Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für einen mausspezifischen Test der Kognition vor, der kein Schwimmen erfordert. Dieser Test kann verwendet werden, um kontrollierte kortikale Auswirkungen-induzierte traumatische Hirnverletzung Mäuse von Scheinkontrollen erfolgreich zu unterscheiden.
Abstract
Trotz der jüngsten Zunahme der Verwendung von Mausmodellen in der wissenschaftlichen Forschung, Forscher weiterhin kognitive Aufgaben, die ursprünglich entworfen und validiert wurden für Ratte verwenden. Der Radial-Wasser-Schritt (RWT) Labyrinth-Test des Raumgedächtnisses (speziell für Mäuse entworfen und kein Schwimmen erforderlich) wurde bisher gezeigt, um erfolgreich zwischen kontrollierten kortikalen Schlag-induzierten TBI-Mäusen und Scheinkontrollen zu unterscheiden. Hier wird ein ausführliches Protokoll für diese Aufgabe vorgestellt. Das RWT-Labyrinth nutzt die natürliche Tendenz von Mäusen, um offene Flächen zugunsten der Umarmung der Seiten eines Apparates (Thigmotaxis) zu vermeiden. Die Wände des Labyrinths sind mit neun Fluchtlöchern versehen, die über dem Boden des Apparates platziert sind, und Mäuse sind ausgebildet, um visuelle Hinweise zu verwenden, um das Fluchtloch zu finden, das aus dem Labyrinth herausführt. Das Labyrinth ist mit einem Zoll kaltes Wasser gefüllt, genug, um die Flucht zu motivieren, aber nicht tief genug, um zu verlangen, dass die Maus schwimmt. Die Erwerbszeit beträgt nur vier SchulungenTage, mit einem Test der Gedächtnisretention am Tag fünf und ein Langzeitgedächtnistest am Tag 12. Die hier gemeldeten Ergebnisse deuten darauf hin, dass das RWT-Labyrinth eine machbare Alternative zu Ratten-validierten, schwimmenden kognitiven Tests bei der Beurteilung von räumlichen ist Speicherdefizite in Mausmodellen von TBI.
Introduction
Gedächtnisstörungen gehören zu den häufigsten Symptomen, die von Patienten nach traumatischen Hirnverletzungen (TBI) 1 , 2 berichtet wurden . Eine genaue Identifizierung und Bewertung von analogen Speicherdefiziten in Tiermodellen von TBI ist daher für unser Verständnis dieser Bedingung und ihrer Verwaltung unerlässlich. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um räumliches Gedächtnis in einem Mausmodell von TBI unter Verwendung eines Radial Water Tread (RWT) Labyrinths zu testen. Dieses Gerät wurde bisher gezeigt, um kognitive Defizite in Mausmodellen von kontrollierten kortikalen Auswirkungen (CCI) -induzierten TBI 3 zu bewerten und stellt eine mögliche Alternative zu Ratten-validierten, schwimmen-basierten Tests der Kognition dar.
Die zunehmende Vielfalt und Verfügbarkeit von transgenen Mausmodellen hat zu einer jüngsten Zunahme der Verwendung von Mäusen gegenüber Ratten in der wissenschaftlichen Forschung geführt 4 . Trotz dieser Verschiebung verlassen sich die Forscher weiterhin auf VerhaltensweisenKognitive Aufgaben, die ursprünglich für die Rattengebrauch entworfen und validiert wurden. Die häufigsten Tests, die zur Beurteilung der Erkenntnis bei Mäusen, dem Morris Water Maze (MWM) und dem Barnes Circular Labyrinth verwendet wurden, wurden speziell entworfen, um auf instinktive Verhaltensweisen, die bei Ratten 5 , 6 gefunden wurden, zu profitieren. In Anbetracht der genetischen, neuroethologischen und kognitiven Unterschiede, die zwischen diesen beiden Arten 4 bestehen , ist es nicht überraschend, dass Mäuse sich konsequent diesen Aufgaben unterziehen 7 , 8 .
Speziesabhängige Unterschiede in der Prüffähigkeit sind insbesondere bei schwimmenden kognitiven Tests wie dem MWM zu berücksichtigen. Während sowohl Ratten als auch Mäuse kompetente Schwimmer sind, haben Forscher mehrere Mausstämme identifiziert, die bemerkenswert schlecht auf schwimmenden kognitiven Aufgaben 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Sogar bei Wildtyp-Tieren übertreffen Ratten in der Regel Mäuse 7 , 8 . Während dies als Spezies-spezifischer Unterschied im Raumgedächtnis interpretiert werden konnte, zeigten analoge Folgeuntersuchungen mit einem Trockenland-Labyrinth keine speziesabhängigen Unterschiede in der kognitiven Leistungsfähigkeit 8 . Eine Reihe von Faktoren, die nicht mit der Erkenntnis in Zusammenhang stehen, könnte für diesen Befund verantwortlich sein, einschließlich artenabhängiger Unterschiede in der Schwimmfähigkeit oder der Suchstrategie. In der Tat zeigen die Faktorenanalyse von mausspezifischen Suchstrategien im MWM, dass nicht-kognitive Faktoren (insbesondere Thigomotaxis und Passivität [ dh Floating]) eine bedeutendere Rolle bei der MWM-Leistung spielen können als das räumliche Lernen 14 .
Hier zeigen wir den Einsatz eines kognitiven Tests, der darauf abzielt,Stinktuales Verhalten von Mäusen, und die kein Schwimmen erfordert, um die räumliche Gedächtnisstörung in einem Mausmodell von CCI-induziertem TBI zu messen. Während das RWT-Labyrinth ( Abbildung 1 A-B ) als neuartiges Hybrid aus dem MWM- und Barnes-Kreis-Labyrinth konzipiert wurde, wurde es speziell entworfen, um das thigmotaktische Verhalten instinktiv für die Mäuse 15 , 16 zu nutzen . Die Apparatur besteht aus einer galvanisierten Stahlwanne mit einem Durchmesser von 32 Zoll, in der sich neun gleichmäßig beabstandete Austrittslöcher gebohrt haben. Die Löcher sind 2-1 / 4 Zoll über dem Boden der Wanne zentriert und sind so bemessen, dass sie häufig vorhandene 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Fangadapter passen. Acht der Ausgänge sind von außen verschlossen und bis zu einer Tiefe von 1 Zoll mit Gummistopfen verblendet. Der Neunte ist durch ein 90 ° Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS) -Ellbogen mit einer opaken Plastikbox verbunden, aus der die Maus nach dem Testen leicht entfernt werden kann. Im Laufe einesKurze Erfassungsperiode, wird die Maus trainiert, um die einzigartigen visuellen Cues zu verwenden, die das Labyrinth auskleiden, um diese Fluchtbox zu lokalisieren. Während des Testens wird das Labyrinth mit einem Zoll kaltes Wasser (12-14 ° C) gefüllt, das ausreichend aversiv genug ist, um die Flucht zu fördern, aber nicht tief genug, dass die Maus zum Schwimmen benötigt wird.
Das RWT-Labyrinth stellt eine kostengünstige, wartungsarme Alternative zum MWM dar und wurde erfolgreich bei alten und transgenen Mäusen 15 , 17 , 18 , 19 und CCI-induzierten Mausmodellen von TBI 3 eingesetzt . Das hier skizzierte Protokoll stellt eine einfache und effektive Methode zur Messung der räumlichen Gedächtnisstörung dar, die keine Vorverletzungstraining erfordert und sich leicht an die Bedürfnisse eines Forschungslabors anpassen lässt.
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Protocol
Alle Verfahren und Tierhandhabung wurden in Übereinstimmung mit den Tierpflege-Richtlinien von den National Institutes of Health und von der University of Washington Animal Care and Use Committee durchgeführt.
1. Chirurgie
- Anästhesieren Sie die Maus bei 5% Isofluran in einer Induktionskiste bis unbewusst. Bestätigen Sie die Anästhesie durch eine Verringerung der Atemfrequenz und das Fehlen eines Rückzugsreflexes nach Zehensperre.
- Pflegen Sie die Anästhesie über Nasenkegel bei 2-2,5% während der Operation. Überwachen Sie die Atemfrequenz während der Operation, um sicherzustellen, dass die Maus unbewusst bleibt.
- Legen Sie die Maus anfällig auf ein Heizkissen und positionieren Sie die Maus in die stereotaktische Gerät mit Ohrbügel, so dass der Kopf sicher und flach ist.
- Haare aus der Kopfhaut mit Haarentfernungscreme entfernen. Spülen Sie die Kopfhaut gründlich mit Kochsalzlösung.
- Reinigen Sie die chirurgische Stelle mit einem abwechselnden Jod und 70% Ethanol waschen.
- AdministeRa-subkutane Injektion von Lidocain und Bupivacain (1 mg / kg) an der Kopfhaut.
- Mit chirurgischen Scheren, machen eine Längsschnittlinie Einschnitt, und ziehen Sie die Haut, um den Schädel zu enthüllen.
- Mit einer 5 mm Trephinsäge-Vorform eine Kraniotomie über die linke frontoparietale Kortex mit Mittelpunkt bei 2,5 mm hinter Bregma und 2,5 mm links von der Mittellinie. Entfernen Sie vorsichtig den Kreis des Knochens, um das Gehirn freizulegen.
- Stellen Sie das Impaktorgerät auf eine Geschwindigkeit von 6 m / s und 200 ms Verweilzeit ein.
- Positionieren Sie die Impaktor-Vorrichtung, bis die 3 mm konvexe Schlagspitze die Oberfläche des Gehirns bei 2,5 mm hinter Bregma und 2,55 mm links von der Mittellinie leicht berührt. Ziehen Sie die Aufprallspitze ein und senken Sie um 1 mm (Aufpralltiefe). Wenn bereit, schießen Sie das Gerät, wodurch die gewünschte Wirkung.
- Decken Sie die Kraniotomie mit einer sterilen Polypropylen-Scheibe zementiert, um die Haut mit Gewebe Klebstoff zementiert, und Naht der Einschnitt geschlossen.
- Entfernen Sie die Maus aus der Anästhesie und geben Sie die IP-Injektion von BuprEnorphin (0,5 mg / kg).
- Lassen Sie die Maus in einem sauberen Käfig erholen, erwärmt von einem Heizkissen. Die Maus sollte während der nächsten 24 Stunden auf Anzeichen von Schmerzen oder Bedrängnis überwacht werden.
HINWEIS: Scheinkontrollen sollten eine identische Behandlung wie oben erhalten, wobei die Schritte 1.8-1.9 weggelassen wurden.
2. Radiale Wasser-Lauffläche Maze Bau
- Bore 9 Ausstiegslöcher, groß genug, um 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter, in gleichen Intervallen um den Umfang einer 32 Zoll Durchmesser galvanisierten Stahlwanne unterzubringen. Zentrieren Sie diese Austrittslöcher etwa 2-1 / 4 Zoll über dem Boden der Wanne.
- Setzen Sie einen 1-1 / 2 Zoll ABS DWV SPG x SJ Fangadapter in jede der Austrittslöcher und sichern Sie mit den mitgelieferten Ringmuttern.
- Mit Gummistopfen, Kappe acht der neun Ausgänge aus dem Äußeren des Gerätes. Die endgültige, unbeschlossene Ausfahrt dient als Fluchtweg. Es spielt keine Rolle, welcher Ausgang als Fluchtweg bezeichnet wird.
- Befestigen Sie ein 90 ° ABSEllenbogen zum äußeren Ende des verbleibenden Ausstiegs. Die 90 ° -Biegung dient dazu, die Versuchspersonen daran zu hindern, den richtigen Fluchtweg aus dem Inneren des Labyrinths visuell zu bestimmen.
- Konstruieren Sie die Fluchtkiste aus jeder opaken Box, die in der Lage ist, saniert zu werden und ungefähr 30 cm x 15 cm x 15 cm groß zu sein. Schneiden Sie ein Loch auf der Seite der Box, direkt über dem Boden, groß genug, um die 90 ° ABS Ellenbogen unterzubringen.
- Bringen Sie den Fluchtkasten an der Klemmende des 90 ° ABS Ellenbogens an.
- Ziehen Sie den Fluchtkasten (weniger als einen Zoll) über die Oberfläche des Bodens. Dies ermöglicht genügend Platz für ein elektrisches Heizkissen oder eine andere Heizquelle, die unter dem Fluchtkasten platziert werden soll.
- Drucken und Laminieren mindestens 5 einzigartige, visuelle Hinweise. Verwenden Sie einfache, kontrastreiche Bilder, die man leicht aus dem Gerät heraus erkennen kann. Schwarz-Weiß-Clipart-Formen (Dreieck, Quadrat, Kreis) werden empfohlen.
- Mit Magneten, haften die visuellen Hinweise auf die Innenwände derGerät. Cues sollten ungefähr gleich weit entfernt sein, um den Umfang des Gerätes herum.
3. Radiales Wasser-Laufflächen-Labyrinth-Protokoll
HINWEIS: Wasser-Labyrinth-Tests sollten erst beginnen, nachdem die chirurgische Stelle geheilt wurde (etwa eine Woche nach der Operation).
- Vorbereitung zum Testen.
- Lassen Sie Mäuse mindestens 30 Minuten vor dem Testen auf den Prüfraum einwirken.
- Das Gerät mit einem 70% igen Ethanol-Spray reinigen.
- Füllen Sie das Gerät mit ca. 1 Zoll kaltes (12-14 ° C) Wasser.
- Legen Sie einen elektrischen Heizkissen oder eine andere Heizquelle direkt unter die Fluchtbox. Halten Sie die Fluchtbox dunkel und warm während der Dauer der Prüfung.
- Positionieren Sie eine helle Lichtquelle über das Gerät.
HINWEIS: Wenn Sie eine Lampe verwenden, die für die Forschung von Tieren aus dem Gerät selbst sichtbar ist, achten Sie darauf, dass die Lampe in der gleichen Position platziert wirdJeden Tag. Die Lampe selbst könnte ein weiteres visuelles Stichwort für die Mäuse darstellen, um die Fluchtkiste zu finden und sie drastisch von Tag zu Tag zu bewegen, könnte die Ergebnisse komplizieren.
- Testprotokoll
- Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig vorsichtig am Schwanz und legen Sie sie in die Mitte des Gerätes.
- Sobald das Tier im Apparat ist, beginnen Sie mit dem Timing.
- Sobald das Tier den richtigen Ausgang gefunden hat und den Escape-Box gefunden / eingegeben hat, stoppen Sie das Timing und notieren Sie die Anzahl der Sekunden, die benötigt werden, um den richtigen Pfad zu finden.
- Wenn das Tier versucht, in ein abschließendes Loch zu klettern und nicht spontan wieder in das Labyrinth nach 10 s zurückzukehren, führen Sie das Tier zurück in die Mitte des Labyrinths von Hand.
- Wenn das Tier den richtigen Weg zur Fluchtbox innerhalb von 3 min (180 s) nicht findet, schätzt man den Prozeß als Ausfall und notiert als 180 s. Führen Sie das Tier sorgfältig auf den richtigen Weg von Hand.
- Erlaube dieMaus, um in der Fluchtbox für eine 1 min zu bleiben, inter-trial Rest.
- Sobald die 1 min Ruhe vergangen ist, entfernen Sie das Tier aus dem Fluchtkasten und kehren Sie zu seinem Hauskäfig zurück.
- Die Fluchtkiste gründlich abwaschen und mit einem 70% igen Ethanol-Spray ausstoßen, um zu verhindern, dass die Maus mit olfaktorischen Cues den richtigen Fluchtweg findet. Dieser Schritt sollte nicht mehr als ein paar Sekunden dauern.
- Bringe die Maus zum Labyrinth für den nächsten Versuch.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.9, bis die Maus insgesamt drei Versuche abgeschlossen hat, und hat sich entweder dreimal in die Escape-Box gelegt.
- Nach der letzten 1 min Rest, die Maus zu seinem Hauskäfig zurückkehren.
- Ablassen und ersetzen Sie das Wasser in den Apparat zwischen den Tieren, um eine gleichbleibende Temperatur während der Prüfung zu gewährleisten.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.12 für jede zu testende Maus.
- Am folgenden Tag wiederholen Sie die Vorbereitungsschritte 3.2.1-3.2.5. Achten Sie besonders darauf, dass visuelle Hinweise bleibenIn konsequenten Positionen zwischen Testtagen.
- Testen Sie die Tiere mit dem obigen täglichen Testprotokoll für drei Versuche pro Tag für vier Tage (Trainingsphase), mit einem endgültigen Drei-Test-Test für Speicher-Retention am fünften Tag. Ein sechster Drei-Test-Test (Long Term Memory Retention) kann am zweiten Tag gegeben werden.
- Führen Sie keine Tests zwischen den Testtagen fünf und zwölf durch.
- Analyse
- Wenn eine Maus das Labyrinth in unter 180 s während einer zwei-tägigen Periode nicht abschließen kann ( dh insgesamt aufeinanderfolgende 6 Versuche, die alle auf 180 s gezählt wurden), betrachten Sie die Maus unzureichend durch die Testbedingungen motiviert und entfernen Sie die Analyse.
- Berechnen Sie die mittlere Latenz, um das Labyrinth für jedes Fach durch das Testen des Datums durch Mittelung ihrer drei täglichen Versuche für diesen Tag abzuschließen.
- Erhalten Sie Gruppenunterschiede in der Speichererhaltung mit Standard-T-Tests, um Gruppen am fünften Tag Test und Langzeit-Speicher Testdatum zu vergleichen. Wenn mErz als zwei Gruppen verglichen werden, sollte eine einseitige ANOVA, gefolgt von einer angemessenen Post-Hoc-Analyse (wie Tukey-Test), um jede mögliche Bedeutung zu verfolgen, stattdessen verwendet werden.
- Erwerben Sie Gruppenunterschiede in der Erfassungsperiode (Tage 1-4) durch wiederholte Messungsanalyse der Varianz.
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Representative Results
Das RWT-Labyrinth ( Abbildung 1 ) wurde verwendet, um verletzungsabhängige räumliche Gedächtnisdefizite bei Mäusen zu untersuchen, die zufällig zugeordnet wurden, um entweder kontrollierte kortikale Schlag-induzierte TBI- oder Sham-Chirurgie zu erhalten. Die Verletzung erfolgte mit einem solenoidgetriebenen kortikalen Aufprall mit einer 3 mm konvexen Spitze und den folgenden Verletzungsparametern: 6 m / s Schlaggeschwindigkeit, 1 mm Eindringtiefe und 200 ms Kontaktzeit. Die Mäuse erhielten kognitive Tests ab 35 Tagen nach der Operation und erhielten vier Tage Training (Erwerbszeitraum), gefolgt von einem Test der Gedächtnisretention am Tag 5 und einem Test des Langzeitgedächtnisses am Tag 12, wie oben beschrieben Protokoll. Abbildung 2 zeigt eine klare Gruppenunterscheidung in der Latenz, um das Labyrinth über die Zeit zwischen TBI-Mäusen und Scheinkontrollen abzuschließen. Die Analyse der hier präsentierten Daten ergab, dass die Latenz bei Scheinkontrollen im Vergleich zu TBI-Mäusen signifikant reduziert wurde Am Tag 5 und am Tag 12 ( Abbildung 2 ). Kein Thema traf die Kriterien, die von den Testbedingungen als unzureichend motiviert angesehen wurden, und somit wurden keine Mäuse aus der Analyse entfernt.
Abbildung 1: Radiales Wasser-Laufflächen-Labyrinth.
Das Labyrinth besteht aus einer 32-Zoll-galvanisierten Stahlwanne mit neun Ausgängen, jeweils 2-1 / 4 Zoll über dem Geräteboden. Von diesen Ausgängen enden acht nach etwa 1 Zoll (Köderausgänge), und man führt zu einem beheizten Fluchtkasten (30 cm x 15 cm x 15 cm), der hinter einer 90 ° -Winkelbiegung verborgen ist, um eine visuelle Bestätigung des Fluchtwegs zu verhindern. Bei Erreichen der Fluchtkiste erhielten die Fächer eine 1-minütige Zwischenstunde. Der Apparat ist mit einem Zoll kaltes Wasser (12 - 14 ° C) gefüllt, um das Fluchtverhalten zu motivieren und mit fünf einzigartigen visuellen Merkmalen für die räumliche Orientierung zu versehen./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55986/55986fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse des Radial-Wasser-Tread-Labyrinths.
C57BL / 6J Mäuse, 10 Wochen alt, erhielten entweder kontrollierte Kontrolle Auswirkungen (n = 11) oder sham (n = 6) Chirurgie. Verletzungsparameter waren wie folgt: 3 mm konvexe Schlagspitze, 6 m / s Geschwindigkeit, 1 mm Tiefe der Penetration und 200 ms Verweilzeit. Mäuse begannen RWT-Labyrinth-Tests 35 Tage nach der Verletzung. Testprotokoll bestand aus drei Versuchen pro Tag für vier Tage (Erfassungszeitraum), gefolgt von einem Drei-Test-Test der Speicherretention am Tag fünf und ein Drei-Test-Langzeit-Gedächtnistest am Tag 12. Wiederholte Maßnahme Analyse der Varianz gefunden Nr Gruppenunterschiede während des Erwerbszeitraums (Tage 1-4) (F [1,15] = 1,844, p> 0,05). Die Latenz, das Labyrinth zu vervollständigen, wurde bei TBI-Mäusen im Vergleich zu Scheinkontrollen am Tag 5 signifikant erhöht (t [15] = 1,907, p <0,05) und Tag 12 (t [15] = 2,242, p <0,05). Datenpunkte repräsentieren Gruppenmittel (± SEM). Die Signifikanz wurde durch den Standard-T-Test bestimmt (Ein-Tailed, basierend auf einer priori Hypothese von Gruppendifferenzen) und wird als p <0,05 (*) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier vorgestellte RWT-Labyrinth-Protokoll unterscheidet erfolgreich zwischen CCI-induzierten TBI-Mäusen und Sham-Kontrollen und stellt eine durchführbare, mauszentrische Alternative zum MWM- und Barnes-Kreis-Labyrinth dar. Während die hier gemeldeten Ergebnisse nur über die Verwendung des RWT-Labyrinths in einem TBI-Mausmodell sprechen, wurde dieses Gerät erfolgreich in alten und transgenen Modellen eingesetzt, bei denen eine stressbedingte Nichteinhaltung durch schwimmende Tests mit dem MWM unpraktisch 15 , 17 durchgeführt wurde , 18 , 19 Andere Mausmodelle, in denen Noncompliance oder motorische Defizite potenzielle Forschungsprobleme sind, können auch von dieser kognitiven Aufgabe profitieren.
Zusätzlich zu den zuvor diskutierten Designvorteilen ist einer der Vorteile des RWT-Labyrinths seine Einfachheit sowohl in der Konstruktion als auch in der Anwendung. Das Gerät selbst ist einfach mit rel konstruiertSehr kostengünstige Materialien und kann ohne Beschädigung seiner Komponenten saniert werden, so dass es ideal für spezifische pathogenfreie (SPF) Anlagen ist. Der Erwerbszeitraum benötigt nur vier Tage Test, ohne dass eine Vorverletzung erforderlich ist. Tägliche Tests beinhalten minimale Zeit Engagement (~ 10 min / Tier), und erfordert wenig Erfahrung vor Meisterschaft. Aufgrund seiner Einfachheit in Konstruktion und Anwendung ist das RWT-Labyrinth ideal für ein Labor, das durch ein relativ knappes Budget begrenzt ist und mit wenig bis zu keiner Verhaltens- oder kognitiven Testerfahrung.
Es gibt mehrere Schritte, die Forscher ergreifen können, um die Potentialvarianz zu reduzieren, wenn wir das hier beschriebene Protokoll verwenden. Einige Empfehlungen, um konsistente, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erreichen, sind die Prüfung zu ähnlichen Tageszeiten über Kohorten, mit der gleichen Person / Personen, um Tests, wenn möglich, die Aufrechterhaltung einer ruhigen und ruhigen Testumgebung und umfangreiche Handhabung von Mäusen vor dem Testen. Es sollte auch betont werdenDass die Wassertemperatur, die in diesem Protokoll aufgeführt ist, zu erfolgreichen Testbedingungen für männliche C57BL / 6J-Mäuse führte, sind Temperaturpräferenz und Hypothermie stark belastend und geschlechtsabhängig 20 . Labs sollten ihre eigenen vorläufigen Tests durchführen, wenn sie andere Stämme oder weibliche Mäuse verwenden, um einen wirksamen Temperaturbereich zu bestimmen, der keine Hypothermie hervorruft. Schließlich sollten visuelle Hinweise einfach, leicht unterscheidbar und sichtbar für Themen während der Prüfung sein. Grundlegende Schwarz-Weiß-Formen (laminiert oder ummantelt in Plastik, so dass sie saniert werden können) sind vorzuziehen.
Während das hier beschriebene Testprotokoll relativ einfach ist, könnte es leicht angepasst werden, um den Forschern eine Fülle von Informationen über die Latenz zu entkommen zu geben. Tierverfolgungssoftware kann eingesetzt werden, um eine Fülle von zusätzlichen Parametern zu sammeln und könnte verwendet werden, um gruppenspezifische Unterschiede im Suchverhalten zu identifizieren. Solche Software ist nicht inhärentFür das Testen aber, wie hier gezeigt, Zusätzlich werden Sondenversuche, bei denen der Ausgang zum Fluchtkasten blockiert ist oder die visuellen Stichwörter gedreht worden sind, um den Ausstieg in einem Abschlußloch anzuzeigen, verwendet werden, um das hier beschriebene Protokoll zu ergänzen. Während eine viertägige Erfassungsperiode alles war, was notwendig war, um die hier präsentierten repräsentativen Ergebnisse zu generieren, ermutigen wir Forscher, andere TBI-Parameter / Modelle oder genetische Belastungen zu testen, um eigene Pilotproben durchzuführen und die Trainingszeit nach Bedarf zu verkürzen oder zu verlängern .
Es gibt Einschränkungen mit diesem Prüfprotokoll, die Erwähnung verdienen. Zuerst kann das Ersetzen des kalten Wassers und das Desinfizieren des Apparates zwischen den Subjekten sowohl zeitintensiv als auch körperlich anspruchsvoll sein. Um die Aufmerksamkeit der Forscher zu minimieren, sollte die Prüfung in einem Raum mit einem verfügbaren Bodenablauf durchgeführt werden, um die Wasserentwässerung zu erleichtern, und der leichte Zugang zu einem kalten Wasserspiegel mit angeschlossenem Schlauch. Zweitens die Verwendung vonHand-Timing ohne Videoaufnahme führt zu einem Risiko menschlichen Fehlers. Da Tracking-Software für einige Labore unerschwinglich teuer sein kann, ist ein solches Risiko jedoch unvermeidlich, wenn Hand-Timing verwendet werden muss. Darüber hinaus, wie bei der MWM, kann das räumliche Gedächtnis nicht in denselben Themen mit dem RWT-Labyrinth ( dh , sobald das Labyrinth gelernt wurde), es kann nicht abgelehnt werden, um weitere räumliche Gedächtnisprüfung zu ermöglichen). Auch können Effekte von TBI-bezogenen motorischen Defiziten auftreten, die die Fähigkeit von TBI-Mäusen verändern könnten, das Labyrinth im Vergleich zu Shams durchzuführen. In diesem Sinne kann es jedoch sein, dass alle Nagetier-Raumspeichertests, die eine Bewegung erfordern, eine ähnliche Einschränkung haben würden. Motion Tracking Software könnte mit dem RTM eingesetzt werden, um die Gesamtweglänge und -geschwindigkeit zu bewerten und solche Unterschiede zu quantifizieren. Schließlich sollten die Forscher sich bewusst sein, dass das hier beschriebene RWT-Labyrinth nicht den einzigen Nicht-Schwimmen-Test darstellt, der für die Prüfung von Kognition in Mausmodellen von TBI verfügbar ist. Andere tEsts, wie das y-labyrinth, wurden verwendet, um den Schein von TBI-Mäusen erfolgreich zu unterscheiden 21 . Die Forscher sollten die Vor- und Nachteile jedes Tests abwägen, bevor sie entscheiden, welche in ihrem Labor verwendet werden sollen.
Das hier beschriebene RWT-Labyrinth-Protokoll stellt eine neuartige, mausspezifische Alternative zu den Ratten-validierten kognitiven Tests dar, die derzeit in der Maus-Modell-Forschung verwendet werden, und erfordert kein Schwimmen. Da der Einsatz von Mausmodellen in der wissenschaftlichen Forschung weiter steigt, könnte die eventuelle Annahme von Maus-validierten Forschungsinstrumenten zu genaueren Forschungsergebnissen führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch das Institut für Translational Health Sciences Pilotprojekt Zuschuss Gelegenheit (UL1TR000423), die University of Washington Zentrum für menschliche Entwicklung und Behinderung, und die University of Washington Animal Behavior Core und Brain Imaging Core. Wir möchten Dr. Warren Ladiges für seine Rolle bei der Entwicklung und Verbreitung des ursprünglichen Radial Water Tread Labyrinthdesigns und Protokolls, das hier vorgestellt wird, anerkennen. Wir danken auch Toby Cole für seine Unterstützung bei diesem Projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub | Home Depot | Internet #206638142 | Needed: 1 |
| 1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter | Home Depot | Internet #100344703, Store SKU #188956 | Needed: 9 |
| 1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper | Home Depot | Internet #100114974 Store SKU #755844 | Needed: 8 |
| 1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow | Home Depot | Internet #100346663 Store SKU #188603 | Needed: 1 |
| HDX 10 Gal. Storage Tote |
Home Depot | Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804 | Needed: 1 |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | Needed: 1 |
| Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals | Leica Biosystems | 39463001 | Needed: 1 |
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