tumefaciens hücreleri RNA izolasyonu için hasat edildi ve temsili virulans genlerinin transkripsiyon seviyeleri qRT-PCR ile değerlendirildi ( Şekil 7 ). Viralens genleri ropB, virA, virD1, virH1, virE0 ve chvG'nin ekspresyonu , A. thaliana'sız kontrol ile karşılaştırıldığında, bitki konakçı ile birlikte işleme sırasında belirgin şekilde yükselmiştir . Spesifik olarak, mRNA'nın çokluğu ropB 330% oranında, virE0 için% 40, Vira için% 94 oranında, virD1 için% 70, chvG için% 100 artmıştır ve virH1 için% 48.
Bu sonuçlar, desteklemedenSentetik virülans indükleyici kimyasallarla birlikte, hidrofobik kokültivasyon sisteminde kimyasal salgılayan bitkiler, Agrobacterium virulence programlamayı aktifleştirebilirler. Agrobacterium virulence genlerinin indüklenmesi, hidrofobik kokültivasyon sistemindeki bitki kaynaklı sinyallere Agrobacteria'nın tepki vermesinin bir göstergesidir. Agrobacterium ropB'nin ve chvG'nin Arabidopsis ile birlikte yetiştirme üzerine uyarıldığı çok enteresandır, önceki çalışmalar bu genlerin asidik koşullar 18 tarafından indüklendiğini ancak iyi bilinen virülans oluşturucu bir bileşik 19 olan asetosiringon tarafından uyarıldığını göstermiştir. Bu sonuç, Arabidopsis kökenli tanımlanamayan bileşiklerin ropB ve chvG ekspresyonunu indükleyebildiğini göstermektedir . Bununla birlikte, bu virülans üreten kimyasallar daha fazla tanımlanmalıdır.
Şekil 7. Hidroponik Kokültürasyon Sisteminde Agrobakteriyum Virulansının Aktivasyonu. Altı Agrobacterium virülans faktörünün mRNA seviyeleri niceliksel olarak qRT-PCR ile ölçülmüştür. Virülans faktör transkriptlerinin bolluğu 16S rRNA transkriptlerine göre normalize edildi. Veriler, 3 biyolojik çoğaltmanın ortalama ± standart sapmasını (hata çubukları) temsil eder ve P -değerleri öğrencinin t-testi ile elde edilir.
Bitki transkriptlerinin ifadesi
Daha önce A. thaliana'da farklı olarak ifade edildiği gösterilen beş gen için qRT-PCR analizi gerçekleştirildi (yayınlanmamış veriler). Beklendiği gibi qRT-PCR, AGP 30'un (AT2G33790) ve NAS 1'in (AT5G04950) sırasıyla% 97 ve% 89 oranında aşağı regüle edildiğini doğrularken, HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) ve klips 1 (AT3G22840) kontrol grubuna karşı 3 tekrarın her (3800, 540, ve 510 sırasıyla% olarak) (Şekil 8) yukarı-regüle edildi.
Şekil 8: A. thaliana Kök Transkriptlerinin qRT-PCR'si. Her bir mRNA transkriptinin bolluğu ACTIN II transkriptinde olduğu gibi normale döndü. Veriler, 3 biyolojik çoğaltmanın ± standart sapma (hata çubukları) ortalamaları olup, P -değerleri öğrencinin t-testi ile elde edilmiştir.
Salgı profillerini barındıracak değişiklikler
Kök kaynaklı bileşiklerin bitki türleri 6 , 8 arasında büyük oranda farklı olduğu gösterilmiştir. roEksuda bitki-mikrop etkileşimleri sırasında çeşitli sinyal yanıtları ortaya çıkaran moleküler sinyalleri içerir 1 , 43 . Kök-salgılanan bileşikler yararlı bakteriler 29 çekilmesine bağlı olarak zorunludur dışında Bununla birlikte, mikrop etkileşim, aşağıdaki zaman ana salgılama profilleri progresif farklar çok daha az, anlaşılmalıdır. A. tumefaciens C58 ile 72 saatlik kokültivasyonun ardından, A. thaliana Col-0 secretome profillerindeki farklılıklar, pozitif iyon modu LC-MS analizi ve aşılanmamış A. thaliana Col-0 ile karşılaştırmalar yoluyla ( yani , Agrobacterium'un yokluğunda ). Yeni bileşiklerin Agrobacterium inokülasyonunun bir sonucu olarak ortaya çıkmasıyla, sekretomde belirgin bir değişim gözlendi ( Şekil 9 ). Toplam olarak, 35 bileşik, Agrobacterium- aşılanmış planın sekretomunda nispeten zenginleştiTs iken, inoküle edilmemiş bitkilerin sekretomunda 76 arttırıldı ( Şekil 9 ). Sonuncusu büyük olasılıkla A. tumefaciens C58'in enfeksiyon öncesinde karşılaşacağı bileşikleri temsil eder. Bu bileşikler belirlenmedi ve spesifik kök türevi bileşiklerin diferansiyel salgılanması bu çalışma bağlamında belirlenmemesine rağmen, sekretome analizinde, bu hidroponik kokültivasyon sistemi kullanılarak konukçu salgı profillerinde saptanabilir farklılıklar olduğu gösterildi.
Şekil 9: A. thaliana Col-0 Kök Sekreter Analizi. A. thaliana Col-0 secretome profillerinin analizi, sahte aşılanmış ve aşılanmış numuneler için üçer kez tamamlanmıştır. Her tedavi grubundaki salgı profillerinde bulunan 138 eşsiz kütle sinyali (bileşik) için pik alanlar ortalaması alınmış veTespit edilebilir bileşiklerin farklılıklarını görselleştirmek için her bileşiğin bolluğundaki farkı (mock-inoculated eksi inoküle) hesaplamak için ortalama değerler kullanıldı. Büyük negatif fark değerleri olan bileşikler, aşılanmış bitkilerin secretome'sında daha bol bulunurken, pozitif farkları büyük olanlar, sahte aşılanmış bitkilerin secretome'sinde daha bol miktarda bulunurlardı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kök sekresyonunun aşamalı doğası göz önüne alındığında, planta üretilen virülence neden olan kimyasalların konsantrasyonu ve dinamik bitki-mikrop etkileşimleri üzerindeki etkileri, uzaysal ve zamansal gradyanlarda gerçekleşir. Bu hidroponik birlikte işleme sisteminde, herhangi bir sentetik fitotormon veya mikrobik virulans veya bitki savunmasına neden olan kimyasal eklenmez. Aksine, klasik yaklaşımları kullanarak, asetosiringon gibi sentetik kimyasalların eklenmesi, konsantrasyonlarda ani, yapay bir artış yaratır. Bu nedenle, bu hidrofobik kokültivasyon sistemi, mikropların ve konukçu bitkilerin mekânsal ve zamansal tavırları tanıdığı ve yanıtladığı doğal çevreyi daha yakından taklit eder.
Burada, Agrobacterium virulence genlerinin Arabidopsis ile birlikte üretildiğinde aktive olduklarını göstermek mümkün oldu. Bu, doğal bitki kökenli kimyasalların Agrobacterium virulence'ını indüklediğini gösterir. Geleceğin eBu kimyasalları tanımlamak ve virülans oluşturan bileşik asetosiringonun aralarında olup olmadığını doğrulamak için ffort'a ihtiyaç duyulmaktadır. Ek olarak, Agrobacterium ile birlikte yetiştirme üzerine Arabidopsis kök geni ifadesi ve sekretome profillerinde önemli değişiklikler gözlemlenerek, bitki-mikrop etkileşimleri sırasında bitki konakçı yanıtlarını ve salgı profillerini incelemek üzere hidroponik kokültivasyon sisteminin potansiyelini ortaya koymuştur. Aslında, hidroponik kokültivasyon tekniğini kullanarak, bitki konaklarının gen ekspresyonu ve sekrete edici profilleri, bu transkripsiyonel veya sekretodez değişikliklerinin sonraki bitki-mikrop etkileşimlerini nasıl kolaylaştırdığını veya caydırdığını aydınlatmaya yardımcı olacak mikrobik etkileşime giden ve takip eden herhangi bir aşamada incelenebilir .
Arabidopsis - Agrobacterium sinyalizasyonunun incelenmesine ek olarak, hidroponik kokültivasyon sistemi, diğer önemli bitki-mikrobik sistemlerini incelemek üzere uyarlanabilir. Yapmak için kullanılabilirÇok çeşitli patojenik ya da faydalı mikroorganizmalara karşı tek tek ya da toplu hareket eden bitki yanıtlarını aydınlatmak ve nispeten "doğal" koşullardaki farklı bitki barınaklarına mikrobik bağlanma ve tepkiler üzerinde çalışmak. Tipik fide morfolojisinin korunması, moleküler bitki-mikrop etkileşimlerinin aydınlatılması için önemlidir. Diğer bakteri, mantar veya herbisit patojenler söz konusu olduğunda, ek besinler, kokültivasyon sırasında mikrobiyal büyümeyi desteklemek için desteklenebilir.
Bununla birlikte, farklı bitki-mikrobik sistemler ile birlikte yetiştirme için dikkate alınması gereken birkaç parametre bulunmaktadır. Tohum büyüklüğüne ve kök morfolojisine bağlı olarak, daha büyük tohumlar ve fideler için, büyük deliklerle metal örgü ve kök yapılarının, örgü yüzeyinin altında tam olarak gelişmesini ve sürgün dokularının yukarıya doğru çoğalmasını sağlamak için daha büyük bir büyüme konteyneri gerekebilir. Kurulumun daha yüksek bir platformu içerecek şekilde değiştirilmesi de gerekebilir. Bu gerçekleştirilebilir bDaha geniş bir karesi kare kesip köşelerden uzağa bükerek, kafes yüzeyini kabın tabanından daha yukarı kaldırın veya kafesden bir Yunan çapraz keserek ve her damganın girintilerinde bükerek. Tabii ki, her sistem için kısıtlamalar vardır ve burada sunulan, daha uzun süre yetişen daha büyük bitkiler ( örneğin olgun mısır) için yararlı olmayacaktır. Ayrıca, bazı organizmalar, bu sistemi kullanırken sarsıntıdan daha fazla havalandırma gerektirebilir.
Kuşkusuz doğada meydana gelen dinamik bitki-mikrop etkileşimlerini tam ve mükemmel şekilde tekrarlayan bir laboratuarda bir sistem tasarlamak çok zordur veya hatta imkansızdır. Hidroponik kokültivasyon rizosferdeki doğal koşulları, en azından kavramsal olarak, bozulmamış kök yapıları ve bitki morfolojisi ile daha yakından temsil etmekle birlikte, sistemde toprak veya toprak mikroorganizmaları yoktur. Bununla birlikte, bu sistem uyarlanabilirMikrobiyolojileri kontrol edilebilir bir ortamda incelemek ve bitkiler veya mikropların farklı biyotik veya abiyotik uyaranları nasıl algıladıklarını ve bunlara tepki verdiklerini öğrenmek gibi farklı ihtiyaçları karşılamak için. Bu hidrofobik kokültivasyon sistemi, mikrobiyolojilerin ve bunların hidrolojik veya ekosistemdeki işlevlerini anlamasını kolaylaştırabilir. Bu, hidrofobik sera endüstrisi için veya bitki ve mikropların su ekolojisi için hastalık yönetimi ve bitki sağlığı için çok önemlidir.
Buna ek olarak, bu hidroponik kokültivasyon sistemi biyo-birleşmeyi incelemek ve mikroplardaki veya bitkilerdeki ilgili metabolik süreçleri ve düzenleyici yolları aydınlatmak için uyarlanabilir. Dahası, bu hidroponik kokültivasyon sistemi, mevcut (allelokimyasallar) ve / veya uygulanmış (sentetik) besinlerin ve kimyasal sinyaller / bileşiklerin mikroplar veya bitki barınakları üzerindeki etkileri üzerine araştırmayı kolaylaştırır 44 . Dolaylı olarak etkileyen bitki dokularının mevcudiyeti ( örn.0; Yaprak, filiz), bitki hazırlama ve bu sinyallerin nasıl dönüştürüldüğü gibi diğer bitki savunma süreçlerini keşfetme olanağı sağlar.
Bu birlikte-yetiştirme sisteminin en kritik kısmı kontaminasyonu önlemektir. Özellikle, yarı katı ortamdan tanka bitkilerin aktarımı, hidropik ortamın kirlenmesini önlemek için çok dikkatli yapılmalıdır. Bu nedenle, bu deney adımının biyolojik güvenlik kabininde steril koşullar altında yapılması gereklidir ve deneyler, deney için herhangi bir mikroorganizma aşılanmadan önce 2-3 gün beklemelidir.
Özetle, hidrofobik kokültivasyon sistemi, tipik bitki morfolojisini ve bitki kök yapısının bütünlüğünü muhafaza ederek deneysel süreç boyunca geleneksel yaklaşımların çeşitli sınırlamalarını iyileştirir. Buna ek olarak, sistem eklentiden kaçınırSentetik kimyasalların, örneğin bitki hormonları veya savunma / virülans oluşturan kimyasallar üzerine etkileri. Böylelikle, mikrobun ve konukçu bitkilerin mekansal ve zamana dayalı tavırları tanıması ve yanıt vermesi doğal çevreyi daha yakından taklit eder. Bu kokültivasyon sistemi, endofitik veya epifizik mikroplar da dahil olmak üzere, daha "doğal" ve yönetilebilir koşullarda farklı bitki-mikrobik sistemler üzerinde çalışmak üzere uyarlanabilir. Planta etkileşimlerin patogenez, simbiyoz veya bitki gelişimi promosyonu gibi çeşitli yönleri incelenebilir. Hidroponik kokültivasyon sistemi, hem bitkiler hem de mikropların fizyolojik, biyokimyasal ve moleküler tepkileri hakkında yeni bilgiler sağlayabilir. Herhangi bir zaman / aralık veya büyüme aşamasında, hidroponik kokültivasyon sisteminde büyüyen bakteriler veya bitkiler, bitki ve mikrobik transkriptomikler, bitki ve mikrobik metabolomikler, bitki ve mikrobiyal sekretom ve bioremediati gibi çeşitli "omik" analizleri için ayrıca örneklenebilirlerüzerinde. Dahası, bu hidroponik ortak kültür sistemi, kontrol edilebilir bir çevrede bitki konakçıları ve mikrobiyomlar arasındaki etkileşimleri incelemek üzere uyarlanabilir. Özetle, hidrofonik kokültivasyonun avantajları, moleküler bitki-mikrop etkileşimini ve sinyallemeyi ortaya çıkarmak için üstün bir sistemi örneklemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yardımları ve yararlı tartışmaları için Brian Weselowski ve Alexander W. Eastman'a teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca Dr Dr teşekkür etmek istiyorum. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui ve Greg Thorn'a yardımları, faydalı tartışmaları ve elyazmasının eleştirel okumaları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, yazarlar tarafından görevlerinin bir parçası olarak yürütülen Tarım ve Tarımsal Gıda Kanada, Büyüyen İleri-AgriFlex (RBPI numarası 2555) ve Büyüyen İleri II projesi 1670 tarafından finanse edildi. Bu çalışma kısmen ZC Yuan'a ödenecek Doğal Bilimler ve Kanada Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
- Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
- Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
- Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
- Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
- Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
- Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
- Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
- Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
- Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
- Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
- Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
- Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
- Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
- León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
- Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
- Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
- Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
- Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
- Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
- Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
- Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
- Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
- Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).
