Summary
Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.
Abstract
Herzkrankheit ist die häufigste Ursache des menschlichen Todes weltweit. Zahlreiche Studien haben starke Verbindungen zwischen Adipositas und kardiale Störungen beim Menschen gezeigt, aber mehr Instrumente und Forschungsanstrengungen sind erforderlich, die Mechanismen besser aufzuklären. Seit mehr als einem Jahrhundert, das genetisch sehr gefügig Modell von Drosophila maßgeblich an der Entdeckung der Schlüsselgene und molekulare Signalwege, die erwies sich als hoch über Artgrenzen konserviert werden. Viele biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen sind funktionell in der Fliege, wie Entwicklung (z.B., Körper Plan, Herz), Krebs und Neurodegenerative Erkrankung erhalten. Vor kurzem spielte das Studium der Fettleibigkeit und sekundären Krankheiten wie Herz-Kreislauferkrankungen in Modellorganismen, eine sehr wichtige Rolle bei der Identifizierung der wichtigsten Regulatoren metabolisches Syndrom beim Menschen beteiligt.
Hier schlagen wir vor, diesem Modellorganismus als ein effizientes Werkzeug zu induzieren, Adipositas, d. h., übermäßige Fettansammlung, und entwickeln ein effizientes Protokoll zur Überwachung der Fettgehalt in Form von TAGs Anhäufung verwenden. Neben den hoch konservierte, aber weniger komplexes Genom hat die Fliege auch eine kurze Lebensdauer für schnelle Experimente, kombiniert mit Wirtschaftlichkeit. Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll für hohen Fett-Diät (HFD) Fütterung in Drosophila , Übergewicht und ein hoher Durchsatz Triacylglyceride (TAG) Assay für die Messung der damit verbundenen Zunahme der Fettgehalt, mit dem Ziel, sehr reproduzierbar zu induzieren und effizient für große genetische oder chemische Screening. Diese Protokolle bieten neue Möglichkeiten, um effizient Regulationsmechanismen beteiligt Fettleibigkeit zu untersuchen, sowie bieten eine standardisierte Plattform für Droge-Entdeckung-Forschung für die schnelle Prüfung der Wirkung von Medikamenten-Kandidaten auf die Entwicklung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit, Diabetes und metabolische Erkrankungen.
Introduction
Wir befinden uns in einer Zeit, wo Übergewicht und die damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen ist ein weltweites Problem1. Zwei von drei Amerikanern sind übergewichtig oder fettleibig mit den damit verbundenen Herz Krankheiten, die primäre Ursache des Todes in der erwachsenen Bevölkerung2. Neue effiziente Methoden sind notwendig, um die genetischen und molekularen Komponenten beteiligt an der Regulation des metabolischen Syndroms mit Modellorganismen angemessen zu untersuchen. Aus diesem Grund wählen wir die Fruchtfliege Drosophila -Modell, weil es die grundlegende biologische Prozesse mit Säugetieren, einschließlich Menschen und Mäusen3,4,5,6teilt. Drosophila-Genom ist im Laufe der Evolution hoch konservierte aber insgesamt viel kleiner mit weniger Genduplikation und metabolische Komplexität, wodurch es ideal für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen in vielen menschlichen Krankheiten4 verwickelt , 7 , 8. auch charakteristische Prozesse durchgeführt durch Fettgewebe, Darm und Bauchspeicheldrüse sind vertreten in der Fliege und vermitteln Regulierungsaufgaben in Glukose und Lipid-Stoffwechsel, zum Beispiel, die ähnlich wie Menschen9, 10,11. Darüber hinaus sind die grundlegende molekulare Wege der Kontrolle von Übergewicht, Insulinresistenz und Diabetes beim Menschen beteiligt in Drosophila Melanogaster12,13,14 funktionell konserviert. , 15 , 16. wie höhere Organismen, Drosophila hat ein schlagendes Herz, die während der Entwicklung durch ähnliche Prozesse der Säugetier-Herz3,17entsteht. So bieten die Entwicklung einer zuverlässigen HFD Fütterung Protokoll und hohem Durchsatz TAG Assay, angepasst für effiziente Sortierung Zwecke mit Hilfe den genetischen Werkzeugkasten von Drosophila, ein wichtiges Mittel zu untersuchen und verstehen die grundlegenden genetische Grundlagen zugrunde liegenden komplexen Stoffwechselerkrankungen.
Das HFD Essen selbst besteht aus einem Standardlabor fliegen Lebensmittel ergänzt mit Kokosnuss-Öl, besteht hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren bekannt, metabolisches Syndrom18zugeordnet werden soll. Während Fettleibigkeit bei Säugetieren Modelle, wie Nagetiere, Induktion Monate19,20nehmen kann, erhöht unsere optimierte HFD Protokoll in Drosophila füttern, effektiv und reproduzierbar organismal Fettgehalt in wenigen Tage12,14. Dieses Protokoll ermöglicht in Verbindung mit einem hohen Durchsatz TAG-Assay, effiziente mass Screening für die Auswirkungen der genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Medikamentenkandidaten neue Modulatoren des Fettstoffwechsels zu entdecken. In der Folge dürften diese Protokolle zu verstehen und/oder Übergewicht und Fettleibigkeit verbundenen menschlichen Krankheiten zu bekämpfen.
Die Fütterung Protokoll ist vielseitig und kann angewendet werden, um die Stoffwechsel- und funktionelle Auswirkungen der einzelnen gesättigte oder ungesättigte Fettsäure zu studieren. Der Einsatz von Hochdurchsatz-TAG Assays beschränkt sich nicht auf D. Melanogaster, sondern kann auf eine Vielzahl von kleinen Modellorganismen mit Kutikula oder harte extrazellulären Matrizen(z. B.andere Drosophila -Arten, C. Elegans angepasst werden und anderen Wirbellosen Modellorganismen) Fettgehalt unter verschiedenen ökologischen, genetischen und physiologischen Bedingungen, in jedem Stadium der Entwicklung, Erwachsenenalter oder Phase Stoffwechselerkrankung zu messen. Die TAG-Assay basiert auf eine farbmetrische Messung aus einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die verschlechtern die TAGs in freie Fettsäuren, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat und schließlich H2O2 , das mit 4-Aminoantipyrine (4-AAP) und 3,5 - reagiert Dichlor-2-Hydroxybenzene Sulfonate (3,5 DHBS) eine rote farbige Produkt zu produzieren, die mit einer 96-Well-Spektralphotometer gemessen wird.
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Protocol
1. HFD Fütterung Protokoll
Tabelle 1. Fliege Nahrungsmittelrezept.
Diese Tabelle fasst die verschiedenen Zutaten zur Zubereitung unserer Kontrolle. Sobald gebildet, 10 mL des Essens ist in Fläschchen gegossen, gekühlt und bei 4 ° C für langfristige Lagerung gelagert.
- HFD Vorbereitung
- um 1 kg des hohen Fett essen machen, wiegt 700 g vorgefertigte normale fliegen Nahrung (siehe Tabelle 1) und 300 g Kokosöl in zwei getrennten Behältern mit einer Analysenwaage.
- Erhitzen jeder Behälter einzeln in der Mikrowelle, bis der Inhalt vollständig schmelzen. Gießen Sie das Kokosöl in die Fliege Lunchbox. Rühren mit einem Schneebesen, bis das Öl gut in die Fliege Nahrung vermischt ist.
Hinweis: Keine Klumpen von Lebensmitteln oder Öl sollte sichtbar sein. Wenn das fliegende Essen in der Mikrowelle schmelzen, zu stoppen, in Abständen von 1 min auf das Essen zu mischen und zu verhindern, überkochen. - Re wiegen die hohen Fette essen. Wenn das Gesamtgewicht beträgt weniger als 1 kg (700 g Lebensmittel + 300 g Kokosöl), fügen Sie Wasser (ca. 10 mL) zum Ausgleich von Verdunstung während des Erhitzens und bringen wieder das Gewicht auf 1 kg.
- Pour gut durchmischten ca. 10 mL hohe fettreiche Nahrung pro Vial (rund 25 % des Volumens der Durchstechflasche). Als nächstes decken mit Gaze, fliegen zu verhindern ' Kontamination. Für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen lassen dann die Fläschchen auf 4 ° C für die Lagerung bis zu 4 Wochen übertragen.
Hinweis: Die normale Nahrung (NF) wird als Kontrolle Lebensmittel verwendet. Auch Gießen Sie 10 mL (ca. 25 % des Volumens der Vial) NF pro Fläschchen. Ersetzen Sie für die HFD Lebensmittel 30 % der NF-Lebensmittel mit Kokosnuss-Öl. Zur Steuerung und experimentellen Bedingungen, die fliegen erhielten die gleiche Menge an NF und HFD (10 mL Futter pro Fläschchen).
Abbildung 1 . HFD Fütterung in Drosophila.
Das Schema zeigt die verschiedenen Fütterung Schritte für fliegen auf einem Steuerelement Essen (normale Ernährung ohne Zusatz von Kokosöl-NF) oder HFD (mit dem Zusatz von Kokosöl). Der gesamte Prozess dauert 10 Tage nach der ersten Sammlung von Erwachsenen fliegen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- HFD Fütterung von D. Melanogaster
Hinweis: dieses Protokoll beinhaltet Kontrolle Essen und HFD Fütterung Verfahren, die mit einer Fliege Linie kompatibel sind. Kontrolle und experimentelle fliegen werden in Ampullen mit der gleichen Menge Essen (NF oder HFD) gelegt.- Einsatz CO 2 um die fliegen zu betäuben.
: Für Neulinge, bitte lesen Hinweis 21 für einen Überblick über Erziehung und Umgang mit D. Melanogaster. - Sammeln 0-5 Tag alt fliegen von Vials und Transfer (mit Spiegeln) die fliegen in neue Ampullen mit NF (vorher bei Raumtemperatur erwärmt). Lassen Sie das Fliegen Alter für 5 zusätzliche Tage bei 21 ° c
- Am Ende der 5 Tage, nehmen Sie das Fläschchen mit HFD und NF von 4 ° c
Hinweis: wie Kälte Leben fliegen, stress können lassen Sie die Fläschchen für 30 min bei Raumtemperatur zum Aufwärmen vor dem Einsatz sitzen. - Mit Feuchttücher, reinigen und entfernen Sie überschüssigen Flüssigkeit von den Seiten der Durchstechflaschen.
- Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier, über 1 cm x 3 cm, in den hohen Fett essen, überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren.
Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, zu verhindern, dass die fliegen kleben auf HFD Nahrung. - Transfer als nächstes die fliegen auf den hohen Fett essen (mit Spiegeln). Legen Sie die Flaschen horizontal auf ihrer Seite (nicht stehend) bei 21-22 ° C für 5 Tage.
Hinweis: Vermeiden Sie höhere Temperaturen, da dies teilweise hohe fettreiche Nahrung, wodurch die fliegen zu essen und sterben Stick schmelzen kann. - Nach 5 Tagen, transfer (mit Spiegeln) die fliegen von NF und HFD in neue Fläschchen ohne Nahrung für ihren Mut, für 30 min leer lassen. Als nächstes gehen Sie zum Wiegen der Flies.
Hinweis: Die entscheidenden Schritte in dieser HFD Fütterung Protokoll gehört zu einer gut durchmischten HFD, frei von jeder Brocken fliegen Essen oder kondensierten Öl vorzubereiten. Homogen mischen und Kühlung der HFD auf 45-30 ° C ist ratsam, vor dem Gießen in Fläschchen und Lagerung der Lebensmittel im richtigen Alter von 4 ° c Anpassung der Steuerung und experimentellen fliegen ist ebenso wichtig wie kontrollierte Ernährung und ökologischen Bedingungen vor die HFD Fütterung. Während der Einlaufphase Kontrolle und experimentelle fliegt die gleiche Menge an NF und HFD anzugeben. Sammeln Sie nie fliegen aus überfüllten Fläschchen oder Flaschen (zur Vermeidung von generationenübergreifenden Effekte). Setzen Sie immer maximal 25 fliegen pro Fläschchen während NF und HFD Fütterung um diätetische Einschränkung oder andere crowding Effekte zu vermeiden. Die HFD besteht aus 30 % Kokosöl, somit Temperaturen über 22 ° C könnte teilweise schmelzen HFD, wodurch die fliegen zum Aufkleben auf die fettige Lebensmittel und sterben. Reinigen Sie bevor die fliegen auf der HFD die Fläschchen, entfernen das restliche Öl und legen ein Filterpapier überschüssigen Flüssigkeit in der Nahrung zu absorbieren. Während der Inkubation der fliegen auf HFD, regelt die Fläschchen auf ihren Seiten um eine fettfreie horizontale Oberfläche für die fliegen.
- Einsatz CO 2 um die fliegen zu betäuben.
- Wiegen die fliegen
- für jeden Genotyp und Geschlecht getestet werden, eine hochempfindliches Skala verwenden, um die Gewichte bereits beschriftete, leere 1,7 mL Röhrchen aufnehmen.
- Mit Fliege Betäubung oder CO 2, zu betäuben und 36 fliegen von den gleichen Genotyp, Geschlecht, zu sammeln und Einspeisung Status mit einem Pinsel in einer Pre-1,7 mL-Tube wog.
- Wiegen die Röhrchen mit fliegen mit der gleichen hochempfindliches Skala.
- Bestimmen das Durchschnittsgewicht fliegende nach dieser Formel:
Hinweis: die Anzahl der fliegen in diesem Protokoll ist 36. - Blitz Einfrieren der 1,7 mL-Röhrchen mit fliegen durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff für 2 min. sammeln und die Rohre in Boxen. Als nächstes übertragen die Boxen bis-80 ° C (bevorzugte Temperatur) für die Lagerung bis zur Verwendung mit dem TAG-Assay.
Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur. Bitte geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen.
2. TAG-Assay
- Vorbereitung der TAG standard Konzentrationen
- 500 mL PBT vorbereiten (PBS 1 X 0,05 % Triton).
- Mit 0,5 mL Röhrchen und die TAG-Lösung (Table of Materials), bereiten Sie 100 µL des Rohlings (nur PBT) und 100 µL der sechs standard-TAG-Konzentrationen (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0,0625 µg/µL) mit der PBT.
- Die Rohre auf Eis legen und fahren Sie mit Schleifen fliegen.
- Schleifen die fliegen
- nehmen Sie die gefrorenen fliegen von-80 ° C (Schritt 1.3). Übertragen Sie die Röhrchen mit der fliegen auf Ice
- Zuerst legen Sie 2 mm Metall Mahlkugeln in eine 96-Well-Kugel-Spender, verwenden Sie einen kleinen Pinsel Extrakugeln entfernen.
- Ort der 96-Well-Schleifen Platte auf dem Kopf stehend auf dem Ball Dispenser und Flip die Metallkugeln direkt in die reibende Platte übertragen. Es sollte ein Ball pro Bohrloch.
- Mit einer Multi-Kanal-Pipette 600 µL PBT in jeder Zeile der Schleifscheibe 96-Well-Platte hinzufügen.
- Mit der Pinzette, fügen Sie 3 fliegt pro Bohrloch. Der Genotyp, Geschlecht und Ernährung Zustand der fliegen in jeder Zeile/gut von den Schleifen 96-Well-Platte.
- Legen Sie fest die Kappen auf die Schleifscheibe 96-Well-Platte. Band darf Sie nach oben, um sicherzustellen, dass es kein Durchsickern.
- Setzen Sie richtig die Schleifen 96-Well-Platten der Schleifmaschine. Die Maschine setzen, um die höchste Geschwindigkeit und Presse " laufen " die fliegen für 3 min. mahlen
- Nach 3 min, stoppen die Schleifen und fahren Sie mit Platte Zentrifugation: bewiesenge für 15 min bei 4.000 x g, 4 ° C. Nach Zentrifugation, verwalten die reibende Platte sorgfältig, um zu vermeiden, Mischen des Überstands mit dem Pellet.
- Probenbeladung und Bestimmung des TAG
- eine neue Spektralphotometer 96-Well-Platte zu nehmen. Mit einer Multi-Kanal-Pipette 200 µL des Reagenz TAG in jeder Zeile der Platte laden.
- Last 20 µL PBT in den ersten Brunnen der ersten Zeile ein Leerzeichen erstellen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Last 20 µL jeder standard Verdünnung (aus Schritt 2.1.2) in den übrigen Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Mit einer Multi-Kanal-Pipette 20 µL des Überstandes aus jeder Zeile der reibende Platte auf die entsprechende Zeile in der 96-Well-Photometer-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Setzen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.
- Brüten die Platte bei 37 ° C für 10 min.
Hinweis: In den Brunnen gibt es Bläschen, Zentrifugieren der Platte für 2 min bei 2.000 x g um alle Luftblasen zu entfernen. Bläschen beeinträchtigt auch die Extinktion lesen. - Lesen Sie die Absorption von jedem Bohrloch der Platte bei 550 nm mit einem kompatiblen Mikrotestplatte Reader. Als nächstes verfolgen die Standardkurve und bestimmen die Konzentration [µg/µL] unbekannter Proben.
- Um den Betrag des TAG-Inhalt pro mittlere fliegen Gewicht ermitteln verwenden Sie die folgende Formel:
Hinweis: In diesem Protokoll wurden 3 fliegen in 600 µL PBT gehackt; in der Folge ist das mittlere Volumen pro Fliege 200 µL.
- Bradford-Test und Normalisierung des TAG-Inhalt mit Protein-Inhalt
- bereiten sieben 100 µL Rinderserumalbumin (BSA) standard Verdünnungen (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1.000 µg/mL) mit der PBT.
- Nehmen eine neue 96-Well-Platte und 200 µL 1 X Bradford-Reagenz in jeder Zeile der Platte laden.
- In die erste Vertiefung der ersten Zeile fügen Sie 10 µL PBT erstelle ich eine leere. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Fügen Sie 10 µL jeder standard Verdünnung in den verbleibenden Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Mit einer Multi-Kanal-Pipette 10 µL Überstand der Fliege aus jeder Zeile der reibende Platte in die entsprechende Zeile in der 96-Well-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.
- Legen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.
- Die Platte bei 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. In den Vertiefungen gibt es Bläschen, Zentrifugieren die Platte für 2 min bei 2.000 x g um sie zu entfernen.
Hinweis: Bläschen wird das Ablesen der Absorption stören. - Einsatz einem Spektrophotometer zu lesen die Extinktion des Rohlings, Normen und unbekannte Proben bei 595 nm. Die Standardkurve verwenden, um die Konzentrationen [µg/µL] der Proben in jeder Zeile bestimmen.
- Normalisieren das TAG zufrieden mit Protein-Ebene mit Hilfe der folgenden Formel:
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Representative Results
In D. Melanogasterwie der Fall mit anderen Arten ist gibt es Geschlechtsdimorphismus zwischen Männchen und Weibchen22. Es ist bekannt, dass die Weibchen größer, mit mehr Fett in ihre Bäuche als Männchen22 sind. Um die Wirksamkeit unserer Protokoll zu testen, haben wir TAG Tests ermitteln die TAG inhaltliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen Standardlabor Wildtyp (w1118) fliegt. Die Daten zeigen, dass Frauen mehr ganze Körperfett als ihre männlichen Kollegen (Abbildung 2A, B). Die Daten zeigten auch, dass die Assays stabil, wobei keine Variation im TAG Quantifizierung im Laufe der Zeit ist (bis zu 50 min nach der Inkubation) und ohne Schwankungen je nach Größe der biologischen Probe (3 oder 5 fliegen).
HFD Verbrauch hat sich gezeigt, zu Fettleibigkeit in Mensch und Maus19,20,23. Um die Wirksamkeit unserer Fütterung Protokoll zu testen, haben wir TAG-Assays mit unseren HFD und Kontrolle weibliche Fliegen gefüttert. Wir fanden, dass Verzehr von HFD in Drosophila erhöhte Fettgehalt verursacht, die nach und nach sammelt sich im Laufe der Zeit (Abbildung 3A-C). Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass nach nur 18 h HFD Fütterung (Abb. 3C), konnten wir eine deutliche Steigerung des Fettgehalts in diese fliegen zu induzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese genetische Modellsystem ist ein ideales Werkzeug für die beschleunigte Erforschung neuartige Regulatoren der HFD-induzierten Adipositas zu finden.
Abbildung 2 . TAG assays in männlichen und weiblichen fliegen.
2 - Wochen alten fliegen auf einer normalen Ernährung wurden gesammelt, gruppiert nach Geschlecht (Männchen und Weibchen), gewogen und gemahlen (3 oder 5 fliegen pro Well) für TAG Analyse. TAG-Assays wurden nach den in diesem Dokument beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Extinktion jeder Probe bei 550 nm wurde zu verschiedenen Zeitpunkten (0 min, 5 min, 20 min und 50 min), um eventuelle Schwankungen im TAG Quantifizierung festzustellen gelesen, über Zeit, Fett Inhalt Variation in verschiedenen Bevölkerungsgruppen Größen (3 und 5 fliegen) w1118 fliegen und Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen TAG Inhalt. Die Ergebnisse zeigten, dass Frauen mehr Fett als ihre männlichen Kollegen (A–B) ansammeln, TAG Messungen schwanken nicht bis zu 50 min. nach der Reaktion Inkubation bei 37 ° C (A–B). Auch der Mittelwert TAG Ebenen bleiben unverändert zwischen TAG-Assays mit 3 oder 5 fliegen (A–B). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM Statistik vorgestellt: kein signifikanter Unterschied. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Beeinflussung der HFD Fettansammlung.
A-b: 2 - Woche alte weiblichen fliegen für 5 Tage auf ein Normal "oder" HFD angehoben wurden gesammelt und die TAG-Assays wurden durchgeführt, um Fett zu bestimmen. TAG-Inhalt wurde entweder mit Gewicht (A) oder Protein-Ebene (B) normalisiert. Die Daten zeigten, dass HFD Konsum zu erhöhter Fettgehalt mit beiden Methoden der Normalisierung führt. C: 2 - Woche alte weiblichen fliegen auf Normal/Kontrolle Essen (NF) und 18 h, 1 Tag oder 2 Tage auf HFD sind für TAG-Inhalt untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche und progressive Zunahme der TAG Ebenen von 18 h bis 2 Tage der Exposition gegenüber HFD. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM Statistik vorgestellt: Student t-Test. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Adipositas-Induktion bei Mäusen kann Monate19,20nehmen. In Fliegen ermöglicht dieser HFD Fütterung Protokoll für die Induktion von überschüssigen Fettansammlung in einer Angelegenheit von Tagen oder weniger, verursachen erhöht in Fettansammlung erst nach 18 Uhr (siehe Abbildung 2). HFD füttern mit dem beschriebenen Protokoll Glukose Inhalt 12 erhöht oder verringert Bmm Lipase und PGC-1 Ausdruck24. Dies steht im Gegensatz zu Fasten des Erwachsenen Drosophila , die eine schnelle Abnahme in Fett und Glukose Inhalt25,26 und erhöhte Bmm Ausdruck24verursacht. Außerdem schützt erhebt Bmm oder PGC-1 Ebenen HFD-induzierten Adipositas14,24. Während 30 % HFD in diesem Protokoll verwendet worden ist, fliegen mit 3 %, 7 % oder 15 % Fett füttern induzierten Adipositas in einer Dosis-abhängigen Diät Mode12, wie Erhöhung der Dauer der HFD Fütterung (Abbildung 3). Wir fanden auch, dass einzelne Fettsäuren der Hauptkomponenten von Kokosöl, d. h., 14 % Laurinsäure oder 5 % Myristinsäure Fütterung, Ursachen deutlich Fettansammlung12 erhöhte.
Die beschleunigte metabolische Reaktion mit diesen fliegen auf einem HFD-Therapie ist mit einer reduzierten Lebensdauer27 korreliert, wie bei Säugetieren28, beobachtet aber > 80 % der fliegen vorbei an 20 Tagen auf HFD27überleben. Die schnelle Induktion der Fettansammlung vermittelt durch konservierte zelluläre und molekulare Prozesse Lipid und Glukose-Stoffwechsel ist vorteilhaft für viele Adipositas Studien, wie z. B. Diabetiker oder Lipotoxic Kardiomyopathie10, 12,13,14,15,16. Wichtige Erkenntnisse in die Folgen der metabolische Ungleichgewichte und damit verbundenen kardialen Dysfunktionen werden wahrscheinlich translationale Vergleichsstudien im Menschen ermöglichen.
Die HFD Fütterung Protokoll ist kompatibel für den Einsatz mit anderen Drosophila -Arten und Insekten-Modellen, die ähnliche Diäten mit D. Melanogasterteilen. Diese HFD Fütterung Protokolle könnte entsprechend angepasst werden, für Organismus wie C. Elegans oder auch andere Insekten, die andere "normale" Lebensmittel Medien erfordern. Die 30 % HFD ist nicht geeignet für Verwendung in Experimente erfordern hohe Temperaturen; geringere Konzentrationen von Kokosöl oder einzelne Fettsäuren könnte jedoch adäquate Alternativen12.
Dieser TAG-Protokoll basiert auf PBS, ungiftig Puffer, der einfache Handhabung und Experimentieren ohne einer Dampfhaube im Gegensatz zu vorher ermöglicht verwendeten organische Lösungsmitteln (Methanol/Chloroform oder Diethylether) in Lipid-Extraktion und Quantifizierung15 , 29 , 30. ein weiterer Vorteil dieses Puffers ist, dass es die TAG Ebenen Eiweißgehalt basierend auf der gleichen ersten Homogenat, machen die Fett Bestimmung in kleine Gewebeproben leicht erreichbar und bietet neue Möglichkeiten zur Orgel studieren zu normalisieren Übersprechen Sie in organismal metabolischen Homeostasis. Die gleichen ersten fliegen Homogenat erhalten nach dem Schleifen kann auch verwendet werden, parallel Glukose und Glykogen-Assays, so dass die Untersuchung von Veränderungen in der Lipid- und Glukose-Stoffwechsel aus der gleichen biologischen Proben durchzuführen. Dieses TAG-Protokoll ist weniger mühsam oder zeitaufwendiger als frühere Protokolle15,29,30, und ist ziemlich hoch Durchsatz, mit einer 96-Well-Format, das ermöglicht die schnelle Prüfung von in der Nähe von 100 Proben innerhalb einer Stunde. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, zu quantifizieren, Fettgehalt unter anderen diätetischen Bedingungen, einschließlich zuckerreiche Ernährung13,31, diätetische Einschränkung und Hunger, sowie für Aging Studien altersassoziierten Veränderungen zu verstehen im Fettstoffwechsel.
Adipositas, metabolisches Syndrom und verwandte Erkrankungen sind auf einem Allzeithoch mit katastrophalen Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit1,2. Das kombinierte HFD-Protokoll und der hohe Durchsatz TAG Assay bieten eine einzigartige Plattform zur Modellorganismen wie Drosophila, verwenden, um schnell Übergewicht und Bildschirm für genetische Faktoren induzieren oder natürliche und synthetische chemische Verbindungen, um besser verstehen metabolische Ungleichgewicht. Letztlich könnte dies erheblich zur Weiterentwicklung der wissenschaftlichen Erkenntnisse für die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden oder Heilmittel für Stoffwechsel-Erkrankungen beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchte Erika Taylor für die Bearbeitung dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus der National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 und R01 HL054732), r.b., doctoral Research Ergänzung (R01 HL085481) und ein Stipendium (AAUW), S.B.D. und Zuschüsse aus der American Heart Association, S.B.D. und R.T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
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