Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Summary

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Abstract

Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.

Introduction

Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). ^{1 , 2 , 3} se utiliza este enfoque de entrega de genes en ratas expresar eficientemente cualquier proteína fluorescente verde (GFP) o la ALS proteínas, respuesta transactive ADN-proteína de 43 kDa (TDP-43) en el SNC. ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} trabajo en ratas es significativo porque los parámetros fisiológicos y metabólicos de la rata están más cercanos de los seres humanos en comparación con ratones y hay ensayos conductuales y toxicológicos diseñados específicamente para las ratas. Además, más líneas de ratas transgénicas están volviendo disponibles que puede ser utilizado en estudios de transferencia de genes AAV.

Se detallan métodos expansivos CNS transferencia de genes en la rata y cuantificación rápida y confiable de los resultados. Transducción de CNS de gran escala se utiliza para imitar la sintomatología de la ELA en ratas expresando TDP-43 a lo largo de la médula espinal. El método es inyecciones de vena de cola del vector TDP-43 a ratas adultas jóvenes según lo utilizado en Jackson et al. ^{6 , 8 , 9} después de varias semanas, déficits motor TDP-43-inducida son marcados por dos métodos: escapar de reflejo y rotarod en Dayton et al. y Jackson et al. ^{5 , 6 , 7 , 9} para el vector de control GFP, en análisis post-mortem, la zona fluorescente del cerebelo se calcula como un índice de eficiencia de la transducción de señales en Jackson et al. ^{6 , 8} el análisis del cerebelo ha demostrado para ser un índice rápido y confiable del grado de transducción CNS después de la entrega del gene periférico y debe ser aplicable a una variedad de métodos de transferencia génica de periférica a central.

Protocol

todos los procedimientos siguieron las pautas apropiadas de NIH. Todos los procedimientos siguieron protocolos animales que fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en LSU Health Sciences Center en Shreveport. Para este procedimiento se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley a las 6 semanas de edad. 1. determinar los dosis/volúmenes de vector necesitada pesan las ratas al ser inyectado y determinar la cantidad de vector viral necesaria para cada animal basadas en el título (…

Representative Results

TDP-43 deficiencias motoras inducidas deben presentarse dentro de 2 a 6 semanas dependiendo de la dosis de la AAV TDP-43 usado (figura 1). Inyecciones de vena de cola dará como resultado parcial o sin impedimentos; el AAV debe alcanzar el torrente sanguíneo para producir el efecto. Una inyección exitosa de AAV GFP resultará en la expresión de GFP en el cerebro y la médula espinal de una manera dependiente de dosis de vector. Cuando se utiliza el promoto…

Discussion

Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión e…

Materials

Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge tube	USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuge	Eppendorf	22624415
Laboratory film	Bemis	PM996
1-mL syringe	BD	309626	Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection
30g needle	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gas anesthesia vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas anesthesia scavenger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heating pad	Sears	17280
Bench pad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 rats/ 4 mice
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160
Scion Image	Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody	Invitrogen	A11122	Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope	Zeiss