Summary
発泡抽出は、揮発性および半揮発性化合物の分析のための新しい実験技術である。キャリアガスは、過圧をかけてサンプルを攪拌することによって液体サンプルに溶解される。次に、試料室を減圧する。検体種は、沸騰により気相に遊離する。
Abstract
液体試料中に溶解した揮発性および半揮発性化合物の化学分析は困難であり得る。溶解された成分は気相に持ち込まれ、検出システムに効率的に移される必要がある。発泡性抽出は発泡現象を利用する。まず、サンプルを過圧して攪拌することによって、キャリアガス（ここでは二酸化炭素）をサンプルに溶解させる。第2に、サンプルチャンバは急激に減圧される。減圧することにより、サンプル液中に多数のキャリアガス泡が形成される。これらの気泡は、液体から気相への溶解した検体種の放出を助ける。放出された検体は、直ちに三重四重極質量分析計の大気圧化学イオン化界面に移される。イオン化可能な検体種は、時間領域において質量分析信号を発生させる。検体種の放出は短時間（数秒時間的信号は高い振幅と高い信号対雑音比を有する。次いで、時間的ピークの振幅および面積は、発泡抽出に供された液体試料中の分析物の濃度と相関させることができ、定量分析が可能になる。発泡性抽出の利点には、シンプルさ、スピード、および化学物質（溶媒）の限定された使用が含まれる。
Introduction
自然や日常生活で見られる様々な現象は、気液相平衡と関連している。二酸化炭素は、高圧下で軟およびアルコール飲料中に溶解される。このような発泡飲料のボトルが開かれると、圧力が低下し、ガス泡が液体表面に突入する。この場合、発泡は飲料の感覚刺激特性を改善する。気泡の放出は、減圧症の主な原因でもあります（「屈曲」） 1 。突然の減圧のために、気泡はダイバーの体内で形成される。減圧病に罹患している人は高圧室で治療される。
ガス泡は、分析化学において様々な用途を有する。注目すべきは、噴霧方法は液体サンプルにガス泡を通して揮発性化合物を抽出することに依拠していることである2 。例えば、「パージ閉ループ」と呼ばれる方法をガスクロマトグラフィーと組み合わせて、ジ溶解した揮発性物質3 。散布は時間の経過とともに揮発性物質を連続的に抽出することができるが、揮発性物質を空間または時間に閉じ込めるものではない。放出された気相種はトラップされる必要があり、場合によっては、温度プログラムを適用するか、または吸着剤を使用することによって濃縮される必要がある。従って、工程の数を減らすことができ、同時に揮発性の分析対象物を空間または時間で濃縮することができる新しいオンライン試料処理戦略を導入する必要がある。
液体サンプルから揮発性化合物を抽出し、オンラインで分析するという課題に取り組むために、我々は最近、「発泡抽出」 4を導入した。この新しい技術は発泡現象を利用する。簡単に説明すると、サンプルを過圧して攪拌することによって、まずキャリアガス（ここでは二酸化炭素）をサンプルに溶解させる。そして、試料室が急激に減圧される。突然の減圧によって多数のキャリアガス泡が形成される試料液中に存在する。これらの気泡は、液体から気相への溶解した検体種の放出を助ける。放出された検体は直ちに質量分析計に転送され、時間領域で信号を生成する。検体種の放出は短時間（数秒）に限定されるので、時間信号は高い振幅と高い信号対雑音比を有する。
発泡性抽出プロセスに伴う圧力は非常に低い（〜150kPa） 4 。超臨界流体抽出5よりもはるかに低い（ 例えば 、≧10MPa）。この技術では、特別な消耗品（カラム、カートリッジ）を使用する必要はありません。少量の溶媒しか希釈と洗浄に使用されません。抽出装置は、広く利用可能な部品4を使用して中程度の技術スキルを持つ化学者によって組み立てることができます。例えば、オープンソース電子モジュール「> 6、7。発泡性抽出は、気相抽出物をイオン源に転送されるので、発泡性抽出の動作は実質的に脆弱で汚染しない。大気圧化学イオン化（APCI）インターフェースを備えた近代的な質量分析計を用いてオンラインで結合することができます。質量分析計の一部。
この視覚化された実験記事の目的は、単純な分析作業で発火抽出を実装する方法を視聴者にガイドすることです。発泡性抽出システムの核心は、以前の報告書4に記載されているが、操作をより簡単にするためにいくつかの改良が導入されている。 LCDスクリーンシールドを備えたマイクロコントローラが、キー抽出パラメータをリアルタイムで表示するためにシステムに組み込まれています。すべての機能はマイクロコントローラスクリプトでプログラミングされており、もはや外部コンピュータを使用してc抽出システムを制御する。
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Protocol
このプロトコールは、すべてのステップが関連する実験室の安全規制に従って行われることを前提としています。ステップのいくつかは商業用機器を使用します - その場合、製造業者のガイドラインに従う必要があります。有害化学物質を取り扱う際は、MSDSガイドラインに従う必要があります。カスタムメイドの機器4は慎重に操作する必要があります。特に、加圧ガスや電気配線を取り扱う際には注意が必要です。
1.標準液の調製
- 10μLのリモネンと990μLのエタノールを混合することにより、エタノール中のリモネンの6.2 x 10 -2 M原液を調製する。
- 6.2 x 10 -5リモネン溶液10 mLを6.2 x 10 -2のリモネンと490μLのエタノールを混合し、純水を加えて最終容量10 mLとすることにより、10 mLの6.2 x 10 -5 Mリモネン溶液を調製する。メスフラスコを十分に振る。
- 調製した標準溶液をセプタム付き20 mLスクリュー上部ヘッドスペースガラスバイアルに移す。mキャップ。希釈した標準溶液は、システムを試験するために使用することができる。
2.実試料の調製
- キッチンスクイーザで新鮮なライムフルーツ（半分にカット）を絞ってライムジュースを入手してください。
- 2mLのライムジュース、500μLのエタノールを混合し、最終容量が10mLになるように純水を加えることにより、希釈したライムジュース10mLを調製する。メスフラスコを十分に振る。
- 調製したサンプルを、セプタムキャップを備えた20mLスクリュー上部ヘッドスペースガラスバイアルに移す。
3.標準サンプルを使用したリアルサンプルのスパイク
- 最初の標準添加：2mlのライムジュース、6.2μlの6.2 x 10 -2 Mリモネン溶液、490μlのエタノールを混合し、10mlの最終容量まで純水を加えることにより、10mlのスパイクサンプルを調製する。メスフラスコを十分に振る。
- 2回目の標準添加：2mLのライムジュース、6.2μLの6.2×10 -2 Mリモネンe溶液、480μLのエタノール、および純水を加えて最終容量を10mLとした。メスフラスコを十分に振る。
4. Fizzy Extraction Systemのセットアップ
- トリプル四重極質量分析計のAPCIソースの横に発泡性抽出システム（ 図1 ） 4を置きます。
- 二酸化炭素ガスボンベを発泡性抽出システムのガス供給口に接続します。ガスレギュレータのバルブを開きます。出力圧力を1.5 bar（150 kPa）に設定します。
- 抽出チャンバーの出口をイオン源の入口に接続します。
- 発泡抽出システムを12V電源に接続します。
- 三連四重極質量分析計のデータ収集ソフトウェアをセットアップします （ 図2 ）。 アルゴンを衝突として、陽イオン多重反応モニタリング（MRM）モードでAPCIソースを使用して装置を操作するガス。
- データ収集ソフトウェアを実行します。
- 「LCMS8030のみ」オプションを選択します。
- オプション "MS On / Off"を選択します。
- 脱溶媒ラインの温度を250℃に設定し、乾燥ガスの流量を15L min -1に設定します。各インストゥルメントパラメーターの値がプリセット値と同じになるまで待ちます。
- MSデータ取得方法ファイルを選択します。
- 衝突電圧が-20Vであり、前駆イオンm / zが137であり、フラグメントイオンm / zが81および95であることを確認する
- "Start Single Run"ボタンをクリックしてください。
- ファイル名を入力します。
- ファイルパスを選択します。
- セクション5（「発泡性抽出の実行」）に移動します。
- オプション "MS On / Off"を選択します。
- ソフトウェアウィンドウを閉じます。
- 「Nebulizing Gas Off」、「DL Heater Off」、「Heat Block Off」、「Dry Gas Off」の項目をチェックします。 [OK]をクリックし、＃34;
5.発泡性抽出の実施
- スクリューマウントを使用して発泡性抽出システムにサンプルバイアルを置きます。抽出システムは、室温（約25℃）で操作される。
- Fizzy抽出システムのLCDシールドの "Start"ボタンを押します。
- 自動発泡抽出プロセスが実行されるのを待ちます （ 図3 ）。トリプル四重極質量分析計の画面上のイオン信号の発生を観察する。
注：次のステップは自動的に実行されます：サンプルヘッドスペースは60秒間二酸化炭素で洗い流されます。試料を60秒間二酸化炭素で加圧する。攪拌機モーターが作動しています。試料は減圧される。複数の気泡が形成される。後の段階では、撹拌モータが作動して、発泡を強化する。 - サンプルバイアルを取り出します（取り外す）。
- サンプル攪拌スピンドルをセルロース組織で拭きます。
- 攪拌spを洗うエタノールで満たし、再びセルロース組織で拭いてください。
- システムは、別のサンプルの分析の準備が整う（ステップ5.1-5.6を繰り返す）。
- 電源を切ります。
- 発泡性抽出出口管をイオン源から外す。
- ガスボンベのバルブを閉じ、ガス配管を外します。
データ解析
- m / z 81の抽出されたイオン電流をトリプル四重極質量分析計のデータ収集ソフトウェアからASCIIファイルにエクスポートします（ 図4 ）。
注：このデモンストレーションでは、 m / z 95のイオン電流は使用されていません。- データ収集ソフトウェアを実行します。オプション "Postrun"を選択します。
- 「プロジェクト（フォルダ）を選択」オプションを選択し、データファイルを選択します。
- 「ファイル」メニューをクリックし、「データのエクスポート」/「ASCIIとしてのデータのエクスポート」を選択します。
- 選択＆＃34; Output File "を選択し、ファイルパスを選択します。" MS Chromatogram（MC） "を選択します。
- 生データセットをピークインテグレーションソフトウェアにインポートし、ピーク領域を測定します（ 図5 ）。設定：線形ベースライン; HVL機能。
- ピーク統合ソフトウェアを実行します。
- [ファイル]メニューから[インポート]オプションを選択します。 "はい"ボタンをクリックしてください。
- XとYの列でデータを選択します。 "OK"ボタンをクリックしてください。オプション "AutoFit Peaks I Residuals"を選択します。
- 抽出ピークを半自動的に適合させる。フィッティングされた曲線が実験データ点に沿っていることを確認します。オプション "ピークピーク見積もり"を選択します。オプション "ASCII Editor"を選択します。
- フィット結果を「クリップボード」にコピーします。
- 測定されたピーク面積をデータ解析ソフトウェアのスプレッドシートに入力します（ 図6 ）。 <ol>
- データ解析ソフトウェアを実行します。
- Xカラムの濃度値とYカラムのピーク面積値を入力します。 [Plot]メニューから[Symbol] / [Scatter]を選択します。 [解析]メニューから[フィッティング] / [線形フィット]オプションを選択します。
ここで、 Iは線形関数の切片であり、 Sは勾配である。
DFは希釈係数（ここでは5）です。
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Representative Results
最初に、発泡性抽出システムを標準溶液で試験する。続いて、標準試料でスパイクされた実試料および実試料を分析する。抽出事象の時間的ピークの領域は、発泡抽出に供された液体試料中の分析物の濃度と相関し、定量分析が可能になる。ここでは、この技術の定量的能力を示すために二重標準添加を行った（ 図7 ）。線形回帰は次の関数を導いた（ 図8 ）。
Peak_area =（3.25×10 7±0.36×10 7）C 希釈 +（2,770±276）
変数C dilは、添加されたリモネン標準の濃度（inモル/リットル、M）。得られた傾きおよび切片値に基づいて、希釈した石灰ジュース試料中のリモネンの濃度は、8.51×10 -5 ±1.26×10 -5 Mであった。その値に希釈係数（5）を掛けた後、リモネン元のライムジュースサンプルでは4.26×10 -4 ±0.63×10 -4 Mであった。
この方法の検出および定量の限界などの分析性能の主な記述子は、以前に報告されている4 。例えば、分析再現性（RSD）は6〜19％であった。リモネンの検出限界は〜10 -4 M 4であった 。発泡性抽出プロトタイプシステムの不完全性が信号変動に寄与すると我々は考えている。これらの欠点は、発泡性抽出装置がさらに開発され、商品化されるときに排除することができる。
図1：発泡性抽出システムの写真（ラベル付）。 （ A ）上面図、 （ B ）正面図である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：トリプル四重極質量分析計のデータ収集ソフトウェアのセットアップ。連続するステップはパネルAおよびBに示されている。数字はプロトコールステップ4.5を参照する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：典型的な発泡抽出実験のワークフロー。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：抽出されたイオン電流をデータ収集ソフトウェアからASCIIファイルにエクスポートする。番号は、プロトコルのステップ6.1を参照してください。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5：未処理のデータセットを測定ソフトウェア、およびピーク面積の測定を行います。連続するステップは、パネルAおよびBに示されている。数字はプロトコルステップ6.2を参照する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6：測定されたピーク面積をデータ解析ソフトウェアのスプレッドシートに入力し、線形回帰を行う。番号はプロトコルのステップ6.3を参照してください。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図7：リムーネンの典型的な生データ標準液とライムジュースのサンプル。
衝突誘起解離によってm / z 137に親イオンが断片化された後、抽出されたイオン電流がm / z 81で記録された。衝突ガス：アルゴン。衝突電圧：-20 V。生データ：希釈したライムジュース。リモネン標準（濃度増加：6.20×10 -5 M）の最初の添加後に希釈したライムジュース。リモネン標準（濃度増加：1.24×10 -4 M）の2回目の添加後に希釈したライムジュース。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図8：希釈されたライムジュースサンプルに添加されたリモネン標準の濃度を用いた時間的ピーク領域のプロット。urce.jove.com/files/ftp_upload/56008/56008fig8large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
質量分析計にサンプルを提供するいくつかのスマートな方法は、過去30年の間に行われた研究で開発された（ 例えば 、参考文献8、9、10、11、12、13、14）。これらの研究の目的の1つは、分析のためのサンプルの準備を簡素化することでした。この目標を達成するために、イオン源設計に様々な修正が導入された。場合によっては、新しく開発されたイオン源により、化学者は、通常、スペクトル干渉を生じさせる可能性のあるマトリックスが豊富なサンプルを分析することができました。サンプル調製（抽出）は、オンライン行い、自動化されながら、別のアプローチでは、従来のイオン化方式への変更は、最小化される（ 例えば 、15を参照し、クラス= "外部参照"> 16、17、18）。抽出プロセスは、従来のイオン化技術と組み合わされているので、ここで4提示測定システムがその概念を例示する（ すなわち 、APCI 19、20、 参照 図 1）。しかし、将来的には、他のイオン源または検出器とのカゼイン抽出を排除すべきではなく、潜在的に検出可能な種の範囲を増加させる可能性がある。
発泡性抽出装置は操作が簡単であり、定量分析に使用することができる。このデモンストレーションでは、二重標準添加法を実施することによって、実際のサンプル（ライムジュース）中に存在する揮発性化合物を検出し定量化する可能性を示す。得られた新鮮なライムジュース中のリモネン（その異性体と共に）の濃度は、4.26×10 -4Mであり、文献（4.4×10 -4 -5.1×10 -4 M） 21で報告されているように、この種のマトリックス中のリモネンの濃度範囲に非常に近い。確かに、石灰果実のリモネンの濃度は、栽培品種、生育条件、収穫時期、保存条件、分析のためのジュースを得る方法などによって変わることが予想されます。実験的な変動性を補償するために、同位体標識された内部標準を実施することが理想的であろう。しかしながら、そのようなアイソトポログの標準は高価であり、ほとんどの関心対象の分析物には利用できない。
提示された発泡抽出プロトコルの重要なステップは、（i）発泡性抽出装置（電源、キャリアガスボンベ、三重四重極質量分析計を接続すること）を設定すること。 （ii）キャリアガスの圧力を調整する。 （iii）トリプル四重極質量分析計のソフトウェアをセットアップするデータ取得のための; （iv）試料バイアルを発泡性抽出システムに配置するステップと、 （v）攪拌スピンドルを洗浄するステップと、 （vi）データ処理（ピーク積分）。
例えば、攪拌スピンドルがきれいに洗浄されない場合、これは検体の持ち越しをもたらし、分析精度を低下させる可能性がある。さらに、抽出中に形成された泡のレベルに注意を払う必要があります。この泡の一部が誤ってキャリアガス管または抽出管に入ると、システムが汚染される可能性があります。そのような場合、チューブはエタノールで十分に洗浄しなければなりません。
二酸化炭素は、水への溶解度が高いため、第一選択のキャリアガスであった。また、発泡性飲料の製造にも使用されます。実際、発泡性の抽出は、泡の観察と発泡性の飲み物からのアロマの放出に触発されました。しかし、フォローアップ研究では、キャリアガスとして他のガスを使用する可能性を検証します。
全体的に、発泡性抽出の利点は、シンプルさ、スピード、および化学物質の限定された使用（ すなわち 、抽出または希釈のための溶媒）を含むことである。ここに示された実験システムの1つの欠点は、低解像度四重極質量分析計イオンサイクロトロン共鳴または軌道イオントラップアナライザを装備した高分解能質量分析計を用いてフィージー抽出を結合することは魅力的であるが、本実証では、質量の低い分解能分析装置（四重極）は、多少の反応モニタリングを適用することによって（ある程度まで）補償され、質量分析検出の選択性をわずかに増加させる。我々は、発泡性の抽出が近い将来に新しいアプリケーションを見つけることを予見する。例えば、食品、飲料、化粧品および家庭用製品における揮発性有機化合物の検出に適している可能性があり、w環境サンプルとして知らせる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
本研究の資金的支援のため、台湾科学技術省（助成番号：MOST 104-2628-M-009-003-MY4）に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water | Fisher | W6212 | Diluent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | Diluent |
| (R)-(+)-Limonene | Sigma-Aldrich | 183164-100ML | Standard |
| Carbon dioxide | ChiaLung | n/a | Carrier gas |
| Cellulose tissue, Kimwipes Kimtech | Kimberly-Clark | 34120 | Used for cleaning |
| Triple quadrupole mass spectrometer | Shimadzu | LCMS-8030 | Detection system |
| Atmospheric pressure chemical ionization interface | Shimadzu | Duis | Ion source |
| 20-mL screw top headspace glass vial with septum cap | Thermo Fisher Scientific | D-52379 | Sample vial |
| LabSolutions software | Shimadzu | n/a | version 5.82 |
| PeakFit software | Systat Software | n/a | version 4.12 |
| OriginPro software | OriginLab | n/a | version 8 |
References
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