Summary
Dit is een hoog vet dieet voeding protocol om zwaarlijvigheid in Drosophila, een model voor begrip fundamentele moleculaire mechanismen betrokken bij lipotoxicity. Het biedt ook een hoge doorvoersnelheid triglyceride assay voor het meten van vet accumulatie in Drosophila en mogelijk andere (insect) modellen onder verschillende voeding, milieu, genetische of fysiologische omstandigheden.
Abstract
Hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak menselijke wereldwijd. Talrijke studies hebben aangetoond sterke verbindingen tussen obesitas en cardiale storing bij de mens, maar meer tools en onderzoeksinspanningen zijn nodig beter het ophelderen van de mechanismen die betrokken zijn. Voor meer dan een eeuw, het genetisch zeer hanteerbare model van Drosophila behulpzaam geweest bij de ontdekking van belangrijke genen en moleculaire trajecten die bleek te sterk over soorten worden behouden. Veel biologische processen en mechanismen van de ziekte zijn functioneel bewaard in de vlieg, zoals ontwikkeling (b.v., lichaam plan, hart), kanker en neurodegeneratieve ziekte. Onlangs, heeft de studie van obesitas en secundaire ziekten, zoals hart-en vaatziekten in modelorganismen, een zeer cruciale rol gespeeld bij de identificatie van belangrijke regelgevende instanties die betrokken zijn bij metabool syndroom bij de mens.
Wij stellen hier, met deze model-organisme als een doeltreffend instrument te induceren van obesitas, dat wil zeggen, buitensporige accumulatie van vet en het ontwikkelen van een efficiënt protocol voor het controleren van vetgehalte in de vorm van TAGs accumulatie. Naast de zeer geconserveerde, maar minder complex genoom heeft de vlieg ook een korte levensduur voor snelle experimenten, gecombineerd met de kosteneffectiviteit. Dit witboek biedt een gedetailleerd protocol voor hoog vet dieet (HFD) voeding in Drosophila voor het opwekken van obesitas en een kwantitatieve analyse van hoge-doorvoer, triglyceride (TAG) voor het meten van de bijbehorende stijging van het vetgehalte, met het oog op het zeer reproduceerbaar zijn en efficiënt voor grootschalig onderzoek voor genetische of chemische. Deze protocollen bieden nieuwe mogelijkheden om efficiënt regulerende mechanismen die betrokken zijn bij obesitas te onderzoeken, evenals een gestandaardiseerd platform te bieden voor Drugsonderzoek van de ontdekking voor snelle testen van het effect van drugkandidaten op de ontwikkeling of preventie van obesitas, diabetes en verwante metabole ziekten.
Introduction
We zijn in een tijd waar obesitas, en de bijbehorende economische lasten, is een wereldwijd probleem1. Twee uit elke drie Amerikanen zijn overgewicht of obesitas met verwante hart pathologieën, de belangrijkste doodsoorzaak in de volwassen bevolking2. Nieuwe efficiënte methoden zijn nodig om de genetische en moleculaire componenten betrokken bij de regulering van metabool syndroom met behulp van modelorganismen adequaat te onderzoeken. Om deze reden kiezen wij de fruitvlieg Drosophila model omdat het de meest elementaire biologische processen met zoogdieren, waaronder muizen en mensen3,4,5,6. Drosophilagenoom is zeer geconserveerde tijdens de evolutie, maar over het algemeen veel kleiner met minder gene duplicatie en metabole complexiteit, waardoor hij ideaal is voor het begrip van de fundamentele mechanismen betrokken bij vele ziekten bij de mens4 , 7 , 8. ook karakteristieke processen uitgevoerd door adipeus weefsel, de darm en pancreas zijn vertegenwoordigd in de vlieg en bemiddelen van regelgevende taken in glucose en lipide metabolisme, bijvoorbeeld, die vergelijkbaar met de mens9, zijn 10,11. Bovendien, de fundamentele moleculaire pathways betrokken bij de bestrijding van zwaarlijvigheid, insulineresistentie en diabetes bij de mens zijn functioneel bewaard in Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. als hogere organismen, Drosophila heeft een kloppend hart die tijdens de ontwikkeling wordt gevormd door soortgelijke processen met die van de zoogdieren hart3,17. Dus, de ontwikkeling van een betrouwbare HFD voeding protocol en hoge doorvoer TAG assay, aangepast voor efficiënte screening doeleinden gebruik van de genetische gereedschapskist van Drosophila, bieden een belangrijk middel te bestuderen en begrijpen van de fundamentele genetische basis onderliggende complexe metabole ziekten.
Het HFD voedsel zelf is gemaakt van een standaard laboratorium vliegen voedsel aangevuld met kokosolie, die meestal uit verzadigde vetzuren bekend bestaat te worden geassocieerd met het metabool syndroom18. Terwijl inducerende obesitas in modellen, zoogdieren, zoals knaagdieren, maanden19,20 duren kan, verhoogt onze geoptimaliseerde HFD voeding protocol in Drosophila effectief en reproducibly organisch vetgehalte in een kwestie van dagen12,14. Dit protocol, kunt in combinatie met een hoge doorvoersnelheid TAG assay, u efficiënt mass screening voor de gevolgen van genetische factoren, milieu-invloeden en drugkandidaten te ontdekken van nieuwe modulatoren van vetstofwisseling. Als gevolg hiervan zijn deze protocollen waarschijnlijk relevant zijn voor het begrijpen en/of bestrijding van obesitas en obesitas-geassocieerde menselijke pathologie.
De voeding protocol is veelzijdig en kan worden toegepast om te bestuderen van de metabole en functionele gevolgen van enkele verzadigde of onverzadigde vetzuur. Het gebruik van deze hoge doorvoer TAG assay is niet beperkt tot D. melanogaster, maar kan worden aangepast aan een verscheidenheid van kleine modelorganismen met Cuticula of taai extracellulaire matrices (b.v., andere soorten Drosophila , C. elegans en andere opkomende ongewervelde modelorganismen) voor het meten van vetgehalte onder verschillende ecologische, genetische of fysiologische omstandigheden, in elk stadium van ontwikkeling, volwassenheid of fase van metabole ziekte. De TAG-bepaling is gebaseerd op een colorimetrische meting van een reeks enzymatische reacties dat degraderen de TAGs in vrije vetzuren, glycerol, Glycerol-3-fosfaat en ten slotte H2O2 die met 4-aminoantipyrine (4-AAP) en 3,5 reageert- dichloorethaan-2-hydroxybenzene sulfonaat (3,5 DHBS) om een rood gekleurde product dat wordt gemeten met een spectrofotometer 96-Wells te produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HFD voeding Protocol
tabel 1. Vliegen eten recept.
Deze tabel bevat een overzicht van de verschillende ingrediënten gebruikt onze controle om voedsel te bereiden. Zodra gemaakt, 10 mL van het levensmiddel wordt gegoten in flesjes, gekoeld en opgeslagen bij 4 ° C voor lange termijn opslag.
- HFD voorbereiding
- om 1 kg vet voedsel, weeg 700 g van pre-en-klare normale vliegen voedsel (Zie tabel 1) en 300 gram kokos olie in twee aparte containers met behulp van een analytische balans.
- Warmte elke container individueel in de magnetron, totdat de inhoud volledig smelten. Giet de kokosolie in de container vliegen voedsel. Roer met een garde totdat de olie goed wordt gemengd in de vliegen voedsel.
Opmerking: Geen brokken voedsel of olie zichtbaar moeten zijn. Wanneer het vliegen voedsel in de magnetron smelt, stoppen met tussenpozen van 1 minuut mengen van het voedsel te voorkomen kokend over. - Wegen opnieuw het hoge vet eten. Als het totale gewicht is minder dan 1 kg (700 g van voedsel + 300 g kokosolie), voeg water (ongeveer 10 mL) ter compensatie van verdamping tijdens verwarming en terug te brengen het gewicht naar 1 kg.
- Pour ongeveer 10 mL goed gemengde hoge vet voedsel per flacon (ongeveer 25% van flacon volume). Vervolgens dek af met kaasdoek om te voorkomen dat vliegen ' besmetting. Gedurende 1 uur bij kamertemperatuur afkoelen dan overdracht van de flesjes tot 4 ° C voor opslag van tot 4 weken.
Opmerking: Het normale eten (NF) wordt gebruikt als een controle-voedsel. Ook giet 10 mL (ongeveer 25% van flacon volume) voor NF per flacon. Voor de HFD voedsel, wordt 30% van de NF-voedsel vervangen door kokosolie. Voor controle en proefomstandigheden, de vliegen werden gegeven evenveel NF en HFD (10 mL voeding per flacon).
Figuur 1 . HFD voederen in Drosophila.
De regeling bevat de diverse voeding stappen om vliegen op een besturingselement levensmiddel (normale voeding zonder toevoeging van kokosolie-NF) of HFD (met de toevoeging van kokosolie). Het hele proces duurt 10 dagen na de eerste collectie van volwassen vliegen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- HFD voederen van D. melanogaster
Opmerking: dit protocol omvat controle voedsel en HFD voederen van procedures die compatibel met een vlieg lijn zijn. Controle en experimentele vliegen komen in flesjes met hetzelfde bedrag voedsel (NF of HFD).- Gebruik CO 2 aan de vliegen anesthetize.
Opmerking: Voor neophytes, lees Raadpleeg 21 voor een overzicht van de verhoging en de behandeling van D. melanogaster. - Verzamelen 0-5 dag oud vliegt vanaf flesjes en – overdracht (door spiegelen) de vliegen in nieuwe flesjes met NF (voorheen opgewarmd bij kamertemperatuur). Laat de leeftijd van de vliegen voor 5 extra dagen bij 21 ° C.
- Aan het eind van de 5 dagen, nemen de flesjes met HFD en NF van 4 ° C.
Opmerking: zoals koude temperaturen kunnen stress leven vliegen, laat de flesjes zitten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te warmen vóór gebruik. - Gebruikend afveegt, reinigen en verwijderen van de overtollige vocht van de zijden van de flesjes.
- Invoegen een klein stukje filtreerpapier, over 1 cm x 3 cm, in de hoge vet voedsel te absorberen alle overtollige vloeistof.
Opmerking: Deze stap is van cruciaal belang voor het voorkomen van de vliegen vastplakken aan het voedsel dat HFD. - Breng vervolgens de vliegen op het hoge vet voedsel (door spiegelen). Leg de flesjes horizontaal aan hun kant, (niet permanent) op 21-22 ° C gedurende 5 dagen.
Opmerking: Vermijd hogere temperaturen zoals dit gedeeltelijk van de hoge vet voedsel smelten kan, waardoor de vliegen te houden aan de voedsel en sterven. - Na 5 dagen, transfer (door spiegelen) de vliegt vanaf NF en HFD in nieuwe flesjes zonder voedsel dat hun lef om leeg voor 30 min. Vervolgens gaat u verder met het gewicht van de vliegen.
Opmerking: Een van de cruciale stappen in deze HFD voeding protocol is te bereiden een goed gemengde HFD, vrij van eventuele brokken vliegen voedsel of verkorte olie. Homogeen mengen en koeling van de HFD tot 45-30 ° C is raadzaam, voordat gieten in flesjes en op te slaan het voedsel op de juiste leeftijd van de 4 ° C. afstemming van controle- en experimentele vliegen is het belangrijk evenals gecontroleerde voedings- en milieu-omstandigheden voorafgaande voor het vervoederen van HFD. Tijdens de voeding fase, moeten controle en experimentele vliegen krijgen hetzelfde bedrag van NF en HFD. Nooit verzamelen vliegen van overvolle flacons of flessen (transgenerationele om effecten te voorkomen). Zet altijd een maximum van 25 vliegen per flacon tijdens NF en HFD voeding om te voorkomen dat dieet beperking of andere omvangrijke effecten. De HFD bestaat uit 30% kokosolie, aldus temperaturen boven de 22 ° C zou gedeeltelijk smelten de HFD, waardoor de vliegen te houden op de olieachtige voedsel en sterven. Reinig de flesjes verwijderen van alle resterende olie en steekt een filtreerpapier te absorberen alle overtollige vocht in het voedsel alvorens het vliegen op de HFD. Tijdens de incubatie van de vliegen op HFD, worden de flesjes op hun zijden ernaar een vetvrij horizontaal oppervlak voor de vliegen gelegd.
- Gebruik CO 2 aan de vliegen anesthetize.
- Met een gewicht van de vliegen
- voor elk genotype en geslacht te beproeven, een ultra gevoelige schaal te gebruiken om de gewichten van vooraf gelabelde, lege 1,7 mL tubes.
- Met vliegen verdoving of CO 2, anesthetize en verzamelen van 36 vliegen met genotype dezelfde, geslacht, en voeding status met een penseel in een vooraf gewogen tube van 1,7 mL.
- Wegen van de buis met vliegen met dezelfde ultra gevoelige schaal.
- Bepalen het gemiddelde vliegen gewicht na deze formule:
Opmerking: het aantal vliegen in dit protocol is 36. - Flash bevriezen de 1,7 mL tubes vliegen bevattende storten in vloeibare stikstof voor 2 min. verzamelen en zet de buizen in vakken. Vervolgens overbrengen in de vakken-80 ° C (voorkeur temperatuur) voor opslag tot gebruik met de TAG-assay.
Let op: Vloeibare stikstof is bij een zeer lage temperatuur. Gebruik de juiste persoonlijke beschermende uitrusting.
2. TAG Assay
- voorbereiding van de TAG standaard concentraties
- bereiden 500 mL PBT (PBS 1 X 0.05% Triton).
- Met 0,5 mL buizen en de TAG-oplossing (Tabel of Materials), bereiden 100 µL van blanco (PBT alleen) en 100 µL van zes standaard TAG concentraties (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) met de PBT.
- Plaatsen van de buizen op ijs en ga verder met het slijpen van de vliegen.
- Slijpen de vliegen
- nemen de bevroren vliegt vanaf-80 ° C (stap 1.3). Overdracht van de buisjes met het vliegen op ice.
- Ten eerste plaats 2 mm metaal slijpen ballen in een bal van de 96-Wells-dispenser, een klein penseel gebruiken voor het verwijderen van extra ballen.
- Plaats het slijpen van de 96-wells-plaat ondersteboven op de top van de bal dispenser en flip over te dragen van de metalen ballen rechtstreeks in de schuurmachine plaat. Er moet één bal per putje.
- Met behulp van een precisiepipet meerkanaals, voeg 600 µL van PBT in elke rij van de schuurmachine 96-wells-plaat.
- Met een tang, voeg 3 vliegt per putje. De voorwaarde van het genotype, geslacht en voedsel van de vliegen in elke rij per putje van de schuurmachine 96-wells-plaat geven.
- Plaats strak de doppen op de schuurmachine 96-wells-plaat. Tape kan worden geplaatst op de top om ervoor te zorgen dat er geen lekkage.
- Plaats goed de schuurmachine 96-wells-platen in de slijpmachine. De machine ingesteld op de hoogste snelheid en druk op " uitvoeren " te slijpen de vliegen voor 3 min.
- Na 3 min, stoppen met het slijpen en ga verder met plaat centrifugeren: centrifuge gedurende 15 minuten bij 4000 x g, 4 ° C. Na het centrifugeren, beheren de schuurmachine plaat zorgvuldig om te voorkomen dat het supernatant mengen met de pellet.
- Monster laden en de bepaling van de inhoud van de TAG
- nemen een nieuwe spectrofotometer 96-wells-plaat. Met behulp van een precisiepipet meerkanaals, 200 µL van het TAG-reagens in elke rij van de plaat geladen.
- Load 20 µL van PBT in het eerste putje van de eerste rij, een leeg maken. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Load 20 µL van elke standaard verdunning (uit stap 2.1.2) in de overige wells van de eerste rij en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Met behulp van een precisiepipet meerkanaals, breng 20 µL van supernatant van elke rij van de schuurmachine plaat naar de overeenkomstige rij in de spectrofotometer 96-wells-plaat. Pipetteer omhoog en omlaag om meng goed. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Vervolgens het plaatsen van een gas-permeabele folie over de bovenkant van de 96-wells-plaat.
- Broeden de plaat bij 37 ° C gedurende 10 minuten
Opmerking: Als er bubbels in de putten, centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 2.000 x g alle bubbels verwijderen. De aanwezigheid van bubbels zal interfereren met de absorptie lezing. - Lees de extinctie van elk putje van de plaat bij 550 nm met behulp van een compatibel microplate-lezer. Vervolgens de standaard curve traceren en bepaal de concentratie [µg/µL] van de onbekende monsters.
- Om te bepalen van de hoeveelheid TAG inhoud per gemiddelde vliegen gewicht, gebruik de volgende formule:
Opmerking: In dit protocol 3 vliegen werden gehakt in 600 µL van PBT; bijgevolg het gemiddelde volume per fly is 200 µL.
- Analyse van Bradford en normalisering van TAG inhoud met eiwitgehalte
- bereiden zeven 100 µL bovien serumalbumine (BSA) standaard verdunningen (75 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1000 µg/mL) met de PBT.
- Nemen een nieuwe 96-wells-plaat en 200 µL van 1 X Bradford reagens in elke rij van de plaat geladen.
- In het eerste putje van de eerste rij, voeg 10 µL van PBT een leeg maken. Meng door pipetteren omhoog en omlaag. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Voeg toe 10 µL van elke standaard verdunning in de overige wells van de eerste rij en meng door pipetteren omhoog en omlaag. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- 10 µL van de vlieg supernatant van elke rij van de schuurmachine plaat met behulp van een precisiepipet meerkanaals, overboeken naar de overeenkomstige rij in de 96-wells-plaat. Pipetteer omhoog en omlaag om meng goed. Vermijden van de vorming van luchtbellen.
- Plaats van een gas-permeabele folie over de bovenkant van de 96-wells-plaat.
- Laat de plaat bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten inwerken. Als er belletjes in de putten, centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 2.000 x g om ze te verwijderen.
Opmerking: De aanwezigheid van bubbels zal interfereren met de absorptie lezing. - Gebruik van een spectrofotometer aan Lees de extinctie van de blanco, normen en onbekende monsters op 595 nm. Gebruik de standaard curve om te bepalen van de concentraties [µg/µL] van de monsters in elke rij.
- Normaliseren de TAG inhoud met eiwit niveau met de volgende formule:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In D. melanogaster, zoals het geval met andere soorten, is er seksueel dimorfisme tussen mannetjes en vrouwtjes22. Het is algemeen bekend dat de vrouwtjes groter, met meer vet in hun buikjes, dan mannetjes22 zijn. Om te testen van de effectiviteit van ons protocol, we uitgevoerd TAG testen om te bepalen van de verschillen in-TAG inhoud tussen mannetjes en vrouwtjes van standaard laboratorium wildtype (w1118) vliegt. Uit de gegevens blijkt dat vrouwen meer hele lichaamsvet dan hun mannelijke tegenhangers (Figuur 2A, B hebben). De gegevens bleek ook dat de bepaling stabiel, met geen variatie in TAG kwantificering na verloop van tijd is (tot 50 min. Na incubatie) en geen variatie afhankelijk van de grootte van de biologische steekproef (3 of 5 vliegen).
HFD consumptie heeft aangetoond dat obesitas in mens en muis19,20,23veroorzaken. Om te testen van de werkzaamheid van onze voeding protocol, we TAG testen met onze HFD en gevoed vrouwelijke vliegen controle uitgevoerd. We vonden dat consumptie van HFD in Drosophila veroorzaakt verhoogde vetgehalte dat geleidelijk zich in de tijd (Figuur 3A-C ophoopt). Een ander belangrijk vinden is dat na slechts 18 h van HFD (Figuur 3C), we konden voor het opwekken van een aanzienlijke stijging van het gehalte aan vetstoffen in deze vliegen te voeden. Deze bevindingen stellen voor dat dit modelsysteem van genetische een ideaal hulpmiddel voor versneld onderzoek is naar het vinden van nieuwe toezichthouders van HFD-geïnduceerde obesitas.
Figuur 2 . TAG testen in mannelijke en vrouwelijke vliegen.
2 - weken oude vliegen op een normale voeding waren verzameld, gegroepeerd per geslacht (mannen en vrouwen), gewogen en vermalen (3 of 5 vliegen per putje) voor Label analysis. TAG testen werden uitgevoerd volgens de procedures in dit artikel wordt beschreven. De extinctie van elke steekproef bij 550 nm werd gelezen op verschillende tijdstippen (0 min, 5 min, 20 min en 50 min) te bepalen van de eventuele schommelingen in de TAG kwantificering over tijd, vet inhoud variatie in verschillende bevolking maten (3 en 5 vliegen) van w1118 vliegen, en verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke TAG inhoud. De resultaten toonden aan dat vrouwen zich ophopen meer vet dan hun mannelijke tegenhangers (A-B), TAG metingen niet schommelen tot 50 min. na de reactie incubatie bij 37 ° C (A-B). Ook het gemiddelde TAG niveaus blijven onveranderd tussen TAG testen met behulp van 3 of 5 vliegen (A-B). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistieken: geen significant verschil. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Effecten van HFD op vet ophoping.
A-B: 2 - weken oude vrouwelijke vliegen aan de orde gesteld op een normaal of HFD 5 dagen werden verzameld en de TAG-tests werden uitgevoerd om te bepalen van de niveaus van vet. TAG inhoud was genormaliseerd met gewicht (A) of eiwitniveaus (B). De gegevens bleek dat HFD consumptie tot verhoogde vetgehalte met beide methoden van normalisatie leidt. C: 2 - weken oude vrouwelijke vliegen op normal/controle voedsel (NF) en 18 h, 1 dag of 2 dagen op HFD zijn vehiculumcontrolegroep TAG inhoud. De resultaten tonen een aanzienlijke en progressieve toename van TAG niveaus, van 18u tot 2 dagen na blootstelling aan HFD. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Statistieken: student t-test. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obesitas inductie in muizen kun je maanden19,20. In vliegen voorziet deze HFD voeding protocol inductie van overtollige vet accumulatie in een kwestie van dagen of minder, waardoor verhogingen in vet ophoping pas na 18 h (Zie Figuur 2). HFD vervoederen van het beschreven protocol verhoogt glucose inhoud 12 en vermindert Bmm lipase en PGC-1 expressie24. Dit is in tegenstelling tot het vasten van volwassen Drosophila , waardoor een snelle daling van zowel vet als glucose inhoud25,26 en verhoogde Bmm expressie24. Ook, verheffen Bmm of PGC-1 niveau beschermt tegen obesitas HFD-geïnduceerde14,24. Terwijl 30% HFD is gebruikt in dit protocol, voederen van vliegen met 3%, 7% of 15% vet geïnduceerde obesitas in een dosis-afhankelijke dieet mode12, evenals het verhogen van de duur van HFD voeding (Figuur 3). We vonden ook dat het voederen één vetzuren van de hoofdonderdelen van kokosolie, dat wil zeggen, laurinezuur van 14% of 5% myristinezuur, oorzaken aanzienlijk verhoogd vet ophoping12.
De versnelde metabole reactie met deze vliegen op een HFD-regime is gecorreleerd met een beperkte levensduur27 zoals waargenomen in zoogdieren28, maar > 80% van de vliegen overleven afgelopen 20 dagen op HFD27. De snelle inductie van vet ophoping gemedieerd door geconserveerde cellulaire en moleculaire processen controleren lipide en glucose metabolisme is gunstig voor vele obesitas gerelateerde studies, zoals diabetes of lipotoxic cardiomyopathie10, 12,13,14,15,16. Belangrijkste bevindingen in de gevolgen van metabole onevenwichtigheden en verwante cardiale stoornissen kan waarschijnlijk vergelijkende translationeel studies bij de mens.
De voeding protocol HFD is compatibel voor gebruik met andere Drosophila -soorten en insecten modellen die soortgelijk diëten met D. melanogasterdelen. Deze HFD voeding protocollen kan op passende wijze worden aangepast voor organisme zoals C. elegans of ook andere insecten die verschillende 'gewone' voedsel media vereisen. De 30% HFD is niet geschikt voor gebruik in experimenten waarbij hoge temperaturen; lagere concentraties van kokosolie of één vetzuren kunnen echter voldoende alternatieven12.
Deze TAG-protocol is gebaseerd op PBS, een niet-toxisch buffer waarmee gemakkelijk te hanteren en experimenteren zonder een zuurkast, in tegenstelling tot eerder gebruikte organische oplosmiddelen (methanol/chloroform of diethylether) in lipide extractie en kwantificering15 , 29 , 30. een ander voordeel van deze buffer is dat het de niveaus van de TAG aan proteïne inhoud gebaseerd op de dezelfde eerste homogenaat, waardoor het vet bepaling in kleine weefselsteekproeven gemakkelijk haalbaar en biedt nieuwe mogelijkheden om te studeren orgel kunt normaliseren cross-talk in organisch metabole homeostase. De dezelfde eerste vliegen homogenaat verkregen na het slijpen, kan ook worden gebruikt voor het uitvoeren van parallelle glucose en glycogeen testen, waardoor de studie van veranderingen in zowel de lipide en het glucose metabolisme van de dezelfde biologische monsters. Dit protocol TAG is moeizaam of minder tijd in beslag dan eerdere protocollen15,-29,30, en is nogal hoge doorvoer, met behulp van een 96-Wells-indeling, waarmee voor snelle testen van dicht bij 100 monsters binnen een uur. Dit protocol kan ook worden gebruikt om het kwantificeren vetgehalte onder andere dieet voorwaarden, waaronder hoge suiker dieet13,31, dieet beperking en honger, alsmede voor veroudering studies te begrijpen van de leeftijd-geassocieerde veranderingen in de vetstofwisseling.
Zwaarlijvigheid, metabool syndroom en verwante aandoeningen zijn op een all-time high met rampzalige gevolgen voor de gezondheid van de mens1,2. Het gecombineerde HFD-protocol en de hoge doorvoer TAG assay bieden een uniek platform voor het gebruik van modelorganismen, zoals Drosophila, ertoe snel zwaarlijvigheid en de scherm voor genetische factoren, of natuurlijke en synthetische chemische verbindingen, beter begrijpen metabole onbalans. Uiteindelijk kan dit sterk bijdragen aan de vooruitgang van de wetenschappelijke ontdekkingen voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen of kuren voor metabole ziekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken Erika Taylor voor het bewerken van dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 en R01 HL054732) naar R.B., een post-doctoraal onderzoek supplement (R01 HL085481) en fellowship (AAUW) aan S.B.D. en subsidies van de American Heart Association aan S.B.D. en R.T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
