Summary
यहां हम अनुज्ञप्ति के एक माउस-विशिष्ट परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जिसके लिए तैराकी की आवश्यकता नहीं होती है। इस परीक्षण को नियंत्रित नियंत्रण से प्रेरित कॉर्टिकल इफेक्ट आघातक मस्तिष्क चोट चूहों को सफलतापूर्वक भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Abstract
वैज्ञानिक अनुसंधान में माउस मॉडल के उपयोग में हाल ही में वृद्धि के बावजूद शोधकर्ताओं ने संज्ञानात्मक कार्यों का उपयोग करना जारी रखा जो मूल रूप से चूहे के उपयोग के लिए तैयार और मान्य थे। रेडियल वॉटर ट्राड (आरडब्ल्यूटी) स्पेसियल मेमोरी की भूलभुलैया परीक्षण (चूहों के लिए विशेष रूप से तैयार किया गया है और कोई तैराकी नहीं की जरूरत है) को पहले से दिखाया गया है कि नियंत्रित कॉर्टिकल इफेक्ट-प्रेरित टीबीआई माइस और शाम नियंत्रणों यहां, इस कार्य के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। आरडब्लूटी भूलभुलैया एक तंत्र के पक्षों (थिग्मोटैक्सिस) के गले लगाने के पक्ष में खुले क्षेत्रों से बचने के लिए चूहों की प्राकृतिक प्रवृत्ति को कैपिटल करता है भूलभुलैया की दीवारें तंत्र के फर्श के ऊपर स्थित नौ एस्केप छिदों के साथ खड़ी होती हैं, और चूहों को भूलभुलैया से बाहर निकलने वाले एस्केप होल का पता लगाने के लिए दृश्य संकेतों का उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित किया जाता है। भूलभुलैया ठंडे पानी के एक इंच से भरा हुआ है, जो बचने के लिए पर्याप्त है, लेकिन गहरी नहीं है कि माउस तैरने की आवश्यकता होती है। अधिग्रहण अवधि केवल चार प्रशिक्षण लेती हैदिन, पांच दिन मे स्मृति प्रतिधारण की परीक्षा और 12 दिन की लंबी अवधि की स्मृति परीक्षण। परिणाम यहां बताए गए परिणाम से पता चलता है कि आरडब्लूटी भूलभुलैया चूहा-मान्यकृत, तैराकी-आधारित संज्ञानात्मक परीक्षणों के लिए स्थानिक के मूल्यांकन में है टीबीआई के माउस मॉडल में स्मृति घाटे
Introduction
मानसिक क्षति (टीबीआई) 1 , 2 के बाद मरीजों द्वारा दी गई सबसे आम लक्षणों में मेमोरी कम्युनिकेशन शामिल हैं। टीबीआई के जानवरों के मॉडल में समरूप स्मृति घाटे के सटीक पहचान और आकलन, इसलिए, इस स्थिति की समझ और उसके प्रबंधन के लिए आवश्यक हैं। यहां, हम एक रेडियल वाटर ट्राइड (आरडब्ल्यूटी) भूलभुलैया का उपयोग करके टीबीआई के माउस मॉडल में स्थानिक स्मृति परीक्षण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस उपकरण को पहले नियंत्रित सीटिकल प्रभाव (सीसीआई) -इंड्यूज टीबीआई 3 के माउस मॉडल में संज्ञानात्मक घाटे का आकलन करने के लिए दिखाया गया था, और चूहे-मान्य, अनुशासन के तैर-आधारित परीक्षणों के संभावित विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है।
बढ़ती विविधता और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की उपलब्धता ने वैज्ञानिक अनुसंधान 4 में चूहों पर चूहों के उपयोग में हाल ही में वृद्धि का नेतृत्व किया है। इस बदलाव के बावजूद, शोधकर्ताओं ने व्यवहार पर भरोसा जारी रखा हैएनडी संज्ञानात्मक कार्य जो मूल रूप से चूहे के उपयोग के लिए डिज़ाइन और मान्य थे। वर्तमान में चूहों, मॉरिस वॉटर मेज़ (एमडब्ल्यूएम) और बार्न्स परिपत्र भूलभुलैया में अनुभूति का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम परीक्षण विशेष रूप से चूहों 5 , 6 में पाए जाने वाले instinctual behaviors को भुनाने के लिए बनाया गया था। आनुवंशिक, न्यूरोथोलॉजिकल और संज्ञानात्मक मतभेदों को ध्यान में रखते हुए इन दो प्रजातियों 4 के बीच मौजूद हैं, यह आश्चर्यजनक नहीं है कि चूहों ने इन कार्यों 7 , 8 पर लगातार प्रदर्शन किया।
परीक्षण क्षमता में प्रजातियों पर निर्भर मतभेद विशेष रूप से तैराकी-आधारित संज्ञानात्मक परीक्षणों में हैं, जैसे कि एमडब्ल्यूएम (MWM) चूंकि दोनों चूहों और चूहों निपुण तैराक हैं, शोधकर्ताओं ने कई माउस उपभेदों की पहचान की है जो तैराकी-आधारित संज्ञानात्मक कार्यों 9 , 10 , 11 , 12 , 13 जंगली प्रकार के जानवरों में भी, चूहों ने आम तौर पर चूहों 7 , 8 को मात दी। हालांकि यह स्थानिक स्मृति में एक प्रजाति-विशिष्ट अंतर के रूप में व्याख्या की जा सकती है, सूक्ष्म भूमि भूलभुलैया का उपयोग करते हुए अनुरूप अनुवर्ती परीक्षण ने संज्ञानात्मक प्रदर्शन 8 में कोई प्रजाति-निर्भर मतभेद नहीं दिखाया। अनुज्ञप्ति के लिए असंबंधित कई कारक इस तैयारी के लिए जिम्मेदार हो सकता है, जिसमें तैरने की क्षमता या खोज रणनीति में प्रजातियों पर निर्भर मतभेद शामिल हैं। दरअसल, एमएमएमएम में माउस-विशिष्ट खोज रणनीतियों का कारक विश्लेषण यह दर्शाता है कि गैर-संज्ञेत्मक कारक (विशेष रूप से, थिग्टोमैक्सिस और पासिटी [ यानी , फ्लोटिंग]) स्थानिक शिक्षा 14 की तुलना में एमडब्ल्यूएम प्रदर्शन में एक और महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं।
यहां, हम इन पर ध्यान देने के लिए डिज़ाइन किए गए एक संज्ञानात्मक परीक्षण का उपयोग करते हैंसीसीआई-प्रेरित टीबीआई के माउस मॉडल में स्थानिक स्मृति हानि को मापने के लिए, चूहों के विशिष्ट व्यवहार और जो तैराकी की आवश्यकता नहीं होती है जबकि आरडब्लूटी भूलभुलैया ( चित्रा 1 ए-बी ) को एमडब्ल्यूएम और बार्न्स परिपत्र भूलभुलैया के उपन्यास हाइब्रिड के रूप में माना गया था, यह विशेष रूप से थिगमटैक्टिक वर्चुअल इंस्ट्रिनैक्चुअल का चक्कर 15 , 16 तक लेने के लिए बनाया गया था। इस उपकरण में एक 32 इंच व्यास जस्ती इस्पात टब होता है जिसमें नौ समान रूप से दूरी के बाहर निकलने के छेद ऊब गए हैं। छिद्रों को टब के फर्श के ऊपर 2-1 / 4 इंच ऊपर केंद्रित किया जाता है और आमतौर पर 1-1 / 2 इंच के एबीएस डीडब्ल्यूवी एसपीजी एक्स एसजे ट्रैप एडेप्टर को फिट करने के लिए आकार दिए जाते हैं। आठ बाहर निकलते हैं और रबड़ स्टॉपर्स के साथ 1 इंच की गहराई तक अंधे हैं। नौवें 90 डिग्री एसीलॉनट्र्रियल ब्यूटाडियन स्टायरन (एबीएस) कोहनी से एक अपारदर्शी प्लास्टिक बॉक्स से जुड़ा हुआ है जिससे माउस को परीक्षण के बाद आसानी से हटाया जा सकता है। एक के दौरानसंक्षेप में अधिग्रहण अवधि, माउस को इस बच बॉक्स का पता लगाने के लिए भूलभुलैया को अनूठा दृश्य संकेतों का उपयोग करने के लिए प्रशिक्षित किया गया है। परीक्षण के दौरान, भूलभुलैया एक इंच के ठंडे पानी (12-14 डिग्री सेल्सियस) से भर जाता है, पर्याप्त भागने को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त उत्पीड़न करता है, लेकिन गहरी पर्याप्त नहीं है कि माउस को तैरना आवश्यक है।
आरडब्लूटी भूलभुलैया MWM के लिए कम लागत वाली, कम रखरखाव विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, और यह 15 , 17 , 18 , 1 9 और वृद्ध और ट्रांसजेनिक चूहों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, और टीबीआई 3 के सीसीआई प्रेरित माउस मॉडल। यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल, किसी पूर्व चोट प्रशिक्षण की आवश्यकता के लिए स्थानिक स्मृति हानि को मापने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता है, और एक शोध प्रयोगशाला की विशेष आवश्यकताओं के अनुरूप इसे आसानी से संशोधित किया जा सकता है।
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Protocol
सभी प्रक्रियाएं और पशु हैंडलिंग स्वास्थ्य देखभाल के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा जारी किए गए पशु देखभाल दिशानिर्देशों और वाशिंगटन पशु देखभाल एवं उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा आयोजित किए गए थे।
1. सर्जरी
- जब तक बेहोश नहीं हो जाता है तब तक 5% आईसोफ्लुरेन पर माउस को एनेस्थेटिज़ करें। साँस लेने की दर में कमी और निषिद्ध चुटकी के बाद वापसी वापसी की अनुपस्थिति से संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
- सर्जरी के दौरान 2-2.5% पर नाक शंकु के जरिए संज्ञाहरण बनाए रखें। माउस को बेहोश बनी हुई है यह सुनिश्चित करने के लिए सर्जरी में श्वास दर की निगरानी करें।
- माउस प्रेशे को एक हीटिंग पैड पर रखें और माउस को स्टिरोटैक्टिक डिवाइस में कान की सलाखों का उपयोग करके रखें, यह सुनिश्चित करें कि सिर सुरक्षित और सपाट है।
- बालों को हटाने क्रीम का उपयोग करके खोपड़ी से बाल निकालें खोपड़ी को खारा से अच्छी तरह से कुल्ला।
- एक वैकल्पिक आयोडिन और 70% इथेनॉल धोने के साथ सर्जिकल साइट को साफ करें।
- Administeखोपड़ी पर लिडोकाइन और बुप्पाकाइन (1 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे के इंजेक्शन
- सर्जिकल कैंची के साथ, एक अनुदैर्ध्य midline चीरा बना, और खोपड़ी प्रकट करने के लिए त्वचा को वापस ले लें।
- 5 मिमी ट्रेफिन का उपयोग करने से बाएं फ्रंटोपायरियेटल कॉर्टेक्स पर केंद्र बिंदु के साथ 2.5 मिमी के पीछे ब्रेंमा और 2.5 मिमी के बीच मध्य रेखा के बाईं ओर क्रानियोटमी को देखा। मस्तिष्क को उजागर करने के लिए हड्डी के चक्र को ध्यान से निकालना
- प्रभावक यंत्र को 6 एम / एस और 200 एमएस के समय पर रहने के लिए वेग पर सेट करें।
- जब तक 3 मिमी उत्तल प्रभाव टिप प्रभावित नहीं होती है, तब तक ब्रीगममा के पीछे 2.5 मिमी और मिडलाइन के 2.55 मिमी के ऊपर मस्तिष्क की सतह को हल्का छूता है। प्रभाव टिप को वापस ले लें, और 1 मिमी (प्रभाव गहराई) से कम। तैयार होने पर, उपकरण को आग लगा दें, वांछित प्रभाव उत्पन्न करें।
- ऊतक चिपकने वाला त्वचा के लिए एक बाँझ polypropylene डिस्क के साथ craniotomy को कवर, और चीर बंद चीर बंद।
- संज्ञाहरण से माउस निकालें, और आईपी इंजेक्शन को बीपर देंएनोरफ़ीन (0.5 मिलीग्राम / किग्रा)
- माउस को एक साफ पिंजरे में पुनर्प्राप्त करने दें, एक हीटिंग पैड से गर्म। अगले 24 घंटे में दर्द या संकट के लक्षणों के लिए माउस की निगरानी की जानी चाहिए।
नोट: शाम नियंत्रणों को ऊपर दिए गए समान उपचार प्राप्त करना चाहिए, चरण 1.8-1.9 छोड़े गए।
2. रेडियल वॉटर ट्राइड भूलभुलैया निर्माण
- बोर 9 से बाहर निकलें छेद, 1 इंच / 2 इंच एबीएस डीडब्ल्यूवी एसपीजी एक्स एस जे ट्रैप एडाप्टर को 32 इंच व्यास जस्ती इस्पात टब के परिधि के समान बराबर अंतराल पर समायोजित करने के लिए पर्याप्त है। टब के फर्श के ऊपर से लगभग 2-1 / 4 इंच ऊपर इन छेदों को केंद्र में रखें।
- 1-1 / 2 इंच के एबीएस डीडब्ल्यूवी एसपीजी एक्स एसजे ट्रैप एडाप्टर को प्रत्येक बाहर निकलने के छेद में फ़िट करें, और शामिल रिंग पागल के साथ सुरक्षित करें।
- रबड़ के स्टॉपर्स के साथ, तंत्र के बाहरी हिस्सों में से आठ निकासों में से आठ। अंतिम, अनकैप्टेड निकास बच निकलने के मार्ग के रूप में काम करेगा। इससे कोई फर्क नहीं पड़ता कि बाहर निकलने से एस्केप मार्ग के रूप में नामित किया गया है।
- 90 डिग्री एबीएस संलग्न करेंकोहनी शेष निकास के बाहरी छोर तक। 90 ° मोड़ परीक्षण विषयों को भूलभुलैया के अंदर से सही भागने का रास्ता निर्धारित करने से रोकने के लिए कार्य करता है।
- किसी भी अपारदर्शी बॉक्स से बच बॉक्स को सिनिरेट किया जा सकता है और मोटे तौर पर 30 सेमी x 15 सेंटीमीटर x 15 सेमी आकार में बॉक्स के किनारे पर एक छेद, सीधे मंजिल के ऊपर, एक 90 डिग्री ABS कोहनी को समायोजित करने के लिए काफी बड़ा कटौती।
- 90 डिग्री एबीएस कोहनी के टर्मिनल अंत में बच बॉक्स संलग्न करें।
- मंजिल की सतह के ऊपर से बच बॉक्स (एक इंच से भी कम) को थोड़ा ऊपर उठाएं यह एक इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड या अन्य ताप स्रोत के लिए पर्याप्त कमरे की अनुमति देता है, जो बच बॉक्स के नीचे रखा जा सकता है
- कम से कम 5 अद्वितीय, विज़ुअल संकेतों को प्रिंट और टुकड़े टुकड़े करना। सरल, उच्च विपरीत छवियों का उपयोग करें जिन्हें आसानी से उपकरण के भीतर से पहचाना जा सकता है। काले और सफेद क्लिपआर्ट आकार (त्रिकोण, वर्ग, वृत्त) की सिफारिश की जाती है।
- मैग्नेट का उपयोग, दृश्य संकेतों की आंतरिक दीवारों का पालन करेंतंत्र। उपकरण के परिधि के आसपास, उद्धरण लगभग बराबर दूरी होना चाहिए।
3. रेडियल वॉटर ट्र्रेड मेज़ प्रोटोकॉल
नोट: सर्जिकल साइट के ठीक होने के बाद ही पानी की भूलभुलैया परीक्षण शुरू हो जाना चाहिए (मोटे तौर पर एक सप्ताह बाद सर्जरी)।
- परीक्षण के लिए तैयारी
- परीक्षण शुरू करने से पहले चूहों को कम से कम 30 मिनट के लिए परीक्षण कक्ष में प्रवेश करने की अनुमति दें।
- 70% इथेनॉल स्प्रे का उपयोग कर उपकरण को स्वच्छ करना
- तंत्र को लगभग 1 इंच का ठंडा (12-14 डिग्री सेल्सियस) पानी भरें।
- इलेक्ट्रिक हीटिंग पैड या अन्य ताप स्रोत रखें, सीधे बच बॉक्स के नीचे। परीक्षण की अवधि के दौरान बचें बॉक्स अंधेरे और गर्म रखें।
- उपकरण पर एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत की स्थिति।
नोट: अगर एक दीपक का उपयोग करना जो कि जानवरों को जानवरों से खोजा जा सकता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरतें कि दीपक एक ही पोप में रखा गया होप्रत्येक दिन शिष्टता चिराग ही चूहों को भागने के लिए बॉक्स का पता लगाने के लिए एक अन्य दृश्य क्यू का प्रतिनिधित्व कर सकता है, और यह दिन-ब-दिन काफी तेजी से बढ़ रहा है, परिणामों को मुश्किल कर सकता है।
- परीक्षण प्रोटोकॉल
- पूंछ से धीरे से अपने पिंजरे से माउस निकालें और तंत्र के केंद्र में जगह करें।
- जैसे ही पशु तंत्र में है, समय शुरू करें।
- एक बार जानवर को सही निकास मिल गया है, और एस्केप बॉक्स में स्थित / दर्ज किया गया है, समय बंद करो और सही पथ खोजने के लिए आवश्यक सेकंड की संख्या रिकॉर्ड करें।
- यदि जानवर एक समाप्ति छेद में चढ़ने का प्रयास करता है और 10 एस के बाद भूलभुलैया फिर से फिर से नहीं करता, तो जानवर को हाथ से भूलभुलैया के केंद्र में वापस निर्देशित करता है।
- यदि जानवर 3 मिनट (180 सेकेंड) के भीतर भागने के लिए सही पथ को खोजने में विफल रहता है, तो परीक्षण को विफलता और 180 एस के रूप में दर्ज करें। जानवरों को हाथ से सही पथ की ओर मार्गदर्शन करें।
- अनुमति देंमाउस 1 मिनट के लिए एस्केप बॉक्स में रहते हैं, अंतर-परीक्षण शेष।
- 1 मिनट का आराम बाकी हो जाने पर, बच बॉक्स से जानवर को हटा दें और अपने घर के पिंजरे पर लौटें।
- सही एस्केप रूट का पता लगाने के लिए घृणित संकेतों का उपयोग करने से माउस को रोकने के लिए 70% इथेनॉल स्प्रे के साथ पूरी तरह से बच बॉक्स को बाहर निकालना और बाहर निकलता है। यह कदम कुछ सेकंड से अधिक नहीं लेना चाहिए।
- अगले परीक्षण के लिए भूलभुलैया में माउस लौटें
- दोहराएं चरण 3.2.1-3.2.9 जब तक माउस ने कुल तीन परीक्षण पूर्ण नहीं किए हों, और या तो यह स्थित या तीन बार बच बॉक्स में चला गया है
- अंतिम 1 मिनट के बाकी के बाद, माउस को उसके घर के पिंजरे पर लौटें।
- परीक्षण के दौरान लगातार तापमान को सुनिश्चित करने के लिए जानवरों के बीच तंत्र में पानी को हटा दें और बदलें।
- प्रत्येक माउस का परीक्षण करने के लिए चरण 3.2.1-3.2.12 दोहराएं।
- अगले दिन, तैयारी चरण दोहराएं 3.2.1-3.2.5। यह सुनिश्चित करने में विशेष ध्यान रखना कि दृश्य संकेत मौजूद हैंपरीक्षण के दिनों के बीच लगातार स्थिति में
- पांचवें दिन मेमोरी रिटेंशन के लिए अंतिम तीन परीक्षण परीक्षण के साथ, चार दिन (प्रशिक्षण अवधि) के लिए एक दिन में तीन परीक्षणों के लिए उपरोक्त दैनिक परीक्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले जानवरों का परीक्षण करें। एक छठे तीन-परीक्षण परीक्षा (दीर्घावधि मेमोरी अवधारण) दिन के बारह पर दी जा सकती है।
- पांच और बारह परीक्षण दिनों के बीच कोई भी परीक्षण न करें
- विश्लेषण
- यदि किसी भी दो दिवसीय अवधि ( जैसे, कुल मिलाकर 6 परीक्षणों के सभी 180 के दशक में बनाए गए) के दौरान 180 सेकंड के अंदर भूलभुलैया को पूरा करने में विफल रहता है, तो मान लें कि परीक्षण की शर्तों से माउस को अपर्याप्त प्रेरित किया गया और विश्लेषण से हटा दिया गया।
- उस दिन के लिए अपने तीन दैनिक परीक्षणों के आधार पर परीक्षण की तारीख द्वारा प्रत्येक विषय के लिए भूलभुलैया को पूरा करने के लिए औसत विलंबता की गणना करें।
- पांचवीं दिन के परीक्षण और दीर्घकालिक स्मृति परीक्षण की तारीख में समूहों की तुलना करने के लिए मानक टी-परीक्षणों का उपयोग करते हुए स्मृति प्रतिधारण में समूह अंतर प्राप्त करें। यदि मीतुलना में दो समूहों की तुलना में अयस्क की तुलना की जा रही है, एक तरफ़ा एनोवा, जिसके बाद उचित तदनुरूप विश्लेषण (जैसे ट्यूकी के परीक्षण) के बाद प्राप्त किए गए किसी भी महत्व पर अनुवर्तन किया जाना चाहिए, इसके बजाए नियोजित होना चाहिए।
- अधिग्रहण अवधि (दिन 1-4) में समूह के अंतर को भिन्नता के दोहराए गए माप विश्लेषण के माध्यम से प्राप्त करें।
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Representative Results
आरडब्लूटी भूलभुलैया ( चित्रा 1 ) का इस्तेमाल चूहों में चोट-निर्भर स्थानिक स्मृति घाटे की जांच करने के लिए किया गया था जो कि नियंत्रित नियंत्रित कॉर्टिकल इफेक्ट-प्रेरित टीबीआई या शाम शल्य चिकित्सा चोट एक सोलनॉइड संचालित कॉर्टिकल प्रभाव का उपयोग करके 3 मिमी उत्तल टिप और निम्न चोट के पैरामीटर: 6 मी / एस स्ट्राइक वेग, 1 मिमी की गहराई, और 200 एमएस संपर्क समय के साथ उत्पन्न हुई थी। चूहों ने सर्जरी के बाद 35 दिनों में संज्ञानात्मक परीक्षण प्राप्त किया, और उन्हें चार दिन की प्रशिक्षण (अधिग्रहण अवधि) दिया गया, इसके बाद दिन 5 को स्मृति प्रतिधारण की परीक्षा दी गई और 12 तारीख को दीर्घावधि स्मृति का एक परीक्षण दिया गया, जैसा कि ऊपर उल्लिखित है मसविदा बनाना। चित्रा 2 चित्रा 2 टीबीआई चूहों और नकली नियंत्रण के बीच समय के साथ भूलभुलैया को पूरा करने के लिए विलंबता में एक स्पष्ट समूह भेद दिखाता है। यहां प्रस्तुत आंकड़ों के विश्लेषण से पता चला है कि टीबीआई की चूहों की तुलना में विलंबता काफी कम हो गई थी दिन 5 और 12 दिन ( चित्रा 2 ) दोनों पर। कोई भी विषय परीक्षण शर्तों की अपर्याप्तता से प्रेरित मानदंडों को पूरा नहीं करता, और इस प्रकार विश्लेषण से कोई भी चूहों को हटाया नहीं गया था।
चित्रा 1: रेडियल वॉटर ट्राइड भूलभुलैया
ढलान में नौ एक्सटिज के साथ एक 32 इंच की जस्ती इस्पात टब होते हैं, जो प्रत्येक 2-1 / 4 इंच के उपरांत मंजिल के ऊपर होता है। इनमें से बाहर निकलने के बाद, करीब 8 इंच के बाद आठ बंद हो जाते हैं, और एक से बचने के रास्ते की दृश्य पुष्टि को रोकने के लिए एक 90 डिग्री कोण मोड़ के पीछे छिपा हुआ एक गर्म सेब बॉक्स (30 सेमी x 15 सेमी x 15 सेमी) की ओर जाता है। एस्केप बॉक्स तक पहुंचने पर, विषयों को 1-मिनट, अंतर-परीक्षण बाकी मिला। उपकरण बचने के व्यवहार को प्रेरित करने के लिए ठंडे पानी (12 - 14 डिग्री सेल्सियस) के एक इंच से भरा है, और स्थानिक उन्मुखीकरण के लिए पांच अद्वितीय दृश्य संकेतों के साथ तैयार है।/ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55986/55986fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: रेडियल वॉटर ट्राइड भूलभुलैया का प्रतिनिधि परिणाम
सी 57 बीएल / 6 जे चूहों, 10 सप्ताह की आयु, या तो नियंत्रित नियंत्रण प्रभाव (एन = 11) या शिम (एन = 6) सर्जरी प्राप्त की चोट पैरामीटर इस प्रकार थे: 3 मिमी उत्तल प्रभाव टिप, 6 मी / एस वेग, 1 एमएम की गहराई और 200 एमएस निवास समय। चूहे 35 दिनों के बाद की चोटों में आरडब्लूटी भूलभुलैया परीक्षण प्राप्त करना शुरू किया। परीक्षण प्रोटोकॉल में चार दिन (अधिग्रहण अवधि) के लिए प्रति दिन तीन परीक्षण शामिल थे, इसके बाद दिन पांच में मेमोरी रिटेंशन के तीन परीक्षण परीक्षण और 12 दिन के लिए तीन परीक्षणों की लंबी अवधि की मेमोरी टेस्ट। विचलन के दोहराए गए उपाय विश्लेषण नहीं मिले अधिग्रहण अवधि (दिन 1-4) के दौरान समूह के अंतर (एफ [1,15] = 1.844, पी> 0.05)। भूलभुलैया को पूरा करने के लिए लेटेंसी को टीबीआई माइस में उल्लेखनीय रूप से बढ़ाया गया था, जो कि दिन 5 (टी [15] = 1.907, पी <0.05) और दिन 12 (टी [15] = 2.242, पी <0.05) पर शाम नियंत्रण की तुलना में काफी बढ़ गया था। डेटा अंक समूह का अर्थ दर्शाते हैं (± एसईएम)। महत्व मानक टी-परीक्षा (एक-पूंछ, समूह मतभेद की प्राथमिकता परिकल्पना के आधार पर) द्वारा निर्धारित किया गया था और पी <0.05 (*) के रूप में सूचित किया जाता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
यहां प्रस्तुत आरडब्ल्यूटीटी भूलभुलैया प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक सीसीआई प्रेरित टीबीआई चूहों और शाम नियंत्रणों के बीच अलग-अलग है, और एक संभव, माउस केंद्रित, एमडब्ल्यूएम और बार्न्स परिपत्र भूलभुलैया के विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि यहां रिपोर्ट किए गए परिणाम केवल टीबीआई माउस मॉडल में आरडब्लूटी भूलभुलैया के उपयोग के लिए ही कहते हैं, इस उपकरण का उपयोग वृद्ध और ट्रांसजेनिक मॉडलों में सफलतापूर्वक किया गया है जहां तैर-आधारित परीक्षण से उत्पन्न तनाव-प्रेरित गैर-अनुपालन एचडीएम अव्यावहारिक 15 , 17 , 18 , 1 9 अन्य माउस मॉडल जिसमें गैर-अनुपालन या मोटर घाटे संभावित शोध संबंधी चिंताएं हैं, इस संज्ञानात्मक कार्य से भी लाभ हो सकता है।
पहले से चर्चा किए गए डिज़ाइन के अलावा, आरडब्लूटी भूलभुलैया का एक लाभ इसकी सादगी है, दोनों निर्माण और उपयोग के संदर्भ में। उपकरण खुद को रिलायंस का उपयोग करके आसानी से बनाया जाता हैनिरंतर कम लागत वाली सामग्री और इसके घटकों को हानि पहुँचाए बिना साफ किया जा सकता है, जिससे विशिष्ट रोगजन्य मुक्त (एसपीएफ़) सुविधाओं के लिए यह आदर्श होता है। अधिग्रहण की अवधि के लिए केवल चार दिनों के परीक्षण की आवश्यकता होती है, कोई पूर्व-चोट प्रशिक्षण आवश्यक नहीं है दैनिक परीक्षण में न्यूनतम समय की प्रतिबद्धता (~ 10 मिनट / पशु) शामिल है, और महारत से पहले थोड़ा अनुभव की आवश्यकता होती है। निर्माण और उपयोग में इसकी सादगी के कारण, आरडब्लूटी भूलभुलैया एक प्रयोगशाला के लिए आदर्श है जो अपेक्षाकृत तंग बजट से विवश है और इसमें कोई व्यवहारिक या संज्ञानात्मक परीक्षण अनुभव नहीं है।
ऐसे प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय कई कदम हैं जो शोधकर्ताओं ने संभावित विचरण को कम किया है। सुसंगत, गुणवत्ता के परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ सिफारिशें शामिल हैं, परीक्षण के लिए पहले समान समय पर परीक्षण करना, उसी व्यक्ति / व्यक्ति का परीक्षण करते समय संभव है, एक शांत और शांत परीक्षण वातावरण बनाए रखने, और चूहों के व्यापक प्रबंधन से पहले। यह भी इम्फा होना चाहिएआकार के अनुसार, जबकि इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध पानी का तापमान पुरुष C57BL / 6J चूहों के लिए सफल परीक्षण परिस्थितियों में हुआ, तापमान वरीयता और हाइपोथर्मिया भारी तनाव और लिंग निर्भर 20 हैं । हाइपोथर्मिया को उत्पन्न नहीं करने वाली प्रभावी तापमान सीमा का निर्धारण करने के लिए लैब्स को अपने प्रारंभिक परीक्षण का संचालन करना चाहिए यदि अन्य उपभेदों या मादा चूहों का उपयोग करना। अंत में, दृश्य संकेतों को सरल, आसानी से पहचाने जाने योग्य और परीक्षण के दौरान विषयों के लिए दृश्यमान होना चाहिए। मूल काले और सफेद आकार (प्लास्टिक में टुकड़े टुकड़े करना, या शीट, ताकि उन्हें साफ किया जा सकता है) बेहतर है।
हालांकि यहां वर्णित परीक्षण प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सरल है, यह आसानी से शोधकर्ताओं को बचने के लिए विलंब से परे जानकारी की अधिक मात्रा देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है अतिरिक्त मापदंडों का धन इकट्ठा करने के लिए पशु ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर को नियोजित किया जा सकता है, और खोज व्यवहार में समूह विशिष्ट मतभेदों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ऐसा सॉफ्टवेयर अंतर्निहित नहीं हैपरीक्षण के लिए आवश्यक लिखी, हालांकि, जैसा कि यहां दिखाया गया है इसके अतिरिक्त, जांच परीक्षण, जिसमें बच बॉक्स से बाहर निकलता है या अवरुद्ध होकर दृश्य संकेतों को एक समाप्ति छेद में बाहर निकलने का संकेत देने के लिए घुमाया गया है, यहां बताया गया प्रोटोकॉल को पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम उत्पन्न करने के लिए चार दिन की अधिग्रहण अवधि आवश्यक थी, लेकिन हम शोधकर्ताओं को अपने टीबीआई मापदंडों / मॉडल या आनुवंशिक तनाव का परीक्षण करने के लिए अपने पायलट परीक्षण का संचालन करने के लिए प्रोत्साहित करते हैं और आवश्यकता के अनुसार प्रशिक्षण अवधि को छोटा या बढ़ाते हैं ।
इस परीक्षण प्रोटोकॉल के साथ सीमाएं हैं जो उल्लेख के लायक हैं सबसे पहले, ठंडे पानी की जगह और विषयों के बीच तंत्र को सफ़ाई करना समय दोनों गहन और शारीरिक रूप से मांग की जा सकती है। शोधकर्ता प्रयास और समय को कम करने के लिए, पानी के निकासी को कम करने के लिए एक उपलब्ध फर्श के साथ कमरे में परीक्षण किया जाना चाहिए, और एक नलिका के साथ ठंडे पानी के सिंक के लिए आसान पहुंच। दूसरा, का उपयोगवीडियो रिकॉर्डिंग के बिना हाथ का समय मानव त्रुटि का खतरा पेश करता है जैसा कि ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर कुछ प्रयोगशालाओं के लिए निषेधात्मक रूप से महंगा हो सकता है, हालांकि, यदि हाथ का समय इस्तेमाल किया जाना चाहिए तो ऐसा जोखिम अपरिहार्य है। इसके अतिरिक्त, एमडब्ल्यूएम के साथ, आरएपीटी भूलभुलैया ( यानी भूलभुलैया सीखने के बाद, इसे आगे की स्थानिक मेमोरी परीक्षण के लिए अनुमति देने के लिए बेबदल नहीं किया जा सकता है) का उपयोग करके एक ही विषय में स्थानिक मेमोरी का पुनर्निर्धारण नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, टीबीआई से संबंधित मोटर घाटे से प्रभाव हो सकता है जो टीएमआई-चूहों की शॉम्स की तुलना में भूलभुलैया करने की क्षमता को बदल सकता है। इस बात को ध्यान में रखते हुए, हालांकि, यह हो सकता है कि आंदोलन की आवश्यकता होती है जो सभी कृंतक स्थानिक स्मृति परीक्षणों की एक समान सीमा होती है। मोशन ट्रैकिंग सॉफ़्टवेयर को कुल मार्ग की लंबाई और गति का आकलन करने और ऐसे मतभेदों को मापने के लिए आरटीएम के साथ नियोजित किया जा सकता है। अंत में, शोधकर्ताओं को पता होना चाहिए कि आरडब्लूटी भूलभुलैया वर्णित है जो टीबीआई के माउस मॉडलों में अनुभूति परीक्षण के लिए उपलब्ध एकमात्र गैर-तैराकी परीक्षण का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। अन्य टीवाई-भूलभुलैया, जैसे कि टीबीआई माइस 21 से सफलतापूर्वक भुनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। शोधकर्ताओं को यह तय करने से पहले कि उनके प्रयोगशाला में उपयोग करने के लिए प्रत्येक परीक्षण के पेशेवरों और विपक्षों का वजन करना चाहिए।
वर्णित आरडब्लूटी भूलभुलैया प्रोटोकॉल वर्तमान में माउस-मॉडल अनुसंधान में उपयोग की गई चूहे-मान्य संज्ञानात्मक परीक्षणों के लिए एक उपन्यास, माउस-विशिष्ट विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, और तैराकी की आवश्यकता नहीं है। चूंकि वैज्ञानिक अनुसंधान में माउस मॉडल का उपयोग बढ़ता जा रहा है, चूंकि माउस-मान्य अनुसंधान उपकरणों की अंतिम अपनाने से अधिक सटीक शोध परिणाम हो सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को ट्रांसलेशन हेल्थ साइंस पायलट प्रोजेक्ट अनुदान अवसर (यूएल 1TR000423), वॉशिंगटन सेंटर ऑन ह्यूमन डेवलपमेंट एंड डिसएबिलिटी, और वाशिंगटन प्रायोगिक बिहेवियर कोर और मस्ति इमेजिंग कोर विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था। हम यहां प्रस्तुत मूल रेडियल वॉटर ट्र्रेड भूलभुलैया डिजाइन और प्रोटोकॉल के विकास और प्रसार में अपनी भूमिका के लिए डॉ। वॉरेन लेडीज को स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस परियोजना के साथ उनकी सहायता के लिए टोबी कोल को भी धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub | Home Depot | Internet #206638142 | Needed: 1 |
| 1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter | Home Depot | Internet #100344703, Store SKU #188956 | Needed: 9 |
| 1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper | Home Depot | Internet #100114974 Store SKU #755844 | Needed: 8 |
| 1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow | Home Depot | Internet #100346663 Store SKU #188603 | Needed: 1 |
| HDX 10 Gal. Storage Tote |
Home Depot | Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804 | Needed: 1 |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | Needed: 1 |
| Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals | Leica Biosystems | 39463001 | Needed: 1 |
References
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