Summary

Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Published: August 25, 2017
doi:

Summary

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

Abstract

Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.

Introduction

Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 se utiliza este enfoque de entrega de genes en ratas expresar eficientemente cualquier proteína fluorescente verde (GFP) o la ALS proteínas, respuesta transactive ADN-proteína de 43 kDa (TDP-43) en el SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabajo en ratas es significativo porque los parámetros fisiológicos y metabólicos de la rata están más cercanos de los seres humanos en comparación con ratones y hay ensayos conductuales y toxicológicos diseñados específicamente para las ratas. Además, más líneas de ratas transgénicas están volviendo disponibles que puede ser utilizado en estudios de transferencia de genes AAV.

Se detallan métodos expansivos CNS transferencia de genes en la rata y cuantificación rápida y confiable de los resultados. Transducción de CNS de gran escala se utiliza para imitar la sintomatología de la ELA en ratas expresando TDP-43 a lo largo de la médula espinal. El método es inyecciones de vena de cola del vector TDP-43 a ratas adultas jóvenes según lo utilizado en Jackson et al. 6 , 8 , 9 después de varias semanas, déficits motor TDP-43-inducida son marcados por dos métodos: escapar de reflejo y rotarod en Dayton et al. y Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 para el vector de control GFP, en análisis post-mortem, la zona fluorescente del cerebelo se calcula como un índice de eficiencia de la transducción de señales en Jackson et al. 6 , 8 el análisis del cerebelo ha demostrado para ser un índice rápido y confiable del grado de transducción CNS después de la entrega del gene periférico y debe ser aplicable a una variedad de métodos de transferencia génica de periférica a central.

Protocol

todos los procedimientos siguieron las pautas apropiadas de NIH. Todos los procedimientos siguieron protocolos animales que fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en LSU Health Sciences Center en Shreveport. Para este procedimiento se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley a las 6 semanas de edad. 1. determinar los dosis/volúmenes de vector necesitada pesan las ratas al ser inyectado y determinar la cantidad de vector viral necesaria para cada animal basadas en el título (…

Representative Results

TDP-43 deficiencias motoras inducidas deben presentarse dentro de 2 a 6 semanas dependiendo de la dosis de la AAV TDP-43 usado (figura 1). Inyecciones de vena de cola dará como resultado parcial o sin impedimentos; el AAV debe alcanzar el torrente sanguíneo para producir el efecto. Una inyección exitosa de AAV GFP resultará en la expresión de GFP en el cerebro y la médula espinal de una manera dependiente de dosis de vector. Cuando se utiliza el promoto…

Discussion

Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Asociación de ALS, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx y una donación benéfica para la investigación de ALS de Thomas Lawson, para lo cual estamos agradecidos. Agradecemos a Elysse huerta y Donna Burney para asesoría y capacitación. JAS fue apoyado por la Fundación mintió e institutos nacionales de salud otorgar GM103418.

Materials

Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody – 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody – 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
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Cite This Article
Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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