Summary
闪光提取是用于分析挥发性和半挥发性化合物的新的实验室技术。通过施加超压并搅拌样品将载气溶解在液体样品中。然后将样品室减压。分析物种由于发泡而释放到气相中。
Abstract
溶解在液体样品中的挥发性和半挥发性化合物的化学分析可能具有挑战性。溶解的组分需要进入气相，并有效转移到检测系统。泡沫提取利用泡腾现象。首先，通过施加超压并搅拌样品，将载气（这里为二氧化碳）溶解在样品中。第二，样品室突然减压。减压导致在样品液体中形成许多载气泡。这些泡沫有助于将溶解的分析物质从液体释放到气相。释放的分析物立即转移到三重四极杆质谱仪的大气压化学电离界面。可离子化分析物种在时域中产生质谱信号。因为分析物质的释放发生在短时间内（几秒钟）onds），时间信号具有高幅度和高信噪比。然后，时间峰值的振幅和面积可以与经过精细提取的液体样品中的分析物的浓度相关联，这使得能够进行定量分析。泡沫提取的优点包括：简单，速度快，化学品（溶剂）使用有限。
Introduction
在自然界和日常生活中观察到的各种现象与气液相平衡有关。二氧化碳在升高的压力下溶解在软和含酒精的饮料中。当一瓶这样的泡沫饮料打开时，压力下降，气泡冲向液面。在这种情况下，泡腾可改善饮料的感官特性。气泡的释放也是减压病（“弯”）的主要原因1 。由于突然的减压，气泡形成在潜水员身上。患有减压病的人在高压室治疗。
气泡在分析化学中有各种应用。值得注意的是，喷射方法依靠通过液体样品的气泡来提取挥发性化合物2 。例如，称为“吹扫闭合回路”的方法与气相色谱相结合，可以快速分析二次溶解的挥发物3 。虽然喷射可以随着时间的推移不断地提取挥发物，但它并不局限于空间或时间。释放的气相物种需要被捕获，并且在某些情况下通过应用温度程序或使用吸附剂来浓缩。因此，需要引入新的在线样品处理策略，这可以减少步骤的数量，同时在空间或时间上浓缩挥发性分析物。
为了解决从液体样品中提取挥发性化合物并进行在线分析的挑战，我们最近推出了“fizzy extract” 4 。这种新技术利用了泡腾现象。简而言之，通过施加超压并搅拌样品，首先将载气（这里是二氧化碳）溶解在样品中。然后，样品室突然减压。突然减压导致形成许多载气泡在样品液体中。这些泡沫有助于将溶解的分析物质从液体释放到气相。释放的分析物立即转移到质谱仪，在时域产生信号。因为分析物种的释放被限制在短时间（几秒），所以时间信号具有高幅度和高的信噪比。
泡沫萃取过程中所涉及的压力非常低（约150 kPa） 4 ;远远低于超临界流体萃取5 （ 例如 ≥10MPa）。该技术不需要使用任何特殊的消耗品（色谱柱，墨盒）。只有少量的溶剂用于稀释和清洗。提取装置可以由具有中等技术技能的化学家使用广泛可用的部件组装4 ;例如，开源电子模块“> 6,7。碳酸提取可耦合上线用装有大气压化学电离（APCI）接口。由于气相萃取液转移至离子源，碳酸提取的操作基本上不污染脆弱现代质谱仪部分质谱仪。
这个可视化实验文章的目的是指导观众在简单的分析任务中如何实施fizzy提取。虽然fizzy提取系统的核心是我们以前的报告4所述 ，但已经引入了几项改进措施，使操作更为直接。配有LCD屏幕屏蔽的微控制器已经并入系统中以实时显示键提取参数。所有功能都在微控制器脚本中编程，并且不再需要使用外部计算机来c控制提取系统。
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Protocol
该协议假定所有步骤均按照相关的实验室安全规定进行。一些步骤使用商业手段 - 在这种情况下，需要遵循制造商的指导原则。处理有毒化学物质时，必须遵守MSDS的指导原则。定制设备4必须谨慎操作;特别是在处理加压气体和带电电线时。
1.准备标准溶液
- 通过将10μL柠檬烯与990μL乙醇混合，制备6.2×10 -2 M柠檬烯储存在乙醇中的溶液。
- 通过混合10μL6.2 x 10 -2柠檬烯，490μL乙醇和加入纯水至终体积为10 mL，制备10 mL 6.2 x 10 -5 M柠檬烯溶液。彻底摇匀容量瓶。
- 将准备的标准溶液转移到具有隔垫的20-mL螺旋顶部顶空玻璃小瓶中米帽稀释的标准溶液可用于测试系统。
2.准备样品
- 通过在厨房挤压器上挤压新鲜的酸橙水果（切成两半）来获得酸橙汁。
- 通过混合2 mL柠檬汁，500μL乙醇和加入纯水至最终体积为10 mL准备10 mL稀柠檬汁。彻底摇匀容量瓶。
- 将准备的样品转移到具有隔垫帽的20-mL螺旋顶部顶空玻璃小瓶中。
3.用标准解决方案填充真实样品
- 第一标准添加：通过混合2 mL柠檬汁，10μL6.2 x 10 -2 M柠檬烯溶液，490μL乙醇，并加入纯水至终体积为10 mL，准备10 mL加标样品。彻底摇匀容量瓶。
- 第二标准添加：通过混合2 mL柠檬汁，20μL6.2 x 10 -2 M柠檬酸制备10 mL加标样品e溶液，480μL乙醇，并加入纯水至终体积为10mL。彻底摇匀容量瓶。
4.设置雾化提取系统
- 将闪烁提取系统（ 图1 ） 4放在三重四极杆质谱仪的APCI源旁边。
- 将二氧化碳气瓶连接到气泡提取系统的供气口。打开气体调节器中的阀门。将输出压力设置为1.5 bar（150 kPa）。
- 将提取室出口连接到离子源入口。
- 将发泡系统连接到12 V电源。
- 设置三重四极杆质谱仪的数据采集软件 （ 图2 ）。 在正离子多反应监测（MRM）模式下，用氩气作为碰撞，用APCI光源操作仪器加油站。
- 运行数据采集软件。
- 选择“仅LCMS8030”选项。
- 选择选项“MS开/关”。
- 设置去溶剂化温度线至250℃，和分钟-1干燥气体至15升的流量。等待每个仪器参数的值与预设值相同。
- 选择MS数据采集方法文件。
- 确保碰撞电压为-20 V，前体离子m / z为137，碎片离子m / z为81和95
- 点击“开始单次运行”按钮。
- 键入文件名。
- 选择文件路径。
- 转到第5节（“进行泡沫提取”）。
- 选择选项“MS开/关”。
- 关闭软件窗口。
- 勾选“雾化气体关闭”，“DL加热器关闭”，“热块关闭”和“干气关闭”。点击“确定”＃34 ;.
5.进行气泡提取
- 通过使用螺丝钉将样品瓶放入精油萃取系统。萃取系统在室温（〜25℃）下运行。
- 按fizzy提取系统的LCD屏幕上的“开始”按钮。
- 等待自动化嘶嘶声提取过程执行（ 图3 ）。观察三重四极杆质谱仪屏幕上离子信号的发展。
注意：自动执行以下步骤：样品顶空在60秒内用二氧化碳冲洗。样品在二十六秒钟内用二氧化碳加压。搅拌马达开启。样品减压形成多个气泡。在后期阶段，搅拌马达开启以增加起泡。 - 取出（拧下）样品瓶。
- 用纤维素组织擦拭样品搅拌轴。
- 洗涤搅拌sp放入乙醇，再次用纤维素组织擦拭。
- 该系统已准备好分析另一个样品（重复步骤5.1-5.6）。
- 关闭电源。
- 从离子源中断开发泡管。
- 关闭气瓶的阀门，并断开气体管道。
数据分析
- 将三重四极杆质谱仪的数据采集软件的m / z 81的离子流输出到ASCII文件（ 图4 ）。
注意：在本演示中不使用m / z 95处的离子电流。- 运行数据采集软件。选择“Postrun”选项。
- 选择“选择项目（文件夹）”选项，然后选择数据文件。
- 点击“文件”菜单，选择“导出数据”/“导出数据为ASCII”。
- 选择 ＆＃34;输出文件“，并选择文件路径，选择”MS色谱图（MC）“。
- 将原始数据集导入峰集成软件，并测量峰面积（ 图5 ）。设置：线性基线; HVL功能。
- 运行峰值集成软件。
- 从“文件”菜单中选择“导入”选项。点击“是”按钮。
- 选择X和Y列中的数据。点击“确定”按钮。选择“AutoFit Peaks I Residuals”选项。
- 半自动适应提取峰。确保拟合曲线遵循实验数据点。选择“List Peak Estimates”列表。选择选项“ASCII编辑器”。
- 将拟合结果复制到“剪贴板”。
- 在数据分析软件中将测量的峰值区域输入电子表格（ 图6 ）。 <OL>
- 运行数据分析软件。
- 输入X列中的浓度值和Y列中的峰面积值。从“Plot”菜单中选择“Symbol”/“Scatter”选项。从“分析”菜单中选择“调整”/“适合线性”选项。
其中我是线性函数的截距，而S是斜率。
其中DF是稀释因子（这里是5）。
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Representative Results
开始时，使用标准解决方案测试嘶嘶声提取系统。随后，分析了标准样品和真实样品。提取事件的时间峰面积与经过精炼提取的液体样品中分析物的浓度相关，可进行定量分析。在这里，我们执行了双重标准添加，以演示该技术的定量能力（ 图7 ）。线性回归导致以下功能（ 图8 ）：
Peak_area =（3.25×10 7 ±0.36×10 7 ） C 稀释 +（2,770±276）
稀释的变量C指加入的柠檬烯标准品的浓度（即每升n摩尔，M）。基于获得的斜率和截距值，稀释的酸橙汁样品中柠檬烯的浓度为：8.51×10 -5 ±1.26×10 -5 M。将该值乘以稀释因子（5）后，柠檬烯浓度在原始的酸橙汁样品中为：4.26×10 -4 ±0.63×10 -4 M.
的分析性能诸如检测和该方法的定量限主要描述符以前报道4。例如，分析重复性（RSD）为6-19％。柠檬烯的检测限为〜10 -4 M 4 。我们认为，提升原型系统的缺陷有助于信号波动。当发泡进一步进一步商业化时，可以消除这些缺点。
图1：闪光提取系统的照片（带标签）。 （ A ）顶视图; （ B ）正视图。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：设置三重四极杆质谱仪的数据采集软件。连续步骤如图A和图B所示。数字表示协议步骤4.5。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：典型泡沫提取实验的工作流程。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：将提取的离子电流从数据采集软件导出到ASCII文件。数字是指协议步骤6.1。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：将原始数据集导入到峰中测量软件，并测量峰值区域。连续步骤如图A和图B所示。编号参见协议步骤6.2。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6：在数据分析软件中将测量的峰值区域输入到电子表格中，并进行线性回归。数字是指协议步骤6.3。 请点击此处查看此图的较大版本。
图7：柠檬的典型原始数据标准溶液和酸橙汁样品。
在m / z 81处记录的提取的离子电流，通过碰撞诱导的解离在m / z 137处的母离子断裂之后。碰撞气体：氩气。碰撞电压：-20V。原始数据：稀柠檬汁;第一次加入柠檬烯标准后稀释的酸橙汁（浓度增加：6.20×10 -5 M）;第二次加入柠檬烯标准液（浓度增加：1.24×10 -4 M）后稀释的酸橙汁。 请点击此处查看此图的较大版本。
图8：将柠檬烯标准品浓度添加到稀释的酸橙汁样品中的时间峰面积相关图。urce.jove.com/files/ftp_upload/56008/56008fig8large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
一些聪明的方法来提供样品质谱仪在过去的三个十年中进行的研究，开发（ 例如 ，参考8，9，10，11，12，13，14）。这些研究的目标之一是简化样品的准备以进行分析。为了实现这一目标，引入了离子源设计的各种修改。在某些情况下，新开发的离子源允许化学家分析富含基质的样品，这通常会产生光谱干扰。在替代方法中，对常规电离方案的修改最小化，而样品制备（提取）在线和自动进行（ 例如参考文献15 ，类= “外部参照”> 16，17，18）。这里4中的测量系统举例说明了概念，因为萃取工艺与常规离子化技术相结合（ 即 ，APCI 19,20， 参见 图1）。然而，将来不应该排除与其他离子源或检测器的耦合，这可能会增加可检测物种的范围。
提花装置操作简单，可用于定量分析。在这个示范中，我们展示了通过实施双标准加法来检测和定量存在于真实样品（酸橙汁）中的挥发性化合物的可能性。所获得的新鲜柠檬汁中柠檬烯（及其异构体）的浓度估计为4.26×10 -4M，其在这种基质中非常接近柠檬烯的浓度范围，如文献报道（4.4×10 -4 -5.1×10 -4 M） 21 。当然，根据品种，生长条件，收获时间，储存条件以及获得果汁的方法分析，柠檬水果中柠檬烯的浓度预期会有所不同，仅举几个因素。实施同位素标记的内部标准以补偿实验变异性将是理想的。然而，这种同位素标准是昂贵的，并且它们不适用于大多数感兴趣的分析物。
所提出的提取方案中的关键步骤包括：（i）建立起泡提取装置（连接电源，载气瓶，三重四极杆质谱仪）; （ii）调节载气的压力; （iii）建立三重四极杆质谱仪的软件用于数据采集; （iv）将样品瓶置于精细提取系统中; （v）清洗搅拌轴;和（vi）数据处理（峰值积分）。
例如，如果搅拌轴不能很好地清洗，则可能导致分析物的残留，并降低分析精度。此外，应注意提取期间形成的泡沫泡沫的水平。如果一些这种泡沫意外地进入载气管或提取管，系统可能会被污染。在这种情况下，管道必须用乙醇彻底清洗。
二氧化碳是首选的载气，因为它在水中的溶解度很高。它也用于生产泡沫饮料。事实上，泡沫提取的启发是通过观察气泡和从气味饮料中释放香气。然而，在后续研究中，我们将验证使用其他气体作为载气的可能性。
总之，泡沫提取的优点包括：化学品的简单性，速度和有限的使用（ 即用于萃取或稀释的溶剂）。这里介绍的实验系统的一个缺点是使用低分辨率四极杆质谱仪可能的光谱干扰限制了该技术的适用性，因此，将配置有离子回旋共振或轨道离子阱分析仪的高分辨率质谱仪耦合起来，是有吸引力的，在本演示中，质量分辨率低分析仪（四极杆）通过应用多重反应监测（在一定程度上）得到补偿，这稍微提高了质谱检测的选择性。我们预计在不久的将来会出现新的应用。例如，可以适用于检测食品，饮料，化妆品和家用产品中的挥发性有机化合物，如w作为环境样品。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
我们要感谢台湾科技部（拨款号：第104-2628-M-009-003-MY4号），为这项工作提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Fisher | W6212 | Diluent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | Diluent |
| (R)-(+)-Limonene | Sigma-Aldrich | 183164-100ML | Standard |
| Carbon dioxide | ChiaLung | n/a | Carrier gas |
| Cellulose tissue, Kimwipes Kimtech | Kimberly-Clark | 34120 | Used for cleaning |
| Triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | LCMS-8030 | Detection system |
| Atmospheric pressure chemical ionization interface | Shimadzu | Duis | Ion source |
| 20-mL screw top headspace glass vial with septum cap | Thermo Fisher Scientific | D-52379 | Sample vial |
| LabSolutions software | Shimadzu | n/a | version 5.82 |
| PeakFit software | Systat Software | n/a | version 4.12 |
| OriginPro software | OriginLab | n/a | version 8 |
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