Summary
Dette er en høj fedt diæt fodring protokol for at fremkalde fedme i Drosophila, en model for forståelse grundlæggende molekylære mekanismer involveret i lipotoxicity. Det giver også en høj overførselshastighed triacylglyceride analyse til måling af fedt ophobning i Drosophila og potentielt andre (insekt) modeller under forskellige ernæringsmæssige, miljømæssige, genetiske eller fysiologiske forhold.
Abstract
Hjertesygdom er den største årsag til menneskers død over hele verden. Talrige undersøgelser har vist stærke forbindelser mellem fedme og hjerte funktionsfejl i mennesker, men flere værktøjer og forskning er nødvendig for at bedre belyse de involverede mekanismer. For over et århundrede, Drosophila genetisk meget tractable modellen har været medvirkende til opdagelsen af vigtige gener og molekylær veje, der viste sig at være særdeles bevaret på tværs af arter. Mange biologiske processer og sygdomsmekanismer er funktionelt bevares i fluen, som udvikling (f.eks., organ planen, hjertet), kræft og neurodegenerative sygdomme. For nylig, undersøgelse af fedme og sekundære patologier såsom hjertesygdomme i modelorganismer, har spillet en meget afgørende rolle i identificeringen af centrale myndigheder involveret i Metaboliske syndrom hos mennesker.
Her, foreslår vi at bruge denne model organisme som et effektivt redskab til at fremkalde fedme, dvs, overdreven fedtophobning, og udvikle en effektiv protokol for at overvåge fedtindhold i form af TAGs ophobning. Ud over den yderst velbevarede, men mindre kompleks genom har flyve også en kort levetid for hurtig eksperimenter, kombineret med omkostningseffektivitet. Dette papir giver en detaljeret protokol for høj fedt diæt (HFD) fodring i Drosophila at fremkalde fedme og en høj overførselshastighed triacylglyceride (TAG) analyse til måling af den dermed forbundne forhøjelse fedtindhold, med formålet at være yderst reproducerbare og effektiv for omfattende genetiske eller kemisk screening. Disse protokoller tilbyder nye muligheder til effektivt undersøge regulerende mekanismer involveret i fedme, samt yde en standardiseret platform for drug discovery forskning til hurtige test lægemiddelkandidater virkning på udviklingen eller forebyggelse af fedme, diabetes og beslægtede metaboliske sygdomme.
Introduction
Vi befinder os i en tid, hvor fedme og dens tilknyttede økonomiske byrder, er et verdensomspændende problem1. To ud af hver tre amerikanere er overvægtige eller fede med relaterede hjerte patologier, den primære dødsårsag i den voksne befolkning2. Nye effektive metoder er nødvendige for at tilstrækkeligt undersøger de genetiske og molekylære komponenter, der er impliceret i reguleringen af metabolisk syndrom ved hjælp af modelorganismer. Derfor vælger vi frugtflue Drosophila model, fordi det deler de mest basale biologiske processer med pattedyr, herunder mus og mennesker3,4,5,6. Drosophilagenom er meget bevaret under udvikling, men generelt meget mindre med mindre gen dobbeltarbejde og metaboliske kompleksitet, hvilket gør den ideel til at forstå de grundlæggende mekanismer, der er impliceret i mange menneskelige sygdomme4 , 7 , 8. også karakteristiske processer udføres af fedtvæv, tarmen og bugspytkirtlen er repræsenteret i flue og mægle myndighedsopgaver i glukose og lipid metabolisme, for eksempel, der ligner for mennesker9, 10,11. Desuden, den grundlæggende molekylære veje involveret i bekæmpelse af overvægt, insulinresistens og diabetes i mennesker er funktionelt bevaret i Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. som højere organismer, Drosophila har et bankende hjerte, der er dannet under udvikling af lignende processer som pattedyr hjerte3,17. Således er udviklingen af en pålidelig HFD fodring protokol og høj overførselshastighed TAG assay, tilpasset til effektiv screening formål ved hjælp af boksen genetiske værktøj i Drosophila, give et vigtigt middel til at studere og forstå de grundlæggende genetiske grundlag underliggende komplekse metaboliske sygdomme.
HFD fødevarer i sig selv er lavet af en standard laboratorium flyve mad suppleret med kokosolie, som er sammensat primært af mættede fedtsyrer kendt for at være forbundet med metabolisk syndrom18. Mens inducerende fedme i pattedyr modeller, såsom gnavere, kan tage måneder19,20, øger vores optimeret HFD fodring protokol i Drosophila , effektivt og reproducerbar kropsligt fedtindhold i løbet af dage12,14. Denne protokol, tillader i forbindelse med en høj overførselshastighed TAG assay, effektiv masse screening for virkningerne af genetiske faktorer, miljømæssige påvirkninger og lægemiddelkandidater til at opdage nye modulatorer af fedtstofskiftet. Derfor, disse protokoller er sandsynligvis relevant at forstå og/eller bekæmpe overvægt og fedme-associerede menneskelige patologier.
Fodring protokollen er alsidig og kan anvendes til at studere de metaboliske og funktionelle virkninger af enkelt mættet eller umættet fedtsyre. Brugen af denne høje overførselshastighed TAG assay er ikke begrænset til D. melanogaster, men kan tilpasses til en lang række små modelorganismer med neglebånd eller hård ekstracellulære matricer (f.eks., andre Drosophila arter, C. elegans og andre nye hvirvelløse modelorganismer) til at måle fedt indhold under forskellige miljømæssige, genetiske eller fysiologiske forhold, på ethvert stadium af udviklingen, voksenalderen eller fase af metabolisk sygdom. TAG analysen er baseret på en kolorimetrisk måling af en serie af enzymatiske reaktioner, der nedbrydes TAGs til frie fedtsyrer, glycerol, Glycerol-3-fosfat og endelig H2O2 , der reagerer med 4-aminoantipyrine (4-AAP) og 3,5- dichlor-2-hydroxybenzen sulfonat (3,5 DHBS) til at producere en rød farvet produkt, der måles ved hjælp af Spektrofotometer 96-brønd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HFD fodring protokol
tabel 1. Flyve mad opskrift.
Denne tabel opsummerer de forskellige ingredienser, der anvendes til at forberede vores kontrol mad. Når gjort, 10 mL af fødevaren hældes i hætteglas, afkøles og opbevares ved 4 ° C for langtidsopbevaring.
- HFD forberedelse
- for at gøre 1 kg af højt fedtindhold fødevarer, vejer 700 g af præ-made normal flyve mad (Se tabel 1) og 300 g af kokosolie i to separate beholdere ved hjælp af en Analysevægt.
- Varme hver beholder individuelt i mikrobølgeovnen, indtil indholdet smelter helt. Hæld kokosolie i objektbeholderen flyve mad. Rør ved hjælp af et piskeris, indtil olien er godt blandet ind i den flyve mad.
Bemærk: Ingen bidder af mad eller olie skal være synlige. Når den flyve mad smelter i mikrobølgeovn, stop med intervaller på 1 min. at blande maden og forhindre kogning. - Re vejer den høje fede mad. Hvis den samlede vægt er mindre end 1 kg (700 g mad + 300 g af kokosolie), tilsæt vand (ca. 10 mL) som kompensation for fordampning under opvarmning og til at bringe tilbage vægten 1 kg.
- Hæld ca. 10 mL godt blandet høj fedt mad pr. hætteglas (ca. 25% af hætteglasset volumen). Næste, dække med ostelærred at forhindre fluer ' forurening. Cool i 1 time ved stuetemperatur og derefter overføre hætteglas til 4 ° C for opbevaring af op til 4 uger.
Bemærk: Den normale fødevarer (NF) bruges som en kontrol mad. Også hældes 10 mL (ca. 25% af hætteglasset volumen) af NF pr. hætteglas. HFD mad, erstatte 30% af NF mad med kokosolie. For kontrol og forsøgsbetingelser, fluer blev givet den samme mængde af NF og HFD (10 mL af mad pr. hætteglas).
fig. 1 . HFD fodring i Drosophila.
Ordningen viser de forskellige fodring trin for fluer på en kontrol mad (normal kost uden tilsætning af kokosolie-NF) eller HFD (med tilføjelse af kokosolie). Hele processen tager 10 dage efter den oprindelige samling af voksne fluer. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- HFD fodring af D. melanogaster
Bemærk: denne protokol omfatter kontrol mad og HFD fodring procedurer, der er kompatibel med enhver fluelinen. Kontrol og eksperimentelle fluer er sat i hætteglas indeholdende den samme mængde mad (NF eller HFD).- Brug CO 2 til bedøver fluerne.
Bemærk: For Nyomvendte, venligst læs reference 21 en oversigt på at hæve og håndtering D. melanogaster. - Indsamle 0-5 dag gamle fluer fra hætteglas og overførsel (af flipping) flyver ind i nye hætteglas indeholdende NF (tidligere varmede ved stuetemperatur). Lad fluerne alder 5 ekstra dage på 21 ° C.
- i slutningen af 5 dagene, tage ud i hætteglas indeholdende HFD og NF fra 4 ° C.
Bemærk: som kolde temperaturer kan understrege levende fluer, lad hætteglassene sidde i 30 min. ved stuetemperatur til at varme op før brug. - Ved hjælp af klude, rense og fjerne overskydende væske fra siderne af hætteglassene.
- Indsætte et lille stykke filtrerpapir, omkring 1 cm x 3 cm, høj fedt fødevarer til at absorbere overskydende væske.
Bemærk: Dette trin er kritisk for at forhindre fluerne klistrer til HFD mad. - Dernæst overføre fluer på den høje fede mad (ved flipping). Lægge hætteglas vandret på deres side, (ikke stående) på 21-22 ° C i 5 dage.
Bemærk: Undgå højere temperaturer som dette kan delvis smelte det høje fedt mad, forårsager fluer at holde sig til mad og dø. - Efter 5 dage, overføre (ved flipping) fluer fra NF og HFD i nye hætteglas uden mad at tillade deres indvolde til tom for 30 min. Dernæst videre til vejning fluerne.
Bemærk: Et af de afgørende skridt i denne HFD fodring protokol er at forberede et godt blandet HFD, fri for nogen lunser af flyve mad eller kondenseret olie. Homogen blanding og køling HFD til 45-30 ° C er tilrådeligt, før hælde i glassene og opbevaring af mad på 4 ° C. korrekt alder matching af kontrol og eksperimentelle fluer er vigtig samt kontrollerede ernæringsmæssige og miljømæssige betingelser forud HFD fodring. Under fodring fase, skal kontrol og eksperimentelle fluer have den samme mængde af NF og HFD. Aldrig indsamle fluer fra overfyldte hætteglas eller flasker (for at undgå transgenerationel effekter). Altid sætte et maksimum på 25 fluer per vial under NF og HFD fodring for at undgå kosten restriktioner eller andre crowding effekter. HFD består af 30% kokosolie, således temperaturer over 22 ° C kan delvis smelte HFD, forårsager fluer til at holde på fedtet mad og dø. Inden du sætter fluer på HFD, rense hætteglas for at fjerne enhver resterende olie og indsætte et filtrerpapir for at absorbere eventuelle overskydende væske i maden. Under inkubation af fluer på HFD, af hætteglas er lagt på deres sider at give en fedt-fri vandret overflade for fluer.
- Brug CO 2 til bedøver fluerne.
- Vejer fluer
- For hver genotype og køn skal testes, bruge en ultra-følsomme skala til registrering vægtene forud mærket, Tom 1,7 mL rør.
- Ved hjælp af flyve bedøvelse eller CO 2, bedøver og indsamler 36 fluer af den samme genotype, køn, og fodring status med en pensel i en pre vejes 1,7 mL tube.
- Vejer rør indeholdende fluer med den samme ultra-følsomme skala.
- Bestemmer den gennemsnitlige flyve vægt efter denne formel:
NOTE: antallet af fluer i denne protokol er 36. - Flash fryse 1,7 mL rør indeholdende fluer af kaster i flydende kvælstof i 2 min. indsamle og sætte rørene i kasser. Dernæst overføre boksene til-80 ° C (at foretrække temperatur) til opbevaring indtil brug TAG assay.
FORSIGTIGHED: Flydende nitrogen er en meget lav temperatur. Skal du bruge relevante personlige beskyttelsesudstyr.
2. TAG Assay
- forberedelse af TAG standard koncentrationer
- forberede 500 mL af PBT (PBS 1 X, 0,05% Triton).
- Brug af 0,5 mL rør og TAG løsning (Table of Materials), forberede 100 µL af blank (PBT) og 100 µL af seks standard TAG koncentrationer (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) med PBT.
- Sted rør på is og gå videre med slibning fluerne.
- Slibning fluer
- tage ud de frosne fluer fra-80 ° C (trin 1.3). Overføre de rør, der indeholder fluer på ice.
- Første sted 2 mm metal slibning bolde til en 96-brønd bolden dispenser, bruge en lille pensel til at fjerne ekstra bolde.
- Sted 96-godt slibe plade op og ned på toppen af bolden dispenser og flip at overføre metalkugler direkte til slibning pladen. Der bør være én bold pr. brønd.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, tilføje 600 µL af PBT i hver række i 96-brønd slibning plade.
- Med pincet, tilføje 3 flyver pr. brønd. Angive betingelsen genotype, køn og mad af fluer i hver række/brønd af 96-brønd slibning plade.
- Tæt placere hætter på 96-brønd slibning pladen. Båndet kan placeres på toppen til at sikre, at der ikke forekommer udsivning.
- Ordentligt sted 96-brønd slibning plader i den slibning maskine. Indstille maskinen til den højeste hastighed og tryk " køre " at male fluer i 3 min.
- Efter 3 min, stoppe den slibning og fortsætte med plade centrifugering: centrifuge for 15 min på 4.000 x g, 4 ° C. Efter centrifugering, administrere slibning pladen omhyggeligt for at undgå at blande supernatanten med pellet.
- Prøve lastning og TAG indhold bestemmelse
- tage en ny 96-brønd Spektrofotometer plade. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, indlæse 200 µL TAG reagens i hver række af plade.
- Belastning 20 µL af PBT i den første brønd i den første række, at oprette en tom. Mix af pipettering op og ned. Undgå at danne bobler.
- Belastning 20 µL af hver standard fortynding (fra trin 2.1.2) i de resterende brønde i første række og mix af pipettering op og ned. Undgå at danne bobler.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 20 µL af supernatanten fra hver række af slibning pladen til den tilsvarende række i 96-brønd Spektrofotometer plade. Pipetteres op og ned for at blande godt. Undgå at danne bobler.
- Placer et gas-gennemtrængelige folie over toppen af 96-brønd plade.
- Ruger plade ved 37 ° C i 10 min.
Bemærk: Hvis der er bobler i brøndene, centrifugeres plade for 2 min på 2.000 x g at fjerne alle bobler. Tilstedeværelsen af bobler vil interferere med absorbans læsning. - Læse absorbans på hvert hul i pladen på 550 nm ved hjælp af en kompatibel mikrotiterplade læser. Næste, spore standardkurven og bestemmelse af koncentration [µg/µL] af ukendte prøver.
- Til at bestemme mængden af TAG indhold pr. gennemsnitlige flyve vægt, bruger følgende formel:
NOTE: I denne protokol, 3 fluer blev hakket i 600 µL af PBT, derfor den gennemsnitlige volumen per fly er 200 µL.
- Bradford assay og normalisering af TAG indhold med proteinindhold
- Forbered syv 100 µL af bovint serumalbumin (BSA) standard fortyndinger (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL og 200 µg/mL, 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1000 µg/mL) med PBT.
- Tager en ny 96-brønd plade og indlæse 200 µL 1 X Bradford reagens i hver række af plade.
- i de første godt for den første række, tilføje 10 µL af PBT til at oprette en tom. Mix af pipettering op og ned. Undgå at danne bobler.
- Tilføje 10 µL af hver standard fortynding i de resterende brønde i første række og mix af pipettering op og ned. Undgå at danne bobler.
- Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 10 µL af flue supernatanten fra hver række af slibning pladen ind i den tilsvarende række i 96-brønd plade. Pipetteres op og ned for at blande godt. Undgå at danne bobler.
- Placer et gas-gennemtrængelige folie over toppen af 96-brønd plade.
- Ruger plade ved stuetemperatur i 5 min. Hvis der er bobler i brøndene, centrifugeres plade for 2 min på 2.000 x g fjerne dem.
Bemærk: Tilstedeværelsen af bobler vil interferere med absorbans læsning. - Brug et spektrofotometer til læse absorbans af tom, standarder og ukendte prøver på 595 nm. Bruger standardkurven til at bestemme koncentrationer [µg/µL] af prøverne i hver række.
- Normalisere TAG indhold med protein niveau ved hjælp af følgende formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I D. melanogaster, som er tilfældet med andre arter, er der seksuel dimorphism mellem hanner og hunner22. Det er velkendt, at hunnen er større, med mere fedt i deres underliv, end mænd22. For at teste effektiviteten af vores protokol, udførte vi TAG assays for at finde ud af forskellene i TAG indholdet mellem hanner og hunner af standard laboratorium vildtype (w1118) flyver. Dataene viser, at kvinder har flere hele kroppen fedt end deres mandlige modstykker (figur 2A, B). Data viste også, at analysen er stabil, med ingen variation i TAG kvantificering over tid (op til 50 min. efter inkubation) og ingen variation afhængig af biologiske stikprøvestørrelse (3 eller 5 fluer).
HFD forbrug har vist sig at forårsage fedme hos mennesker og mus19,20,23. For at teste effektiviteten af vores fodring protokol, udførte vi TAG assays med vores HFD og kontrol fodret kvindelige fluer. Vi fandt, at forbruget af HFD i Drosophila forårsager øget fedtindhold, der gradvis akkumuleres over tid (fig. 3A-C). Et andet vigtigt resultat er, at efter kun 18 h af HFD fodring (figur 3C), vi var i stand til at fremkalde en væsentlig forøgelse af fedtindholdet i disse fluer. Disse resultater tyder på, at denne genetiske modelsystem er et ideelt værktøj for accelereret forskning i at finde nye regulatorer af HFD-induceret fedme.
Figur 2 . TAG-undersøgelser i mandlige og kvindelige fluer.
2 - uger gamle fluer på en normal kost blev indsamlet, grupperet efter sex (hanner og hunner), vejes og jorden op (3 eller 5 fluer pr. brønd) for TAG analyse. TAG assays blev udført efter de procedurer, der er beskrevet i denne hvidbog. Absorbansen af hver prøve på 550 nm blev læst på forskellige tidspunkter (0 min, 5 min, 20 min og 50 min) til at bestemme eventuelle udsving i TAG kvantificering over tid, fedt indhold variation i forskellige befolkning størrelser (3 og 5 fluer) af w1118 fluer, og forskelle mellem mandlige og kvindelige kodeindhold. Resultaterne viste, at hunnerne ophobes mere fedt end deres mandlige modstykker (A-B), TAG målinger ikke svinger med op til 50 min. efter reaktion inkubation ved 37 ° C (A-B). Også, gennemsnitlige TAG niveauer forbliver uændret mellem TAG assays bruger 3 eller 5 fluer (A-B). Dataene præsenteres som gennemsnit ± SEM. statistikker: ingen signifikant forskel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Virkningerne af HFD på fedtophobning.
A-B: 2 - uger gamle kvindelige fluer rejst på en normal eller HFD i 5 dage blev indsamlet og TAG assays blev udført for at bestemme niveauet af fedt. TAG indholdet var normaliseret enten med vægt (A) eller protein niveauer (B). Data viste, at HFD forbrug fører til øget fedtindhold med begge metoder til normalisering. C: 2 - uger gamle kvindelige fluer på normal/kontrol mad (NF) og 18 h, 1 eller 2 dage på HFD er analyseret for TAG indhold. Resultaterne viser en betydelig og progressiv stigning af TAG niveauer fra 18 h til 2 dage efter eksponering for HFD. Dataene præsenteres som gennemsnit ± SEM. statistik: student t-test. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fedme induktion i mus kan tage måneder19,20. I fluer tillader denne HFD fodring protokol for induktion af overskydende fedt ophobning i løbet af dage eller mindre, forårsager en stigning i fedtophobning kun efter 18 h (Se figur 2). HFD fodring med den beskrevne protokol øger glukose indhold 12 og mindsker Bmm lipase og PGC-1 udtryk24. Dette er i modsætning til fastende af voksen Drosophila , der forårsager en hurtig nedgang i både fedt og glukose indholdet25,26 og øget Bmm udtryk24. Også, Højdeindstillelige Bmm eller PGC-1 niveauer beskytter mod HFD-induceret fedme14,24. Mens 30% HFD har været anvendt i denne protokol, fodring fluer med 3%, 7% eller 15% fedt kost induceret fedme i en dosisafhængig mode12, som gør øge varigheden af HFD fodring (figur 3). Vi fandt også, at fodring enkelt fedtsyrer hovedkomponenter af kokosolie, dvs., 14% laurinsyre eller 5% myristinsyre, årsager betydeligt forhøjet fedt ophobning12.
Den fremskyndede metaboliske respons med disse fluer på en HFD regime er korreleret med en reduceret levetid27 som observeret i pattedyr28, men > 80% af fluerne overleve forbi 20 dage på HFD27. Hurtig induktion af fedt ophobning medieret af bevarede cellulære og molekylære processer, der kontrollerer lipid og glukose stofskifte er en fordel for mange fedme-relaterede studier, såsom diabetes eller lipotoxic kardiomyopati10, 12,13,14,15,16. Hovedresultaterne i konsekvenserne af metabolisk uligevægt og relaterede hjerte dysfunktioner vil sandsynligvis tillade sammenlignende translationel undersøgelser hos mennesker.
HFD fodring protokol er kompatibel til brug med andre Drosophila arter og insekter modeller, der deler samme kost med D. melanogaster. Denne HFD fodring protokoller kunne tilpasses hensigtsmæssigt for organisme som C. elegans eller også andre insekter, der kræver forskellige 'normale' mad medier. 30% HFD ikke er egnet til brug i eksperimenter der kræver høje temperaturer; reducerede koncentrationer af kokosolie eller enkelt fedtsyrer kunne dog passende alternativer12.
Denne TAG protokol er baseret på PBS, en ikke-giftig buffer, der tillader nem håndtering og eksperimenter uden et stinkskab, i modsætning til tidligere brugt organiske opløsningsmidler (methanol/chloroform eller diethylether) i lipid udvinding og kvantificering15 , 29 , 30. en anden fordel ved denne buffer er, at det kan normalisere TAG niveauer til protein indhold baseret på de samme indledende homogenatet, gør den fedt fastlæggelsen i små vævsprøver let opnåelige og tilbyder nye muligheder for at studere orgel Cross-talk i kropsligt metaboliske homøostase. Også, de samme indledende flyve homogenatet fremstillet efter slibning, kan bruges til at udføre parallel glukose og glykogen assays, tillader undersøgelse af ændringer i både lipid og glukose metabolismen fra de samme biologiske prøver. Denne TAG protokol er mindre besværligt eller tidskrævende end tidligere protokoller15,29,30, og er temmelig høj overførselshastighed, ved hjælp af en 96-brønds format, der giver mulighed for hurtig test af tæt på 100 prøver inden for en time. Denne protokol kan også bruges til at kvantificere fedtindhold under andre kosten betingelser, herunder høje sukker kost13,31, kosten restriktioner og sult, samt for ældning undersøgelser at forstå alder-associerede ændringer i fedtstofskiftet.
Overvægt, metabolisk syndrom og relaterede patologier er på et all-time high med katastrofale konsekvenser for menneskers sundhed1,2. Den kombinerede HFD protokol og den høje overførselshastighed TAG assay tilbyder en unik platform for at anvende modelorganismer såsom Drosophila, hurtigt fremkalde fedme og skærmen for genetiske faktorer, eller naturlige og syntetiske kemiske forbindelser, for bedre at forstå metabolisk ubalance. I sidste ende dette kan i høj grad bidrage til fremme af videnskabelige opdagelser til at udvikle nye behandlinger eller helbredelsesmetoder for metaboliske sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Erika Taylor til redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 og R01 HL054732) at R.B., en Postdoktoral forskning supplement (R01 HL085481) og fællesskab (AAUW) til S.B.D. og tilskud fra American Heart Association til S.B.D. og R.T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
