Summary
Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.
Abstract
Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.
Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.
Introduction
Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.
O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.
O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.
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Protocol
1. HFD alimentação protocolo
tabela 1. Receita de comida de mosca.
Esta tabela resume os diferentes ingredientes usados para preparar nosso controle alimentar. Uma vez feita, 10 mL do alimento é vertido em frascos, refrigerado e estocado a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Preparação HFD
- para fazer 1 kg de alimento gordo alto, pesa 700 g de comida de mosca normal pre-feita (ver tabela 1) e 300 g de óleo de coco em dois recipientes separados usando uma balança analítica.
- Calor cada recipiente individualmente no microondas, até que o conteúdo derrete completamente. Despeje o óleo de coco o recipiente de alimento de voar. Mexa com um batedor até que o óleo é bem misturado a comida da mosca.
Nota: Não há pedaços de comida ou óleo devem ser visíveis. Quando a comida de mosca está derretendo no microondas, parar em intervalos de 1 minuto para misturar os alimentos e evitar ferver. - Re-pesar o alimento de gordura alto. Se o peso total é inferior a 1 kg (700 g de comida + 300 g de óleo de coco), adicionar água (cerca de 10 mL) para compensar a evaporação durante o aquecimento e para trazer de volta o peso de 1 kg...
- Pour cerca de 10 mL bem misturado alta gordura comida por frasco (cerca de 25% do volume do frasco). Em seguida, cubra com gaze para evitar moscas ' contaminação. Deixe esfriar por 1h à temperatura ambiente, em seguida, transferir os frascos a 4 ° C para armazenamento acima de 4 semanas.
Nota: A comida Normal (NF) é usada como um alimento de controle. Também despeje 10 mL (cerca de 25% do volume do frasco) de NF por frasco. Para a comida HFD, substitua 30% da comida NF com óleo de coco. Para controle e condições experimentais, as moscas receberam a mesma quantidade de NF e HFD (10ml de comida por frasco).
Figura 1 . HFD alimentação em Drosophila.
O esquema mostra as diferentes etapas de alimentação para as moscas em um alimento de controle (dieta normal sem adição de óleo de coco-NF) ou HFD (com a adição de óleo de coco). O processo todo leva 10 dias após a coleta inicial de moscas adultas. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- HFD alimentação de d. melanogaster
Nota: Este protocolo inclui controle alimentar e HFD alimentando os procedimentos que são compatíveis com qualquer linha de voar. Controle e experimentais moscas são colocadas em frascos contendo a mesma comida de quantidade (NF ou HFD).- Uso de CO 2 para anestesiar moscas.
Nota: Para os neófitos, por favor leia referência 21 para uma visão geral sobre criação e manipulação de d. melanogaster. - Recolher 0-5 moscas dia velho de frascos e transferência (lançando) as moscas em novos frascos contendo NF (previamente aquecido à temperatura ambiente). Deixe a idade de moscas por 5 dias adicionais no 21 ° C.
- No final dos 5 dias, retire os frascos que contêm HFD e NF de 4 ° C.
Nota: como temperaturas frias podem salientar vivos moscas, deixe os frascos descansar por 30 min à temperatura ambiente para se aquecer antes de usar. - Usando lenços, limpar e remover o excesso de líquido dos lados dos frascos.
- Inserir um pequeno pedaço de papel de filtro, sobre 1 cm x 3 cm, a comida da alta gorda para absorver todo o líquido excedente.
Nota: Este passo é essencial para prevenir as moscas de degola para a comida HFD. - Em seguida, transferir as moscas sobre os alimentos de alta gordura (lançando). Colocar os frascos horizontalmente do lado deles, (não permanente) em 21-22 ° C durante 5 dias.
Nota: Evite temperaturas mais altas, como isto pode parcialmente derreter a comida gorda alta, fazendo com que as moscas manter os alimentos e morrer. - Depois de 5 dias, transferir (lançando) as moscas de NF e HFD dentro dos frascos de novos sem comida para permitir que a sua coragem de vazio durante 30 min. Em seguida, proceder à pesagem moscas.
Nota: Uma das etapas críticas neste HFD protocolo de alimentação é preparar um HFD bem misturado, livre de quaisquer pedaços de comida de mosca ou óleo condensado. Mistura homogênea e refrigerar o HFD 45-30 ° c é aconselhável, antes de derramar dentro dos frascos e armazenar os alimentos na idade adequada de 4 ° C. correspondência de controle e experimentais moscas é importante, assim como prior de condições nutricionais e ambientais controladas para a alimentação de HFD. Durante a fase de alimentação, controle e experimentais moscas devem ser dada a mesma quantidade de NF e HFD. Nunca colete moscas de superlotadas frascos ou garrafas (para evitar efeitos de transgeracional). Sempre coloque um máximo de 25 moscas por frasco durante NF e HFD alimentação para evitar restrição dietética ou outros efeitos crowding. O HFD é composto de 30% de óleo de coco, assim, temperaturas acima de 22 ° C parcialmente podem derreter o HFD, fazendo com que as moscas enfiar a comida oleosa e morrer. Antes de colocar as moscas o HFD, limpe os frascos para remover qualquer resíduo de óleo e inserir um filtro de papel para absorver qualquer excesso de líquido no alimento. Durante a incubação das moscas em HFD, os frascos são colocados em seus lados para fornecer uma superfície horizontal sem gordura para as moscas.
- Uso de CO 2 para anestesiar moscas.
- Pesando as moscas
- para cada genótipo e gênero a ser testado, usar uma escala ultra sensível para registrar os pesos de tubos de vazio, previamente rotulado 1,7 mL.
- Usando anestésico voar ou CO 2, anestesiar e recolher 36 moscas com o mesmo genótipo, sexo, e alimentar o status com um pincel em um pre-pesava 1.7 tubo mL.
- Pesa o tubo contendo moscas com a mesma escala ultra-sensíveis.
- Determinar o peso médio de voar esta fórmula a seguir:
Nota: O número de moscas neste protocolo é 36. - Flash congela os tubos de 1,7 mL contendo moscas por mergulhar no nitrogênio líquido por 2 min. coletar e colocar os tubos em caixas. Em seguida, transferir as caixas a-80 ° C (temperatura preferível) para o armazenamento até o uso com o ensaio de TAG.
Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa. Por favor, use equipamento de proteção pessoal apropriado.
2. TAG ensaio
- preparação das concentrações padrão TAG
- preparar 500 mL de PBT (PBS 1x, 0.05% Triton).
- Usando tubos de 0,5 mL e a solução de TAG (Tabela de materiais), preparam-se 100 µ l de espaço em branco (apenas PBT) e 100 µ l de seis concentrações de TAG padrão (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0,125 µ g / µ l; 0.0625 µ g / µ l) com o PBT.
- Coloque os tubos no gelo e prosseguir com as moscas de moedura.
- Moagem as moscas
- tirar as moscas congeladas de-80 ° C (etapa 1.3). Transferir os tubos contendo as moscas no gelo
- Primeiro, coloque o metal de 2 milímetros, bolas de moagem em um dispensador de bola 96 poços, use um pincel pequeno para remover bolas extras. Placa de
- lugar da moagem de 96 poços de cabeça para baixo em cima do dispensador de bola e flip transferir as bolas de metal directamente para a placa de moedura. Deve haver uma bola por alvéolo.
- Usando uma pipeta multicanal, adicionar 600 µ l de PBT em cada linha da placa de 96 poços moedura.
- Com fórceps, adicionar 3 voa por bem. Indicar a condição de genótipo, sexo e comida das moscas em cada linha/poço da placa de 96 poços moedura.
- Firmemente Coloque as tampas para a placa de moedura de 96 poços. Fita pode ser colocada na parte superior para assegurar que não há nenhum escapamento.
- , Corretamente, colocar as placas de 96 poços moagem para a máquina de moer. Ajuste a máquina para a velocidade mais alta e pressione " executar " para moer as moscas por 3 min.
- Após 3 min, parar a moagem e proceder com centrifugação de placa: centrifuGE para 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Após a centrifugação, gerenciar a placa de moedura cuidadosamente para evitar misturar o sobrenadante com a pelota.
- Carregamento de amostra e determinação de conteúdo de TAG
- tomar uma nova placa de 96 poços Espectrofotômetro. Usando uma pipeta multicanal, carregar 200 µ l de reagente a TAG em cada linha da placa.
- Carga 20 µ l de PBT dentro do primeiro poço da primeira linha, para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas. Poços de
- carga 20 µ l de cada diluição padrão (da etapa 2.1.2) para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.
- Usando uma pipeta multicanal, transferência de 20 µ l do sobrenadante de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços Espectrofotômetro. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.
- Em seguida, coloque uma folha de gás-permeável sobre a parte superior da placa de 96 poços.
- Incubar a placa a 37 ° C durante 10 min.
Nota: Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para remover todas as bolhas. A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância. - Leia a absorvância de cada poço da placa em 550 nm, utilizando um leitor de microplacas compatível. Em seguida, traçar a curva-padrão e determinar a concentração [µ g / µ l] das amostras desconhecidas.
- Para determinar a quantidade de conteúdo da marca por médio peso mosca, use a seguinte fórmula:
Nota: neste protocolo, 3 moscas foram picadas em 600 µ l de PBT; em consequência, o volume médio por mosca é 200 µ l.
- Ensaio de Bradford e normalização de conteúdo da marca com conteúdo de proteína
- preparar sete 100 µ l de albumina de soro bovino (BSA) padrão diluições (75 µ g/mL; 100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) com o PBT.
- Tomar uma nova placa de 96 poços e carregar 200 µ l de reagente de Bradford X 1 em cada linha da placa.
- No primeiro bem de primeira linha, adicionar 10 µ l de PBT para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas. Poços de
- Adicionar 10 µ l de cada diluição padrão para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.
- Usando uma pipeta multicanal, transferir 10 µ l do sobrenadante a mosca de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.
- Colocar uma película permeável ao gás por cima da placa de 96 poços.
- Incube a placa na temperatura de quarto por 5 min. Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para removê-los.
Nota: A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância. - Uso de um espectrofotômetro para ler a absorbância do branco, padrões e amostras desconhecidas em 595 nm. Use a curva padrão para determinar as concentrações [µ g / µ l] das amostras em cada linha.
- Normalizar a TAG conteúda com nível de proteína usando a seguinte fórmula:
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Representative Results
No d. melanogaster, como é o caso com outras espécies, existe dimorfismo sexual entre machos e fêmeas,22. É sabido que as fêmeas são maiores, com mais gordura em seus abdomens, do que os machos22. Para testar a eficácia do nosso protocolo, realizamos ensaios de TAG para determinar as diferenças de conteúdo da marca entre machos e fêmeas de sua padrão de laboratório (w1118) voa. Os dados mostram que as fêmeas têm mais gordura de corpo inteiro do que suas contrapartes masculinas (Figura 2A, B). Os dados também mostraram que o ensaio é estável, sem variação de quantificação de TAG ao longo do tempo (até 50 min. após a incubação) e não há variação dependendo do tamanho da amostra biológica (3 ou 5 moscas).
Consumo de HFD foi mostrado para causar obesidade em humanos e rato19,20,23. Para testar a eficácia do nosso protocolo de alimentação, realizamos ensaios de TAG com nosso HFD e controle alimentados moscas femininas. Nós achamos que o consumo de HFD em Drosophila causa maior teor de gordura que acumula-se progressivamente ao longo do tempo (Figura 3A-C). Outro importante encontrar é que depois de apenas 18 h de HFD alimentação (Figura 3C), fomos capazes de induzir um aumento significativo do teor de matéria gorda nessas moscas. Estes achados sugerem que este sistema de modelo genético é uma ferramenta ideal para pesquisa acelerada em encontrar novos reguladores da obesidade HFD-induzida.
Figura 2 . Ensaios de TAG em moscas machos e fêmeas.
2 - semana velhas moscas em uma dieta normal foram coletadas, agrupadas por sexo (machos e fêmeas), pesava e moídas (3 ou 5 moscas por bem) para análise de TAG. TAG ensaios foram realizados seguindo os procedimentos descritos neste artigo. A absorvância de cada amostra em 550 nm foi lido em diferentes pontos de tempo (0 min, 5 min, 20 min e 50 min) para determinar eventuais flutuações na quantificação do TAG ao longo do tempo, gorda conteúda variação de tamanhos diferentes da população (3 e 5 moscas) w1118 moscas e as diferenças entre masculino e feminino conteúdo de TAG. Os resultados mostraram que as fêmeas acumulam mais gordura do que suas contrapartes masculinas (A–B), medições de TAG não flutua até 50 min. após a incubação de reação a 37 ° C (A–B). Além disso, a média níveis TAG permanecem inalterados entre TAG ensaios usando moscas 3 ou 5 (A–B). Os dados são apresentados como média ± SEM. estatísticas: nenhuma diferença significativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Efeitos de HFD na acumulação de gordura.
A-b: 2 - semana de idade fêmeas moscas geradas em um normal ou HFD durante 5 dias foram coletadas e os TAG ensaios foram realizados para determinar os níveis de gordura. Conteúdo da marca foi normalizado com peso (A) ou (B) os níveis de proteína. Os dados mostraram que o consumo HFD leva a aumento de gordura com ambos os métodos de normalização. C: 2 - semana de idade fêmeas moscas na comida normal/controle (NF) e 18 h, 1 dia ou 2 dias na HFD são doseadas para conteúdo da marca. Os resultados mostram um aumento significativo e progressivo dos níveis de TAG de 18 h-2 dias de exposição ao HFD. Os dados são apresentados como média ± SEM. estatística: teste t de student. * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está em contraste com o jejum de adultos drosófila que provoca uma rápida diminuição em gordura e glicose conteúdo25,26 e aumento de expressão de Bmm 24. Além disso, elevar os níveis de Bmm ou PGC-1 protege contra obesidade induzida por HFD14,24. Enquanto 30% HFD tem sido utilizado no presente protocolo, alimentando moscas com 3%, 7% ou 15% de gordura dieta obesidade induzida em uma dose-dependente da moda12, como faz aumentar a duração da HFD alimentação (Figura 3). Também achamos que alimentação único ácidos graxos dos principais componentes do óleo de coco, ou seja, o ácido láurico 14% ou 5% de ácido mirístico, causas significativamente elevados de acúmulo de gordura12.
A resposta metabólica acelerada com estas moscas num regime de HFD está correlacionada com uma expectativa de vida reduzida27 , como observado em mamíferos28, mas > 80% das moscas sobreviver passado 20 dias em HFD27. A indução rápida de acúmulo de gordura mediada por processos celulares e moleculares conservados, controlando lipídico e o metabolismo da glicose é vantajoso para muitos estudos de obesidade, como diabetes ou lipotoxic cardiomiopatia10, 12,13,14,15,16. As principais conclusões nas consequências dos desequilíbrios metabólicos e disfunções cardíacas relacionadas provavelmente permitirá estudos comparativos translacionais em seres humanos.
O HFD protocolo de alimentação é compatível para uso com outros modelos de espécies e insetos de drosófila que compartilham dietas semelhantes com d. melanogaster. Este HFD protocolos de alimentação poderia ser adequadamente adaptado para o organismo como c. elegans ou também outros insetos que exigem meios diferentes alimentos 'normal'. Os 30% HFD não é adequado para uso em experimentação que exigem altas temperaturas; no entanto, concentrações reduzidas de óleo de coco ou único ácidos graxos podem ser alternativas adequadas12.
Esta TAG protocolo baseia-se na PBS, um buffer de tóxicos que permite fácil manuseio e experimentação sem uma coifa, em contraste com anteriormente utilizados solventes orgânicos (metanol/clorofórmio ou éter dietílico) em lipídios extração e quantificação de15 , 29 , 30. outra vantagem desta reserva é que ele pode normalizar os níveis de TAG para o teor de proteínas baseada a mesma homogenate inicial, tornando a determinação de gordura em pequenas amostras facilmente alcançáveis e oferecendo novas oportunidades para estudar órgão conversas cruzadas-na homeostase metabólica. Além disso, o homogeneizado de voar mesmo inicial obtido após a moagem, pode ser usado para realizar ensaios de glicose e glicogênio paralelos, permitindo o estudo das alterações no metabolismo de lipídios e glicose, das mesmas amostras biológicas. Esta TAG protocolo é menos trabalhoso ou demorado de anteriores protocolos15,29,30e é bastante alto taxa de transferência, usando um formato de 96 poços que permite para testes rápidos de perto de 100 amostras dentro de uma hora. Este protocolo também pode ser usado para quantificar o teor de gordura em outras condições dietéticas, incluindo açúcar alta dieta13,31, a restrição dietética e a fome, bem como para estudos de envelhecimento entender as mudanças associadas a idade no metabolismo da gordura.
Obesidade, síndrome metabólica e patologias relacionadas estão em alta com consequências desastrosas na saúde humana1,2. O protocolo HFD combinado e o alto throughput TAG oferta ensaio uma plataforma única para usar organismos-modelo, tais como a Drosophila, para induzir rapidamente a obesidade e a tela por fatores genéticos, ou compostos químicos naturais e sintéticos, para melhor entender desequilíbrio metabólico. Em última análise, isso pode muito contribuem para o avanço das descobertas científicas para o desenvolvimento de novos tratamentos ou curas para doenças metabólicas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
