Summary

Methoden und Tipps für die intravenöse Gabe von Adeno-assoziierten Virus an Ratten und Bewertung des zentralen Nervensystems Transduktion

Published: August 25, 2017
doi:

Summary

Methoden für eine breit angelegte zentrale Nervensystem gen Lieferung bei der Ratte sind abgedeckt. In diesem Beispiel ist der Zweck, eine Krankheit zu imitieren, die das gesamte Rückenmark betrifft. Die weit verbreitete Transduktion lässt sich ein therapeutisches Protein aus einer einmaligen, periphere Verwaltung an die CNS liefern.

Abstract

Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind eine wichtige Reagenz in den Neurowissenschaften für gruppierte regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR), Optogenetik, Cre Lox targeting usw.. Dieses Manuskript soll die Ermittler versuchen expansive zentrale Nervensystem (ZNS) Gentransfer bei der Ratte über Heck Vene Injektion von AAV zu unterstützen. Breit angelegte Ausdruck ist relevant für Bedingungen mit weit verbreiteten Pathologie und einem Rattenmodell ist bedeutend wegen seiner größeren Größe und physiologischen Ähnlichkeiten mit Menschen im Vergleich zu Mäusen. In dieser Beispielanwendung wird eine breit angelegte neuronale Transduktion verwendet, um eine Neurodegenerative Erkrankung zu imitieren, die betrifft das gesamte Rückenmark Amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Die effiziente breit angelegte CNS Transduktion einsetzbar auch therapeutische Protein Faktoren in präklinischen Studien zu liefern. Nach einem Intervall von mehreren Wochen nach der Injektion Ausdruck sind die Auswirkungen der Transduktion bewertet. Für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Steuerung Vektor wird der Betrag der GLP im Kleinhirn durch ein basic imaging-Programm schnell und zuverlässig geschätzt. Für motor Krankheit Phänotypen, die durch die ALS induziert werden im Zusammenhang mit Protein transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43), sind die Defizite von Flucht-Reflex und Rotarod erzielte. Über Krankheit Modellierung und Gentherapie gibt es vielfältige Anwendungsmöglichkeiten für das breit angelegte gen Zielen hier beschrieben. Die erweiterte Nutzung dieser Methode hilft bei der Beschleunigung in den Neurowissenschaften und Neurogenetik Hypothesentests.

Introduction

Rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren sind unverzichtbare Werkzeuge für die CNS-Forschung, weil sie für transducing Neuronen in-vivo so effizient sind. AAV-Vektoren sind sehr vielseitig für verschiedene transgene und Protein-Isoformen, verschiedenen Geweben, verschiedenen Wirtsarten und verschiedenen Darreichungsformen zu studieren. Zum Beispiel kann AAV verabreicht werden mit Mäusen ein Peripheriegerät, relativ nichtinvasiv, intravenöser Injektion, Neuronen im gesamten ZNS als erstes transduzieren Foust Et Al. und Duque Et Al. beschrieben (siehe Jupiter Papier von Gombash Et Al. (2014)). 1 , 2 , 3 dieser gen Lieferung Ansatz wird verwendet bei Ratten entweder grünes fluoreszierendes Protein (GFP) effizient zum Ausdruck bringen oder die ALS im Zusammenhang mit Protein, transactive Antwort DNA-bindendes Protein von 43 kDa (TDP-43) im ZNS. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 arbeiten bei Ratten ist bedeutsam, weil die Ratte physiologische und metabolische Parameter für den Menschen im Vergleich zu Mäusen näher sind und es Verhaltens- und toxikologische Tests, die speziell für die Ratten gibt. Weiterhin mehr transgene Ratte Linien sind immer verfügbar, die in AAV gen Übertragung Studien genutzt werden.

Methoden sind für expansive CNS Gentransfer in die Ratte und schnelle, zuverlässige Quantifizierung der Ergebnisse detailliert. Breit angelegte CNS Transduktion wird verwendet, um die Symptomatik Alsen in Ratten zu imitieren, TDP-43 in das Rückenmark zum Ausdruck zu bringen. Die Methode ist Tail Vene Injektionen von TDP-43 Vektor zu jungen Erwachsenen Ratten wie in Jackson Et al. 6 , 8 , 9 nach mehreren Wochen, TDP-43-induzierte motorische Defizite werden erzielt durch zwei Methoden: entkommen, Reflex und Rotarod wie in Dayton Et Al. und Jackson Et Al. 5 , 6 , 7 , 9 für Kontrolle GFP Vektor, in Post-Mortem-Analyse ist die fluoreszierende Fläche des Kleinhirns als Index der Transduktion Effizienz wie bei Jackson Et Al. berechnet 6 , 8 die Analyse des Kleinhirns erweist sich eine schnelle und zuverlässige Index für den Grad der CNS Transduktion nach peripheren gen Lieferung und auf eine Vielzahl von Ansätzen versucht peripher-zentrale Gentransfer anwendbar sein sollte.

Protocol

alle Verfahren der entsprechenden NIH-Richtlinien befolgt. Alle Verfahren gefolgt Tier Protokolle, die von der Animal Care and Use Committee an LSU Health Sciences Center in Shreveport genehmigt wurden. Weibliche Sprague-Dawley Ratten im Alter von 6 Wochen für dieses Verfahren verwendet wurden. 1. bestimmen die Dosen/Mengen des Vektors benötigt wiegen die Ratten injiziert werden und bestimmen die Höhe der viralen Vektoren benötigt für jedes Tier der Titer (Konzentration) der V…

Representative Results

TDP-43 induzierte motorische Beeinträchtigungen treten innerhalb von 2-6 Wochen abhängig von der Dosis der AAV TDP-43 verwendet (Abbildung 1). Erfolglose Schweif Vene Injektionen führen teilweise oder keine Beeinträchtigungen; die AAV muss in die Blutbahn um den Effekt zu produzieren gelangen. Eine erfolgreiche Injektion von AAV GFP führt GLP Ausdruck im gesamten Gehirn und Rückenmark in gewissem Vektor-Dosis abhängig. Bei der Verwendung der starken re…

Discussion

Eine Vielzahl von Touren für AAV-Vektoren wurden getestet: Intra-Parenchym, Intra-Cerebroventricular, Intra-thecal, intravenöse, intranasale, intramuskulären, etc.. Jede Route kann sowohl vor-als auch Nachteile haben. Heckrotorblätter Vene Verabreichung von AAV an erwachsenen Ratten ist eine zuverlässige Methode zur Erreichung konsistente Transduktion des ZNS. Die peripheren Injektionsverfahren vermeidet die Einführung einer Injektionskanüle in der CNS-Gewebe und ist daher minimal invasiv. Die effiziente CNS-Ausdr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx und einer Spende für ALS-Forschung von Thomas Lawson, wofür wir dankbar sind finanziert. Wir danken Elysse Obstgarten und Donna Burney für Beratung und Schulung. JAS wurde unterstützt von der Stiftung gelogen und National Institutes of Health gewähren GM103418.

Materials

Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
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Cite This Article
Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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