Summary
एक व्यापक पैमाने पर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र चूहे में जीन डिलीवरी के लिए तरीके कवर कर रहे हैं । इस उदाहरण में, उद्देश्य के लिए एक बीमारी है कि पूरे रीढ़ की हड्डी को प्रभावित करता है नकल है । व्यापक transduction एक बार, परिधीय प्रशासन से सीएनएस के लिए एक चिकित्सीय प्रोटीन देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
Adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वैक्टर संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR), optogenetics, cre-लोक्स लक्ष्यीकरण, आदि के लिए तंत्रिका विज्ञान में एक प्रमुख एजेंट हैं । इस पांडुलिपि का उद्देश्य AAV की पूंछ नस इंजेक्शन के जरिए चूहे में विशाल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) जीन हस्तांतरण के प्रयास जांचकर्ता सहायता करने के लिए है । व्यापक पैमाने पर अभिव्यक्ति व्यापक विकृति के साथ शर्तों के लिए प्रासंगिक है, और एक चूहा मॉडल चूहों की तुलना में अपने अधिक से अधिक आकार और मनुष्यों के लिए शारीरिक समानता के कारण महत्वपूर्ण है । इस उदाहरण के आवेदन में, एक व्यापक पैमाने पर न्यूरॉन transduction एक neurodegenerative रोग है कि पूरे रीढ़ की हड्डी, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (एस) को प्रभावित करता है की नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुशल व्यापक पैमाने पर सीएनएस transduction भी पूर्व नैदानिक अध्ययन में चिकित्सकीय प्रोटीन कारकों देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । पोस्ट-इंजेक्शन अभिव्यक्ति अंतराल के कई सप्ताह के बाद, transduction के प्रभाव मूल्यांकित होते हैं । एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए (GFP) नियंत्रण वेक्टर, सेरिबैलम में GFP की मात्रा जल्दी और मज़बूती से एक बुनियादी इमेजिंग प्रोग्राम द्वारा अनुमानित है । मोटर रोग phenotypes कि एस संबंधित प्रोटीन transaction प्रतिक्रिया डीएनए से प्रेरित कर रहे है के लिए ४३ केडीए (तेदेपा-४३) के प्रोटीन बंधन, घाटे से बच पलटा और rotarod द्वारा बनाए जाते हैं । रोग मॉडलिंग और जीन थेरेपी के अलावा, वहां व्यापक पैमाने पर जीन लक्ष्यीकरण के लिए विभिंन संभावित अनुप्रयोगों यहां वर्णित हैं । इस विधि के विस्तारित उपयोग तंत्रिका विज्ञान और neurogenetics में तेजी परिकल्पना परीक्षण में सहायता करेगा ।
Introduction
संयोजक adeno-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वैक्टर सीएनएस अनुसंधान के लिए अपरिहार्य उपकरण है क्योंकि वे vivo में transducing ंयूरॉंस के लिए बहुत कुशल हैं । AAV वैक्टर बहुत अलग transgenes और प्रोटीन isoforms, विभिंन ऊतकों, विभिंन मेजबान प्रजातियों, और प्रशासन के विभिंन मार्गों का अध्ययन करने के लिए बहुमुखी हैं । उदाहरण के लिए, AAV एक परिधीय द्वारा चूहों के लिए प्रशासित किया जा सकता है, अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव, transduce न्यूरॉन्स के लिए नसों में सीएनएस भर इंजेक्शन के रूप में पहले Foust एट अल. और डुकी एट अल. (Gombash एट अल करके जौव पेपर देखें । (२०१४)). 1 , 2 , 3 यह जीन वितरण दृष्टिकोण को कुशलतापूर्वक या तो ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या एस संबंधित प्रोटीन, transaction प्रतिक्रिया डीएनए-४३ केडीए (टीडीपी-४३) के प्रोटीन बंधन में व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है सीएनएस । 4 , 5 , ६ , 7 , 8 , चूहों में काम कर रहे 9 महत्वपूर्ण है क्योंकि चूहे के शारीरिक और चयापचय मापदंडों के रूप में चूहों की तुलना में मनुष्यों के करीब हैं और वहां व्यवहार और विषाक्तता चूहों के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए परख रहे हैं । इसके अलावा, और अधिक ट्रांसजेनिक चूहे लाइनें उपलब्ध है कि AAV जीन हस्तांतरण अध्ययन में उपयोग किया जा सकता है होते जा रहे हैं ।
तरीके विशाल सीएनएस जीन हस्तांतरण के लिए चूहे में विस्तृत रहे हैं, और तेजी से, परिणामों के विश्वसनीय ठहराव । व्यापक पैमाने पर सीएनएस transduction की रीढ़ की हड्डी भर में तेदेपा ४३ व्यक्त द्वारा चूहों में एस की लक्षण नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है । विधि तेदेपा के पूंछ नस इंजेक्शन-४३ युवा वयस्क चूहों के लिए वेक्टर जैक्सन एट अल में प्रयोग किया जाता है के रूप में । ६ , 8 , 9 कई हफ्तों के बाद, तेदेपा-४३-प्रेरित मोटर घाटे दो तरीकों से रन बनाए हैं: एस्केप पलटा और rotarod के रूप में Dayton एट अल. और जैक्सन एट अल में इस्तेमाल किया । 5 , ६ , 7 , 9 नियंत्रण GFP वेक्टर के लिए, पोस्टमार्टम विश्लेषण में, सेरिबैलम के फ्लोरोसेंट क्षेत्र जैक्सन एट अल में इस्तेमाल के रूप में transduction दक्षता के एक सूचकांक के रूप में गणना की है । ६ , 8 सेरिबैलम के विश्लेषण के लिए परिधीय जीन वितरण के बाद सीएनएस transduction की डिग्री के एक तेजी से और विश्वसनीय सूचकांक साबित हो गया है और परिधीय करने वाली केंद्रीय जीन हस्तांतरण के प्रयास दृष्टिकोण की एक किस्म के लिए लागू किया जाना चाहिए ।
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Protocol
- चूहों के लिए इंजेक्शन और वायरल वेक्टर की मात्रा का निर्धारण प्रत्येक जानवर के लिए आवश्यक titer (एकाग्रता) वेक्टर तैयारी के आधार पर निर्धारित करते हैं । का प्रयोग करें वेक्टर खुराक है कि चूहे सीएनएस में कुशल अभिव्यक्ति के लिए सफल रहे है पहले (जैक्सन एट अल देखें । < सुप क्लास = "xref" > 6 ).
नोट: AAV9 टीडीपी-४३ या AAV9 GFP के लिए, एक ठेठ खुराक के बीच है 3 x 10 13 -1 x 10 14 वेक्टर जीनोम/ उंर के 6 सप्ताह में युवा वयस्क चूहों के बारे में १५० g. वजन
- व्यवस्थित तुलना के लिए सभी जानवरों में प्रति किलो बराबर खुराक बनाते हैं । सुनिश्चित करें कि वॉल्यूम मानक से अधिक नहीं है सलाह इंजेक्शन वॉल्यूम (२५०-५०० & #181; L के लिए एक २५० ग्राम चूहे). एक ठेठ इंजेक्शन की मात्रा २०० & #956; एल एक युवा वयस्क चूहे के लिए है ।
- सभी आवश्यक आपूर्ति इकट्ठा: एक आयल फिल्म स्क्वायर (के बारे में 5 x 5 सेमी) प्रति पशु, एक पशु प्रति शराब तैयारी पैड, धुंध पैड (पशु प्रति 2-3), प्लास्टिक सुझाव, और एक micropipette.
- ७०% इथेनॉल के साथ सतह सफाई से काम कर सतह तैयार करते हैं । एक हीटिंग पैड कम करने के लिए सेट तापमान के साथ नीचे रखें (~ ३७ & #176; C) । हीटिंग पैड के शीर्ष पर एक बेंच पैड प्लेस ।
- गैस संज्ञाहरण (isoflurane) तैयार करते हैं । प्रक्रिया के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन और गैस संज्ञाहरण सुनिश्चित करें । ७०% इथेनॉल के साथ प्रेरण चैंबर और संज्ञाहरण मुखौटा साफ है, और बेंच पैड पर संज्ञाहरण मुखौटा जगह है ।
- गल वेक्टर कमरे के तापमान पर तैयार करें, और प्रत्येक जानवर के लिए एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब लेबल ।
- प्लास्टिक चरण १.१ में उपयुक्त ट्यूब में निर्धारित AAV की मात्रा और इच्छित इंजेक्शन मात्रा तक मात्रा लाने (यहाँ, २०० & #956; l) के साथ स्तनपान कराने वाली घंटी & #39; s समाधान या खारा.
- पल्स भंवर 1-2 s के लिए नमूने और फिर नाड़ी केंद्रापसारक 5 एस के लिए ट्यूब के नीचे करने के लिए नमूना लाने के लिए.
- प्लास्टिक ट्यूब से बाहर चूहे के लिए कुल इंजेक्शन की मात्रा और आयल फिल्म के वर्ग पर ।
- एक 1 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 30 गेज सुई जगह है.
- स्थान बेवल के साथ सुई पर तेल फिल्म पर वेक्टर में नीचे का सामना करना पड़ । सिरिंज सवार पर वापस खींचो जब तक सभी वायरस सुई और सिरिंज में है. सुई में हवा के बुलबुले ड्राइंग से बचने के लिए सावधान रहें, जो अभ्यास के साथ आसान हो जाता है ।
- ऑक्सीजन बारी करने के लिए 1 L/मिनट और isoflurane संज्ञाहरण सेट करने के लिए 5%. गैस संज्ञाहरण सभी को जोड़ने hoses और टोंटी झुकाव की जांच द्वारा प्रेरण चैंबर के लिए बह रही है कि यह सुनिश्चित करें.
- जगह के बारे में गैस संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में चूहा 3 मिनट, जब तक चूहे अप्रतिसादी है ।
- पैर की अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करते हैं । पाँव की चुटकी के बाद पैर या टाँग में कोई मूवमेंट नहीं होना चाहिए.
- संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए 2% करने के लिए isoflurane संज्ञाहरण को कम करने और टोंटी को समायोजित इतना है कि संज्ञाहरण संज्ञाहरण मुखौटा के लिए बह रही है ।
- जगह चूहे & #39; संज्ञाहरण मास्क में नाक एस और चूहा इतना समायोजित कि यह अपनी तरफ से झूठ बोल रही है । पार्श्व पूंछ नस की पहचान
- .
नोट: पार्श्व पूंछ की नसें लगभग 10 और 2 o & #39 पर लेट होती हैं; पूंछ के पृष्ठीय शीर्ष के साथ घड़ी 12 o & #39; घड़ी के रूप में । इसके साइड पर पड़े चूहे के साथ पार्श्व पूंछ नस को ऊपर की ओर करना चाहिए । - शराब तैयारी पैड के साथ इंजेक्शन क्षेत्र पोंछ । इंजेक्शन साइट पूंछ की लंबाई के नीचे दो तिहाई है ।
- दृढ़ता से सीधे पार्श्व पूंछ नस पर एक उंगली से इंजेक्शन क्षेत्र के ऊपर पूंछ पकड़; इस नस का फैलाव होगा. ऊपर का सामना करना पड़ बेवल के साथ
- , एक ही दिशा में दिखाई पूंछ नस के साथ सुई संरेखित करें । पूंछ नस पर
- पियर्स त्वचा जबकि महान देखभाल करने के लिए दूसरे हाथ से बचने के पूंछ पकड़ और पूंछ नस पर दबाव ।
- जारी दबाव पूंछ नस से सामांय रक्त प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए ।
- सुई नस में ले जाएं । सुई पूंछ नस पंचर हो गया है यह सुनिश्चित करने के लिए, सवार पर थोड़ा वापस खींच । सुई नस में है, तो रक्त सुई में प्रवाह होगा ।
- सुई की आवश्यकता के रूप में स्थिति । फिर, सुई को स्थिर करने के लिए इंजेक्शन साइट के ऊपर हाथ ले जाएँ इंजेक्शन साइट के नीचे और पूंछ के खिलाफ सिरिंज के अंत पकड़.
- धीरे से वेक्टर को पूंछ में इंजेक्ट करे (लगभग 20 & #181; L/
नोट: नस के रूप में वेक्टर के माध्यम से बहती रंग खो सकते हैं । संकेत है कि समाधान नस के बाहर इंजेक्ट किया गया blebbing, त्वचा, या प्रतिरोध जब वेक्टर इंजेक्शन के blanching शामिल हैं । अभ्यास के साथ, अतिरिक्त संवहनी जोखिम कम किया जा सकता है । - के बाद वेक्टर प्रशासित किया गया है, चूहे से सुई को हटाने और इंजेक्शन साइट के खिलाफ एक धुंध पैड प्रेस करने में मदद 30-60 s. के लिए रक्तस्राव स्टेम
- isoflurane संज्ञाहरण और ऑक्सीजन बंद कर देते हैं । चूहे की निगरानी जब तक यह चेतना फिर से प्राप्त है, और फिर इसे अपने पिंजरे में वापस ।
- ध्यान से sharps कंटेनर में सभी सुई जगह है । अंय सभी डिस्पोजेबल सामग्री है कि संभावित AAV के साथ एक उचित में प्रदूषित कर रहे है के निपटान में एक घातक खतरा कंटेनर । ७०% इथेनॉल के साथ काम कर स्टेशनों को साफ.
- एक सपाट सतह पर मलबे की साफ, दो उंगलियों के साथ चूहा पकड़ो & #39; एस पूंछ शरीर से लगभग 2 सेमी. चूहे धीरे उठा जब तक forelimbs लटक रहे है जबकि चूहे के नीचे ventral को देखने ।
- प्रयोगात्मक समय-जीन स्थानांतरण के बाद पाठ्यक्रम में साप्ताहिक प्रक्रिया (उदाहरण के लिए, 12 सप्ताह के जीन स्थानांतरण के बाद) ।
नोट: भी इस तरह से forelimb घाटे स्कोर है, लेकिन hindlimb घाटे और इस मॉडल में होने की संभावना है, सदिश खुराक के आधार पर इस्तेमाल किया ।
- प्रयोगात्मक समय-जीन स्थानांतरण के बाद पाठ्यक्रम में साप्ताहिक प्रक्रिया (उदाहरण के लिए, 12 सप्ताह के जीन स्थानांतरण के बाद) ।
- 10 एस के लिए hindlimbs पर ध्यान दें अगर एक या दोनों hindlimbs 10 एस midline के दौरान की ओर बंदिश
- परीक्षण के बीच 30 एस के साथ तीन बार की कुल के लिए इस परीक्षण को दोहराएं । यदि एक या दोनों hindlimbs तीन परीक्षणों में से प्रत्येक के लिए बंदिश है, चूहा मोटर रोग दिखा रहा है । रिकॉर्ड (मैंयुअल रूप से नोटों में) या तो एकतरफा या द्विपक्षीय hindlimb घाटे वर्तमान के रूप में अगर वहां लगातार सभी तीन परीक्षणों भर में बंदिश है ।
- पर मोटर समारोह का मूल्यांकन rotarod स्थापित करने के लिए, rotarod के नीचे एक बेंच पैड जगह और प्रति मिनट 4-40 क्रांतियों के लिए त्वरण सेट (rpm) पर 2 मिनट (दर बढ़ जाती है ~ ०.३ rpm/ एक 12 सप्ताह का समय-पाठ्यक्रम के लिए, 2, 4, 8, और 12 सप्ताह में जीन स्थानांतरण के बाद विषयों चलाते हैं ।
- अनुमति दें 20 min. के लिए परीक्षण कक्ष में acclimate करने के लिए चूहे
- को पहली बार rotarod का उपयोग करने के लिए चूहे को प्रशिक्षित करने के लिए पहले 4 आरपीएम की एक सेट स्पीड पर rotarod शुरू करें, फिर चूहे को rotarod पर लगाएं । चूहा 4 rpm पर एक पूर्ण क्रांति के लिए चलने के लिए अनुमति दें, तो त्वरण शुरू करने और चूहे rotarod पर चलने के लिए जब तक यह बंद हो जाता है की अनुमति । जारी रखने के प्रशिक्षण तक चूहे लगातार कम से ४० एस के लिए चल सकता है । एक स्वस्थ, युवा वयस्क चूहे आसानी से इस तरीके से प्रशिक्षित किया जाएगा ।
- एक नजर मोटर हानि के साथ एक चूहे के मामले में, जो चूहे को एक आधारभूत विलंबता को प्राप्त करने से रोकने के लिए ४० एस के गिर सकता है, चूहे 3-5 rotarod स्कोरिंग शुरुआत से पहले प्रशिक्षण का प्रयास प्रदान करते हैं ।
- rotarod परीक्षण शुरू करने के लिए, rotarod पर चूहा जगह और rotarod का त्वरण शुरू करते हैं । जिस समय चूहा rotarod से गिर जाता है उस पर ध्यान दें; यह विलंबता गिरने के लिए है । यदि चूहा १२० एस के बाद rotarod पर रहता है, इस बिंदु पर सत्र कैप, rotarod से चूहे को हटा दें और १२० s. की गिरावट विलंबता रिकॉर्ड
- तीन परीक्षणों की कुल के लिए दो बार और परीक्षण दोहराएं । थकान के प्रभाव को कम करने के लिए, अंतरिक्ष परीक्षणों के अलावा ंयूनतम 5 मिनट । तीन परीक्षणों के स्कोर औसत । एक अछूता वयस्क चूहा आम तौर पर एक औसत विलंबता है & #62 के पतन; ४० s.
- पिंजरे में चूहा वापस जगह है, और rotarod और ७०% इथेनॉल के साथ आसपास के क्षेत्रों को साफ ।
- Anesthetize चूहों और फॉस्फेट के साथ perfuse खारा (पंजाब) और फिर 4% paraformaldehyde । मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को टुकड़े और रात भर के लिए नियति में ऊतकों को भिगो दें और फिर उन्हें 30% सुक्रोज समाधान पर ले जाएं । equilibration के बाद कट ५० & #956; क m राज्याभिषेक खण् ड एक रपट पर ठंड के साथ microtome चरण < सुप class = "xref" > 4 , < सुप class = "xref" > 5 , < सुप class = "xref" > 6 .
- सेरिबैलम के 3-6 वर्गों है कि समान रूप से vermis, सेरिबैलम के केंद्रीय पालि में स्थान रहे है चुनें । फ्लोरोसेंट GFP संकेत अधिकतम करने के लिए लेबल । 1:500 पर GFP के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें और 1 के एक कमजोर पड़ने पर Alexa-४८८ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें: 300 < सुप class = "xref" > 4 , < सुप class = "xref" > 5 , < सुप क्लास = "xref" > 6 .
नोट: संदर्भ देखें < सुप वर्ग = "xref" > 4 , < सुप क्लास = "xref" > 5 , < सुप क्लास = "xref" > 6 पर और अधिक विस्तार के लिए नमूना, अनुभाग, और धुंधला प्रक्रियाओं. - एक कम आवर्धन लेंस के साथ एक खुर्दबीन का उपयोग कर ब्याज की परिभाषित क्षेत्र में प्रत्येक अनुभाग Photomicrograph । 2.5 x उद्देश्य (एनए ०.१२) और फ़िल्टर सेट 10, 450-490/515-565 उत्तेजना/उत्सर्जन) का उपयोग करें । कैमरा सेटिंग्स (एक्सपोजर बार, जैसे, 2 एस) नमूने भर में एक ही विश्लेषण किया जा करने के लिए रखें । के रूप में सहेजें । TIF file.
- व्यापक रूप से उपलब्ध वंशज छवि कार्यक्रम में photomicrograph खुला; दो खिड़कियां खुल जाएंगी । विंडो को बंद कर के रूप में इंगित & #34; अनुक्रमित रंग & #34;.
- चुन & #34; विकल्प & #34;, तो & #34;D ensity स्लाईस & #34;; लुक-अप तालिका (LUT) विंडो पर रंगों की श्रेणी को लाल रंग में दर्शाया जाएगा. विंडो में, केवल विशिष्ट GFP लेबलिंग में भरने के लिए कर्सर का उपयोग करें और रोकें जब गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि छवि में उठाया जा करने के लिए शुरू होता है ।
नोट: यह photomicrograph पर फ्लोरोसेंट क्षेत्र पर प्रकाश डाला जाएगा मात्रा हो । सेटिंग्स विशेष रूप से दिख फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के सभी पर कब्जा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । अभ्यास के साथ, इस विधि ठीक विशिष्ट प्रतिदीप्ति हाइलाइट कर सकते हैं । - फ्लोरोसेंट क्षेत्र को मापने से पहले, पहले सुनिश्चित करें कि माप बनाया सही इकाइयों (पिक्सल) में हैं । ऐसा करने के लिए, & #34; श्लेष & #34;, तो & #34; सेट केल & #34;; चौथी पंक्ति में कहना चाहिए & #34; इकाइयां & #34;. ड्रॉप-डाउन सूची से पिक्सेल में मापने के लिए पिक्सेल चुनें, फिर & #34 पर क्लिक करें; OK & #34;. विश्लेषण विकल्पों को टॉगल करें & #34; इसमें इंटीरियर होल & #34 शामिल करें; विश्लेषण में पूरे कोशिका शरीर के समावेश को सुनिश्चित करने के लिए.
- के लिए फ्लोरोसेंट क्षेत्र को मापने के लिए क्लिक करें & #34; श्लेष & #34; और उसके बाद & #34; नाप & #34;. यह मान देखने के लिए, & #34; विश्लेषण & #34; फिर क्लिक करें & #34; Show result & #34;; एक परिणाम विंडो दिखाई देगा । फ्लोरोसेंट क्षेत्र माप के तहत होगा शीर्षक लेबल & #34; क्षेत्र & #34;. माप के पार मानकीकरण सुनिश्चित करने के लिए
- , LUT विंडो में हाइलाइट किए गए मानों को न बदलें.
- एक बार सभी माप दर्ज किया गया है, औसत प्रत्येक जानवर के लिए मान (प्रति पशु 3-6 वर्गों से). समूहों के बीच transduced क्षेत्रों की तुलना करने के लिए एक उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण का उपयोग करें । < सुप वर्ग = "xref" > ६
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Representative Results
तेदेपा-४३ प्रेरित मोटर विकलांगता AAV तेदेपा के खुराक के आधार पर 2-6 सप्ताह के भीतर पैदा होना चाहिए-४३(चित्रा 1) इस्तेमाल किया । असफल पूंछ नस इंजेक्शन आंशिक या कोई विकलांगता में परिणाम होगा; AAV खून तक पहुंचने के लिए प्रभाव का उत्पादन करना चाहिए । AAV GFP का एक सफल इंजेक्शन मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में एक सदिश-खुराक निर्भर तरीके से भर में GFP अभिव्यक्ति में परिणाम होगा । जब अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए मजबूत संयोजक प्रमोटर का उपयोग कर, cytomegalovirus चिकन बीटा actin संकर प्रमोटर, भी सीएजी प्रमोटर के रूप में जाना जाता है, वहां सीएनएस में कुशल अभिव्यक्ति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई अंय ऊतकों जैसे जिगर और दिल है । 4 , 5 , 10 चूहे सीएनएस के भीतर, जब AAV9 या AAV PHP का उपयोग कर । बी वैक्टर, पैटर्न मुख्य रूप से ंयूरॉंस transduction और केवल विरल, छिटपुट glial transduction है । 4 , 8 transduction दक्षता में कोई लिंग अंतर व्यापक पैमाने पर विधि के साथ चूहों में मनाया गया था के बाद से, महिलाओं को आम तौर पर उनके कम वजन के कारण नसों में जीन हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । ६
अर्द्ध मात्रात्मक इमेजिंग विधि वर्णित तेजी से और विश्वसनीय है क्योंकि वहां एक उत्कृष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात है । एक गैर-transduced नमूना GFP एंटीबॉडी के साथ सना हुआ दोनों नमूनों के साथ चित्रा 2 में एक transduced नमूना के साथ तुलना में है । इन नमूनों से एकत्र किए गए मान ०.३% नॉइज़ ( चित्र b, Dमें सूचीबद्ध मानों से, गैर-transduced नमूना में इंगित करते हैं, जिसे नगण्य माना जा सकता है । उत्कृष्ट संकेत करने वाली शोर अनुपात को देखते हुए, इस विधि जैसे वेक्टर प्रकार, वेक्टर खुराक, लिंग, आयु, आदि के रूप में प्रयोगात्मक स्थितियों की तेजी से तुलना के लिए मांय है ।
चित्र 1. व्यापक पैमाने पर AAV9 तेदेपा-४३ चूहों को जीन हस्तांतरण प्रगतिशील मोटर हानि का कारण बनता है । या तो नियंत्रण GFP या एस से संबंधित जीन तेदेपा-४३ के जीन हस्तांतरण के बाद 1-3 सप्ताह में प्रदर्शन Rotarod । विषयों जीन हस्तांतरण से पहले परीक्षण किया गया और बाद में माप आधारभूत समय बिंदु के लिए एक अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया । एक सामांय अनुपचारित चूहे इन शर्तों के तहत ६०-९० एस से rotarod पर रहेंगे । यह आंकड़ा6से संशोधित किया जा चुका है ।
चित्र 2. सेरिबैलम में GFP-सकारात्मक फ्लोरोसेंट क्षेत्र के तेजी से ठहराव चूहे को नसों में AAV प्रशासन के बाद । A, B) नॉन-transduced नमूना जो GFP एंटीबॉडी के साथ सना हुआ था । सी, डी) AAV9 GFP प्राप्त एक चूहे से नमूना । ख, घ) वंशज छवि पर घनत्व टुकड़ा विकल्प चुनिंदा लाल रंग में फ्लोरोसेंट क्षेत्र को उजागर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और फिर लाल पिक्सल कार्यक्रम द्वारा गिना रहे हैं । घनत्व टुकड़ा विकल्प सी में देखा के रूप में दिखाई फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के सभी उजागर करना चाहिए । लाल क्षेत्र वर्ग पिक्सल में व्यक्त के रूप में कार्यक्रम की गणना बी में दिखाया गया है, डी । समय बिंदु था 4 सप्ताह के बाद AAV9 GFP के एक पूंछ नस इंजेक्शन के एक वेक्टर खुराक में एक युवा वयस्क चूहे के लिए 1 x 1014 वेक्टर जीनोम/ एक में स्केल बार ५३६ µm है; ए-डी में भी इज़ाफ़ा हुआ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
AAV वैक्टर के लिए कई प्रकार के डिलिवरी रूट का परीक्षण किया गया है: इंट्रा-parenchymal, इंट्रा-cerebroventricular, इंट्रा-thecal, नसों में, intranasal, इंट्रा-पेशी, आदि । प्रत्येक मार्ग में कमियां होने के साथ-साथ विशिष्ट फायदे भी हो सकते हैं । पूंछ नस AAV के वयस्क चूहों को प्रशासन सीएनएस के सुसंगत transduction को प्राप्त करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका है । परिधीय इंजेक्शन विधि सीएनएस ऊतकों में एक इंजेक्शन प्रवेशनी की शुरूआत से बचा जाता है और इसलिए ंयूनतम इनवेसिव है । इस विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है कि कुशल सीएनएस अभिव्यक्ति तकनीक का सबसे बड़ा फायदा है । अन्य व्यावहारिक लाभ कर रहे हैं कि इंजेक्शन विधि बहुत तेजी से (शुरू से खत्म करने के लिए प्रति पशु के बारे में 10 मिनट) है और पूंछ नस इंजेक्शन उच्च तकनीकी नहीं कर रहे हैं और इसलिए जल्दी से महारत हासिल कर सकते हैं. निश्चित रूप से, एक प्रमुख दोष यह है कि उच्च titer वेक्टर की एक बहुत जरूरत है, जो एक व्यवहार्यता मुद्दा अगर AAV प्रस्तुतीकरण 1 x 1013 वेक्टर जीनोम/ सदिश लक्ष्यीकरण क्षमताओं के आगे शोधन के साथ, इस दृष्टिकोण भविष्य में नैदानिक जीन थेरेपी के लिए लाभप्रद हो सकता है, यह देखते हुए कि जीन वितरण एक परिधीय मार्ग से है और इस तरह अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव । दूसरी ओर, और अधिक प्रत्यक्ष इंट्रा मस्तिष्कमेरु द्रव इंजेक्शन दो कारणों के लिए नैदानिक और नैदानिक दृष्टिकोण में लाभप्रद हो सकता है: अधिक वेक्टर और कम वेक्टर खुराक का उपयोग सीमित प्रसार ।
गहरे रंग रंजकता के साथ चूहों में, पूंछ नस की पहचान करने के लिए और अधिक मुश्किल हो सकता है । तो, ऐसे रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन या नसों में इंजेक्शन saphenous नस के रूप में प्रशासन के वैकल्पिक मार्गों का इस्तेमाल किया जा सकता है । रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन एक घने केशिका बिस्तर लक्ष्य और इस प्रकार एक नसों में इंजेक्शन के समान हैं । चूहों के लिए, और शायद चूहों के लिए भी, रेट्रो कक्षीय विधि पूंछ नस इंजेक्शन की तुलना में आसान हो सकता है, लेकिन तीन अध्ययनों वयस्क चूहों में पूंछ नस इंजेक्शन के महान निरंतरता दिखाया गया है । ६ , 8 , 9 इस काम के अधिकांश transgene अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए एक मजबूत संयोजक प्रमोटर का इस्तेमाल किया, cytomegalovirus चिकन बीटा actin हाइब्रिड प्रमोटर. 10 यदि प्रयोगकर्ता सीएनएस में न्यूरॉन्स को अभिव्यक्ति का सीमांकन करना चाहता है, तो एक सेल टाइप-विशिष्ट प्रमोटर का प्रयास किया जा सकता है, उदाहरण के लिए synapsin प्रमोटर । 8 , 11
इमेजिंग विधि के संबंध में, यह transduction दक्षता का आकलन करने के लिए एक त्वरित, अर्द्ध मात्रात्मक विधि है । यदि सही ढंग से आयोजित किया, तो परख transduced क्षेत्र का एक विश्वसनीय अनुमान पैदावार । सीएनएस ऊतक में वस्तुओं की गिनती के लिए सोने के मानक विधि stereology कहा जाता है । यह प्रति पशु के बारे में ७५ मिनट लगते है मस्तिष्क में ब्याज के एक क्षेत्र में एक stereological जांच का संचालन, जबकि वर्णित विधि पशु प्रति 20 मिनट में तेजी से है या भी कम जब ऊपर बढ़ाया । सभी शर्तों को बराबर रखा जाता है और एक ही क्षेत्र ठीक से नमूना लिया जाता है, तो डेटा की निरंतरता stereology के महान निरंतरता दृष्टिकोण, और नमूनों के बड़े समूहों जल्दी से सामूहिक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है.
वहां अतिरिक्त तकनीकी नोटों की एक संख्या है कि वारंट आगे चर्चा कर रहे हैं । 1 खंड के लिए वेक्टर खुराक के बारे में, वेक्टर खुराक चूहों में कुशल transgene अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया और त्रुटि और खुराक-वांग एट अलमें प्रतिक्रिया., Dayton एट अल., और जैक्सन एट अल., के रूप में अच्छी तरह के रूप में चूहों में प्रयुक्त पिछली खुराक (Foust एट अल. और डुकी एट अल). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 निश्चित रूप से एक महत्वपूर्ण है, और संभावित दर सीमित कदम उच्च titer AAV तैयार करने के लिए प्रभावी खुराक प्राप्त करने के लिए उत्पादन कर रहा है ।
धारा 3 के लिए सुई में वेक्टर लोड करने के बारे में, इंजेक्शन समाधान में हवा के बुलबुले के रूप में संभव के रूप में सबसे अच्छा बचा जाना चाहिए । हवा की एक छोटी राशि के रूप में इस फेफड़ों से बाहर फ़िल्टर किया जा सकता है समस्याग्रस्त नहीं होना चाहिए, लेकिन हवा के अत्यधिक मात्रा में नस में इंजेक्शन एक शिरापरक हवा शल्यता संभावित मौत में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है । 12 यदि बुलबुले सिरिंज में मौजूद हैं, वायरस सिरिंज से निष्कासित किया जाना चाहिए, और एक नया सिरिंज लोड किया जाना चाहिए. बुलबुले के निर्माण से बचने के लिए, सुई नीचे का सामना करना पड़ बेवल के साथ parafilm पर वेक्टर के ड्रॉप करने के लिए बंद स्थिति के लिए सुनिश्चित करें । जब वेक्टर के बहुमत सुई में ले लिया गया है, बहुत धीरे से शेष समाधान आकर्षित । एक छोटी सी हवा की जेब सिरिंज के पीछे के फार्म का होगा । यह मृत अंतरिक्ष है और इंजेक्शन नहीं किया जाएगा । यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह सिरिंज के पीछे की ओर रहता है, सिरिंज क्षैतिज रखने के लिए या नीचे कहा और सिरिंज झटका नहीं है.
इंजेक्शन के बारे में 5 खंड के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि इंजेक्शन नस और नहीं नस आसपास के ऊतकों में चला जाता है, एक बार सुई डाला गया है, सवार पर थोड़ा वापस खींचने के लिए सुई टिप पर नकारात्मक दबाव बनाने के लिए । के रूप में उल्लेख किया है, सुई नस में है, तो रक्त सुई में वापस प्रवाह करना चाहिए और सुई के आधार पर दिखाई जाएगी । जबकि नस में इंजेक्शन, थोड़ा प्रतिरोध महसूस किया जाना चाहिए जब सुई उचित रखा गया है । यदि महत्वपूर्ण प्रतिरोध का सामना करना पड़ा है, तो यह संभावना है कि इंजेक्शन पूंछ के ऊतकों में जा रहा है के रूप में ऊपर वर्णित है । नस के बीच से पंचर करना भी संभव है, जिसके कारण एक ' उड़ाई हुई नस ', जब वह कोण जो सुई डाला जाता है वह भी खड़ी हो जाती है, जब सुई का गेज नस के लिए बहुत बड़ा हो जाता है, या जब इंजेक्शन की गति भी तेज हो तो शिराओं पर बहुत अधिक दबाव डाल दिया जाता है. एक उड़ा नस नस के आरंभिक पंचर के दौरान या इंजेक्शन के दौरान हो सकता है । इंजेक्शन के दौरान नस puncturing से बचने के लिए या सुई होने नस से बेदखल हो जाते हैं, सिरिंज के रूप में उल्लेख किया पूंछ के खिलाफ सिरिंज के अंत धारण करके स्थिर किया जाना चाहिए. यदि सुई उखाड़ फेंका जाता है या एक दूसरे इंजेक्शन एक और कारण के लिए की जरूरत है, दूसरा इंजेक्शन या तो विपरीत पक्ष पर पार्श्व पूंछ नस या एक ही पक्ष पर शरीर के करीब करने के लिए बनाया जा सकता है ।
धारा 8 के लिए, rotarod परख प्रयोग के दौरान 4 सप्ताह के अंतराल पर चलाया जाता है । सामांय, अनुपचारित चूहों बेहतर स्कोर है जब वे छोटे है (4-6 सप्ताह पुरानी) से अधिक उंर में । भागने पलटा में घाटे समय के साथ अंग समारोह के अस्तित्व के रूप में रची जाती है । अस्तित्व घटता एक लॉग इन चश्मे सॉफ्टवेयर पर रैंक परीक्षण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं ।
धारा 9 के लिए transduction विश्लेषण के बारे में, अभ्यास के साथ, प्रक्रिया अपेक्षाकृत तेजी से हो जाता है, पशु या उससे कम प्रति 20 मिनट के बारे में ले । यह परख भी बेहद विश्वसनीय है क्योंकि गैर transduced ऊतकों कि GFP धुंधला प्रक्रिया एक मूल रूप से नगण्य पढ़ने के साथ संसाधित कर रहे है (चित्र b), और क्योंकि वहां readout के लिए एक विशाल गतिशील रेंज है । GFP प्रतिदीप्ति के अधिकांश transduced Purkinje कोशिकाओं से निकला है, और इस प्रकार उनके महान संख्या एक बड़ी गतिशील रेंज प्रदान करते हैं । अब तक, जीन हस्तांतरण दक्षता हासिल की रीडिंग पूरे क्षेत्र भर में संतृप्त करने के लिए कारण नहीं है (यानी, Purkinje कोशिकाओं के १००% transduction), कम से कम जब जीन हस्तांतरण वयस्क चूहों के लिए प्रशासित है । यदि पूरे क्षेत्र के संतृप्ति एक समस्या थी, तो संकेत अलग पशुओं में एक कम वेक्टर खुराक लागू करने या केवल कमजोर, देशी GFP प्रतिदीप्ति, forgoing धुंधला प्रक्रिया को मापने के द्वारा कम किया जा सकता है । निश्चित रूप से सेरिबैलम में अंय कोशिका प्रकार के transduction भी संकेत करने के लिए योगदान हो सकता है, लेकिन जो आसानी से दिखाई है और कार्यक्रम के द्वारा गिना की सबसे स्पष्ट रूप से Purkinje सेल परतों में कोशिका निकायों और आणविक में उनके वृक्ष पेड़ है सेरिबैलम भर परतों, उनके ज्ञात स्थिति और आकृति विज्ञान के आधार पर । विधि के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती है कि हवा के बुलबुले या फ्लोरोसेंट मलबे गिना जा सकता है, जो इस प्रकार रीडिंग दूषित होगा । इस शोर के साथ वर्गों और क्षेत्रों का उपयोग नहीं कर रहे हैं; गैर विशिष्ट शोर से मुक्त साफ नमूनों की आवश्यकता है । चूंकि GFP एक विदेशी प्रोटीन है, वहां ऊतक के भीतर कोई पृष्ठभूमि शोर है, तो विशिष्ट प्रतिदीप्ति ठीक पर कब्जा कर लिया और अनुमान किया जा सकता है । इन अध्ययनों में, GFP photomicrographs रंग में कब्जा कर लिया और फिर वंशज छवि के अलावा एक इमेजिंग कार्यक्रम का उपयोग कर ग्रेस्केल में परिवर्तित कर दिया गया । हालांकि, यह और अधिक के वंशज छवि में बाद में विश्लेषण के लिए पहली जगह में काले और सफेद में GFP पर कब्जा करने के लिए सरल होगा । पिछले अध्ययन एक प्रतिशत के आधार पर रीढ़ की हड्डी कम मोटर न्यूरॉन्स के transduction का विश्लेषण किया, यानी, motoneurons का प्रतिशत GFP व्यक्त. 4 , 6 हालांकि, सेरिबैलम के विश्लेषण और अधिक तेजी से है, कम वर्गों की आवश्यकता होती है और भी अधिक सुसंगत और विश्वसनीय भी (उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत पर्यवेक्षकों के आकलन के पार) प्रतीत होता है । रैपिड अनुमस्तिष्क इमेजिंग विधि इस प्रकार परिधीय-से-केंद्रीय जीन अंतरण की सफलता का एक अच्छा तेजी से सूचकांक है । स्पाइनल कॉर्ड transduction और चूहे तंत्रिका तंत्र में अंय साइटों की transduction के उदाहरण के विश्लेषण वांग एट अल., Dayton एट अल., और जैक्सन एट अल में सूचित किया गया है । 4 , 5 , ६
संक्षेप में, प्रशासन की नसों में मार्ग न्यूनतम इनवेसिव है; सीएनएस मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी में एक सुई रखने के बिना एक परिधीय प्रशासन द्वारा लक्षित किया जा सकता है । लक्ष्यीकरण के आगे शोधन के साथ साथ, प्रासंगिक पूर्व नैदानिक और नैदानिक जीन चिकित्सा नसों में प्रसव का उपयोग करने के लिए जारी रहेगा, जबकि कई चूहों में बुनियादी कार्यात्मक अध्ययन के भविष्य के प्रकार के लिए खोज में विशाल transduction द्वारा लाभ उठा सकते हैं vivo में जीन फंक्शन की परिकल्पना परीक्षण तेज़ ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम एस एसोसिएशन, Karyopharm चिकित्सकीय, Inc, मीरा GTx, और थॉमस एस, जिसके लिए हम आभारी है से लॉसन अनुसंधान के लिए एक धर्मार्थ दान द्वारा वित्त पोषित किया गया । हम सलाह और प्रशिक्षण के लिए Elysse बाग और डोना बर्नी धंयवाद । बीआयएस झूठ बोल फाउंडेशन और स्वास्थ्य अनुदान GM103418 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody - 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody - 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
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- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
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