Summary
זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.
Abstract
מחלת לב היא הגורם מספר אחד למוות אדם ברחבי העולם. מחקרים רבים הראו קשרים חזקים בין השמנת יתר בתפקוד הלב אצל בני אדם, אבל מאמצי המחקר וכלים נוספים יש צורך להבהיר טוב יותר את המנגנונים המעורבים. במשך יותר ממאה, הדגם גנטית מאוד צייתן של דרוזופילה כבר אינסטרומנטלי גילוי גנים מרכזיים, מסלולים מולקולריים אשר הוכיח להיות מאוד שמור על פני מינים. תהליכים ביולוגיים רבים, מנגנוני המחלה באופן פונקציונלי נשמרים בתוך הזבוב, כגון פיתוח (למשל, תוכנית גוף, לב), סרטן, מחלות ניווניות. לאחרונה, המחקר של השמנת יתר, פתולוגיות משני, כגון מחלות לב דגם אורגניזמים, שיחק תפקיד קריטי מאוד הזיהוי של הרגולטורים מפתח מעורב תסמונת מטבולית אצל בני אדם.
כאן, אנו מציעים שתשמש כלי יעיל זה אורגניזם מודל זירוז השמנת יתר, כלומר, הצטברות שומן עודף, ולפתח פרוטוקול יעיל כדי לנטר בצורה של תגיות הצטברות שומן. בנוסף שנשמרת מאוד, אבל פחות מורכבים הגנום, הזבוב יש גם אורך חיים קצר לניסויים מהירה, בשילוב העלות האפקטיביות. מאמר זה מספק נוהל מפורט עבור דיאטה שומן גבוהה (HFD) האכלה דרוזופילה לזירוז השמנה ואת וזמינותו triacylglyceride (תג) של תפוקה גבוהה למדידת העלייה המשויך תכולת השומן, במטרה להיות מאוד לשחזור, יעיל לסינון גנטי או כימיות בקנה מידה גדול. פרוטוקולים אלה מציעים הזדמנויות חדשות ביעילות לחקור מנגנונים רגולטוריים מעורב השמנת יתר, וכן מספקים פלטפורמה סטנדרטית למחקר גילוי סמים בדיקה מהירה של השפעת סמים מועמדים על הפיתוח או מניעת השמנת יתר, סוכרת ומחלות מטבוליות הקשורות.
Introduction
אנחנו בתקופה שבה השמנת יתר, הנטל הכלכלי, המשויכת שלו הוא בעיה ברחבי העולם1. . שניים מתוך כל שלושה אמריקאים הם מעודף משקל או מהשמנת יתר עם פתולוגיות הקשורות ללב, הגורם העיקרי למוות בתוך אוכלוסיית הבוגרים2. השיטה היעילה חדש דרושים כדי שלמאחה לחקור את הרכיבים גנטית ומולקולרית מעורב ברגולציה של תסמונת מטבולית באמצעות מודל אורגניזמים. מסיבה זו, אנו בוחרים את המודל דרוזופילה זבוב הפירות כי היא חולקת את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים ביותר עם יונקים, כולל בעכברים ובבני אדם3,4,5,6. הגנום של דרוזופילההוא מאוד שנשמרת במשך האבולוציה אבל בסך הכל הרבה יותר קטן עם פחות שכפול גנטי, המורכבות מטבולית, שהופך אותו אידיאלי עבור הבנת המנגנונים הבסיסיים מעורב מחלות אנושיות רבות4 , 7 , 8. בנוסף, תהליכים אופייניים המבוצע על ידי רקמת שומן, הבטן ואת הלבלב מיוצגים הזבוב ולסיים רגולטוריות פונקציות בגלוקוז, ליפיד חילוף חומרים, לדוגמה, דומים לבני אדם9, 10,11. יתר על כן, בסיסי מסלולים מולקולריים המעורבים בבקרה על השמנה, עמידות לאינסולין וסוכרת בבני פונקציונלית נשמרים דרוזופילה melanogaster12,13,14 , 15 , 16. כמו עילאיים, דרוזופילה יש לב פועם נוצרת במהלך הפיתוח על-ידי תהליכים דומים לזה של ה-3,לב בתרבית של17. לפיכך, התפתחות HFD אמין האכלה הפרוטוקול ואת וזמינותו תג תפוקה גבוהה, המותאמים למטרות סינון יעיל באמצעות תיבת כלי גנטי של דרוזופילה, לספק אמצעי חשוב ללמוד ולהבין את הבסיס הגנטי הבסיסי מחלות מטבוליות מורכבת המשמשת כבסיס.
המזון HFD עצמו עשוי מאכל לעוף מעבדה רגיל בתוספת שמן קוקוס, אשר מורכב ברובו של חומצות שומן רוויות ידוע להיות מזוהה עם תסמונת מטבולית18. בעוד שייצור השמנה במודלים יונקים, כגון מכרסמים, יכול לקחת חודשים19,20, שלנו HFD ממוטבת האכלה פרוטוקול דרוזופילה ביעילות, reproducibly מגדיל organismal שומן בעניין של ימים12,14. פרוטוקול זה, בשילוב עם וזמינותו תפוקה גבוהה תג, מאפשר הקרנה המונים יעילה על ההשפעות של גורמים גנטיים, השפעות הסביבה. סמים מועמדים לגלות מאפננים החדש של חילוף החומרים של השומן. כתוצאה מכך, צפויים פרוטוקולים אלה רלוונטיים להבין ו/או לחימה השמנת יתר, השמנת יתר-הקשורים פתולוגיות אנושי.
פרוטוקול האכלה הוא תכליתי ולא ניתן להחיל לחקור את ההשפעות מטבולית ופונקציונליים של חומצות שומן רוויות או רוויים יחיד. שימוש assay תגים תפוקה גבוהה זו אינה מוגבלת melanogaster ד, אך עשוי להתאים למגוון רחב של אורגניזמים מודל קטן עם לציפורן או מטריצה חוץ-תאית קשה (למשל, מינים אחרים דרוזופילה , C. elegans השני המתעוררים דגם הגעה אורגניזמים) כדי למדוד את תכולת שומן תחת תנאים סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיות שונות, בכל שלב של פיתוח, לבגרות או שלב של מחלה מטבולית. וזמינותו תג מבוססת על מדידה ערכי צבע מוחלטים של סדרה של תגובות אנזימטיות זה לבזות את התגים לתוך חומצות שומן בחינם, גליצרול, גליצרול 3-פוספט ולבסוף2O H2 זה מגיב 4-aminoantipyrine (4-AAP) ו- 3.5- dichloro-2-hydroxybenzene (DHBS 3.5) כדי לייצר מוצר בצבע אדום נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים 96-ובכן סולפנט
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HFD האכלה פרוטוקול
טבלה 1. מתכון אוכל לעוף.
טבלה זו מסכמת החומרים השונים המשמשים להכנת לשליטתנו מזון. לאחר ביצוע, 10 מ של המזון הוא נשפך לתוך מבחנות, מקורר ומאוחסנים ב 4 ° C לאחסון לטווח ארוך-
- HFD הכנה
- להכין 1 ק ג של מזון שמן גבוהה, שוקל 700 גר' מוכנות מראש אוכל לטוס רגיל (ראה טבלה 1) ו- 300 גרם שמן קוקוס לתוך שני מיכלים נפרדים באמצעות איזון האנליטי.
- חום לכל מכולה בנפרד במיקרוגל, עד התוכן נמס לחלוטין. שופכים שמן קוקוס לתוך המיכל אוכל לעוף. מערבבים בעזרת מקצף עד טוב לערבב את השמן לתוך האוכל לעוף.
הערה: אין גושים של מזון או שמן צריך להיות גלוי. כאשר האוכל לטוס נמס במיקרוגל, להפסיק במרווחים של 1 דקות לערבב את האוכל ולמנוע גולש. - לשקול מחדש את האוכל שומן גבוהה. אם המשקל הכולל פחות מ 1 ק ג (700 גרם מזון + 300 גרם שמן קוקוס), להוסיף מים (כ- 10 מ"ל) כדי לפצות על אידוי בזמן חימום, כדי להחזיר את המשקל 1 ק
- Pour מעורבב היטב 10 מ"ל מזון שמן גבוהה לכל מבחנה (בסביבות 25% נפח המבחנה). בשלב הבא, לכסות עם גזה כדי למנוע זבובים ' זיהום. מגניב לשעה בטמפרטורת החדר ואז להעביר את הבקבוקונים עד 4 ° C עבור אחסון עד כדי 4 שבועות.
הערה: האוכל הרגיל (NF) משמש כמזון שליטה. גם למזוג 10 מ"ל (בסביבות 25% נפח המבחנה) של NF לכל מבחנה. על האוכל HFD להחליף 30% של האוכל NF שמן קוקוס. עבור פקד ותנאים ניסיוני, הזבובים קיבלו את אותה כמות של NF ו- HFD (10 מ"ל של מזון לכל מבחנה).
איור 1 . HFD האכלה דרוזופילה.
ערכת מראה את השלבים האכלה שונים עבור זבובים על בקרת מזון (תזונה נורמלית ללא תוספת של שמן קוקוס-NF) או HFD (עם התוספת של שמן קוקוס). התהליך כולו לוקח 10 ימים אחרי האוסף הראשונית של הזבוב הבוגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
- HFD האכלה של melanogaster ד
הערה: פרוטוקול זה כולל שליטה ואוכל HFD האכלה נהלים התואמים כל קו לעוף. שליטה וזבובים ניסיוני שמים בקבוקונים המכילים את אותו כמות האוכל (NF או HFD).- שימוש CO 2 כדי עזים ומתנגד הזבובים.
הערה: עבור ינוקות, אנא קרא הפניה 21 למבט כולל על גידול וטיפול melanogaster ד. - לאסוף 0-5 בנות יום זבובים בקבוקונים והעברה (על-ידי היפוך) הזבובים לתוך מבחנות החדש שמכילות את NF (חימם בעבר בטמפרטורת החדר). תן לעידן זבובים במשך 5 ימים נוספים-21 מעלות צלזיוס
- בסוף 5 הימים, להוציא את הבקבוקונים המכיל HFD NF מ- 4 מעלות צלזיוס
הערה: כמו זבובים חיים, מתח יכול הטמפרטורות הקרות. תן את הבקבוקונים לשבת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר להתחמם לפני השימוש. - באמצעות מגבונים לחים, לנקות ולהסיר עודפי הנוזלים מן הצדדים של הבקבוקונים.
- הוסף פיסת נייר סינון, קטנה על 1 ס מ x 3 ס"מ, לתוך האוכל השמן גבוהה כדי לספוג את הנוזל העודף.
הערה: שלב זה הוא קריטי עבור מניעת הזבובים נדבקות האוכל HFD. - הבא, העברת הזבובים על האוכל השמן גבוהה (על-ידי היפוך). להניח את הבקבוקונים אופקית בצד שלהם, (לא עומדת) ב 21-22 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים.
הערה: להימנע טמפרטורות גבוהות יותר כמו זה באופן חלקי ממיסים האוכל השמן גבוהה, גורם הזבובים לדבוק המזון ולמות. - לאחר 5 ימים, העברה (על-ידי היפוך) הזבובים מן NF ו- HFD לתוך בקבוקונים חדשים ללא מזון כדי לאפשר את המעיים שלהם ריק במשך 30 דקות. בשלב הבא, להמשיך שקילה הזבובים.
הערה: אחד הצעדים הקריטיים ב הזה HFD האכלה פרוטוקול היא להכין HFD מעורבב היטב, ללא כל נתחי אוכל לעוף או שמן מרוכז. ערבוב הומוגנית וקירור של HFD עד 45-30 ° C, מומלץ, לפני לשפוך לתוך מבחנות ואחסון של האוכל-4 מעלות צלזיוס. לגיל המתאים ההתאמה של שליטה וזבובים ניסיוני חשוב כמו גם תנאים מבוקרים תזונתיים וסביבתיים פריור להאכיל HFD. במהלך שלב האכלה, שליטה וזבובים ניסיוני יש להעניק את אותה כמות של NF ו- HFD. אף פעם לא לאסוף זבובים בקבוקונים צפוף או בקבוקים (כדי למנוע תופעות transgenerational). תמיד שמים מקסימלית של 25 זבובים לכל מבחנה במהלך NF ו- HFD האכלה כדי למנוע הגבלות תזונתיות או אפקטים המתגודדים אחרים. HFD מורכב של שמן קוקוס 30%, ולכן טמפרטורות מעל 22 ° C עלול להמיס חלקית HFD, גורם הזבובים מקל על מזון שומני, מתים. לפני שאת מורחת את הזבובים HFD, לנקות את הבקבוקונים כדי להסיר את כל מזוט ולהוסיף נייר סינון כדי לספוג את כל הנוזלים העודפים במזון. במהלך הדגירה של הזבובים על HFD, הבקבוקונים שכוב על צדם לספק משטח אופקי ללא שומן הזבובים.
- שימוש CO 2 כדי עזים ומתנגד הזבובים.
- במשקל של הזבובים
- עבור כל גנוטיפ ומגדר להיבדק, להשתמש של סולם לאולטרה רגישות כדי לתעד את המשקולות של mL 1.7 מראש שכותרתו וריקה צינורות.
- באמצעות הרדמה לעוף או CO 2, עזים ומתנגד לאסוף זבובים 36 של גנוטיפ באותה, מגדר, ואת האכלה מצב עם מברשת לתוך אחד מראש שקל 1.7 צינור mL-
- שוקל את הצינור המכיל זבובים עם אותו סולם לאולטרה רגישות.
- לקבוע את המשקל הממוצע לטוס בעקבות נוסחה זו:
הערה: המספר של זבובים פרוטוקול זה הוא 36. - פלאש להקפיא את הצינורות 1.7 mL המכילה זבובים על-ידי צולל לתוך חנקן נוזלי עבור 2 דק לאסוף ולשים הצינורות לתיבות. בשלב הבא, להעביר את התיבות-80 מעלות (עדיף טמפרטורה) לאחסון עד לשימוש עם תג וזמינותו.
זהירות: חנקן נוזלי היא בטמפרטורה נמוכה ביותר. נא להשתמש ציוד מגן אישי המתאים.
2. Assay תגים
- הכנת ריכוז רגיל תג
- להכין 500 מ"ל של PBT (PBS 1 X, 0.05% טריטון).
- באמצעות צינורות 0.5 mL, הפתרון תג (טבלה של חומרים), להכין µL 100 של ריק (PBT בלבד) ו- µL 100 של שישה ריכוזים תג רגיל (2 µg/µL µg 1/µL 0.5 µg/µL; 0.25 µg/µL; 0.125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) עם PBT-
- במקום הצינורות על קרח ולהמשיך עם טחינת הזבובים.
- טחינת הזבובים
- להוציא את הזבובים קפוא מ-80 מעלות צלזיוס (שלב 1.3). העברת הצינורות המכילים הזבוב על קרח
- ראשון, מקום 2 מ מ מתכת טחינת כדורים לתוך מתקן כדור 96-ובכן, להשתמש במברשת קטנה להסיר את הביצים נוספת.
- מקום 96-ובכן שהטחינה צלחת הפוכה מעל הכדור dispenser ו הפוך כדי להעביר את הכדורים מתכת ישירות לתוך הלוח שחיקה. צריך להיות כדור אחד לכל טוב.
- בעזרת פיפטה של רב ערוצית, להוסיף µL 600 של PBT לתוך כל שורה של צלחת שחיקה 96-ובכן.
- עם מלקחיים, להוסיף 3 זבובים לכל טוב. ציין את התנאי גנוטיפ, מין ואוכל של הזבובים בכל שורה/היטב של צלחת שחיקה 96-ובכן.
- מקום בחוזקה את הפקקים לצלחת שחיקה 96-ובכן. הקלטת יוטלו על העליונה כדי לוודא שאין זליגת.
- כראוי למקם את הצלחות שחיקה של 96-ובכן לתוך המכונה שחיקה. הגדר את המכונה המהירות הגבוהה ביותר ואת העיתונות " לרוץ " לטחון עם אמו והוריה מינימום 3
- לאחר 3 דקות, תפסיק לשפשף את ולהמשיך עם צלחת צנטריפוגה: centrifuג ' נרל אלקטריק למשך 15 דקות ב g x 4,000, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, לנהל את הצלחת שחיקה בקפידה כדי למנוע ערבוב את תגובת שיקוע עם בגדר.
- טעינה הדגימה ונחישות תוכן תג
- לקחת צלחת 96-ובכן ספקטרופוטומטרים חדש. באמצעות פיפטה של רב ערוצית, לטעון µL 200 מהתרכובת תג לתוך כל שורה של הצלחת-
- µL 20 עומס של PBT לתוך הבאר הראשונה של השורה הראשונה, כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.
- טען 20 µL של כל דילול סטנדרטי (מתוך שלב 2.1.2) לתוך הנותרים הבארות הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.
- באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 20 של תגובת שיקוע מכל שורה של צלחת שחיקה על השורה המתאימה בצלחת ספקטרופוטומטרים 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.
- הבא, הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.
- דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
הערה: אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר את כל הבועות. הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת. - קרא ספיגת של כל טוב של הצלחת ב 550 ננומטר שימוש בקורא תואם microplate. בשלב הבא, לאתר את עקומת סטנדרטי ולקבוע את הריכוז [µg µL] של הדגימות לא ידוע.
- לקביעת כמות התוכן תג לאדם רשע במשקל זבוב, להשתמש בנוסחה הבאה:
הערה: ב פרוטוקול זה, היו 3 זבובים טחון ב- 600 µL של PBT; וכתוצאה מכך האחסון מתכוון לכל זבוב הוא 200 µL.
- Assay ברדפורד, נורמליזציה של תוכן תג עם תכולת החלבון
- להכין 7 µL 100 של אלבומין שור (BSA) דילולים סטנדרטי (75 µg/mL µg 100/mL; µg 150/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1,000 µg/mL) עם PBT-
- לקחת צלחת חדשה 96-ובכן, לטעון µL 200 של ריאגנט ברדפורד X 1 לתוך כל שורה של הצלחת-
- , הבאר הראשונה של השורה הראשונה, להוסיף 10 µL של PBT כדי ליצור ריק. מערבבים על-ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות. בארות
- להוסיף 10 µL של כל דילול סטנדרטי לתוך שאר הראשונים בשורה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. למנוע יצירת בועות.
- באמצעות פיפטה של רב ערוצית, להעביר µL 10 של הזבוב supernatant מכל שורה של צלחת שחיקה אל השורה המתאימה בצלחת 96-ובכן. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. למנוע יצירת בועות.
- הצב תשובה מכשילה גז-חדיר מעל החלק העליון של הלוח 96-ובכן.
- דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. אם יש בועות הבארות, centrifuge את הצלחת למשך 2 דקות ב 2,000 g x כדי להסיר אותם.
הערה: הנוכחות של בועות יפריעו הקריאה ספיגת. - שימוש ספקטרופוטומטרים כדי לקרוא ספיגת של הריק, תקנים ודוגמאות לא ידוע-595 nm. להשתמש העקומה הסטנדרטי לקביעת הריכוזים [µg µL] של הדגימות בכל שורה.
- לנרמל את התג תוכן עם רמת חלבון באמצעות הנוסחה הבאה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ד melanogaster, כפי שקורה עם מינים אחרים, יש דו-צורתיות בין זכרים ונקבות22. זה ידוע כי נשים הם גדולים, עם יותר שומן בתוך הבטן שלהם, מאשר זכרים22. כדי לבדוק את האפקטיביות של פרוטוקול שלנו, נוכל לבצע מבחני תג כדי לקבוע ההבדלים בתוכן התג בין זכרים ונקבות של מעבדה סטנדרטיים wildtype (w1118) יש טיסות. הנתונים מראים כי נקבות יש יותר שומן הגוף כל הזכרים (איור 2א, ב). הנתונים הראו גם כי וזמינותו היא יציבה, עם אין וריאציה תג כימות לאורך זמן (עד 50 דקות לאחר דגירה) ולא שום וריאציה תלוי בגודל דגימה ביולוגית (זבובים 3 או 5).
צריכת HFD הוכח לגרום השמנת יתר-אנוש, העכבר19,20,23. כדי לבדוק את היעילות של פרוטוקול האכלה שלנו, נוכל לבצע מבחני תג עם שלנו HFD ושליטה האכיל נקבות הזבוב. מצאנו כי צריכת HFD ב דרוזופילה גורמת מוגברת השומן שמצטבר בהדרגה לאורך זמן (איור 3A-C). עוד חשוב למצוא היא שאחרי רק 18 h של HFD האכלה (איור 3C), הצלחנו לגרום עלייה משמעותית של שומן בזבובים הללו. ממצאים אלה מראים כי זו מערכת מודל גנטי הוא כלי אידיאלי לחקר מואצת למציאת הרגולטורים הרומן של השמנת יתר HFD-induced.
איור 2 . תג מבחני זכר ונקבה בזבובים.
2 - בן שבועיים זבובים על דיאטה רגילה היו שנאספו, כשהם מקובצים לפי מין (זכרים ונקבות), שקל, התערבבו (3 או 5 זבובים לכל טוב) עבור תג ניתוח. מבחני תג בוצעו בעקבות ההליכים המתוארים במסמך זה. ספיגת של כל מדגם ב 550 ננומטר נקראה בנקודות שונות בזמן-(מינימום 0, 5 דקות, 20 דקות ו 50 min) כדי לקבוע בסופו של דבר תנודות תג כימות, מעל הזמן, שמן תוכן וריאציה בגדלים אוכלוסייה שונות (3 ו- 5 זבובים) של w1118 זבובים, וההבדלים בין תוכן תג זכר ונקבה. התוצאות הראו כי הנקבות לצבור יותר שומן הזכרים (A–B), תג מדידות לא משתנים עד 50 דקות לאחר הדגירה התגובה ב 37 ° C (A–B). כמו כן, הממוצע רמות תגי נותרים ללא שינוי בין מבחני תג באמצעות זבובים 3 או 5 (A–B). הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± סטטיסטיקה ב- SEM: אין הבדל משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . השפעות HFD על הצטברות שומן.
נקבות הזבוב א-ב: 2 - בן שבועיים העלו על רגיל או HFD במשך 5 ימים היו שנאספו, מבחני תג בוצעו כדי לקבוע רמות של שומן. תוכן תג היה מנורמל עם משקל (A) או רמות החלבון (B). הנתונים הראו כי צריכת HFD מוביל תכולת שומן מוגברת עם שתי השיטות של נרמול. C: 2 - בן שבועיים נקבות הזבוב ממזון רגיל/בקרה (NF) ו- h 18, 1 יום או יומיים על HFD הם לבדיקה עבור תוכן תג. התוצאות מציגות עלייה הדרגתית ומשמעותית של רמות תג מ 18 h 2 ימים של חשיפה HFD. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± סטטיסטיקה ב- SEM: סטודנט-t-test. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השמנת יתר אינדוקציה בעכברים יכול לקחת חודשים19,20. בזבובים, זו HFD האכלה הפרוטוקול מאפשר אינדוקציה של עודף הצטברות שומן תוך מספר ימים או פחות, גורם מגביר הצטברות שומן רק לאחר 18 h (ראה איור 2). HFD האכלה עם פרוטוקול המתואר גלוקוז תוכן 12 עליות וירידות Bmm ליפאז ו PGC-1 ביטוי24. זאת בניגוד צום של מבוגרים דרוזופילה הגורמת לירידה מהירה fat ו גלוקוז תוכן25,26 ו Bmm מוגברת ביטוי24. כמו כן, העלאת רמות Bmm או PGC-1 מגן מפני השמנת יתר הנגרמת HFD14,24. בעוד 30% HFD נעשה שימוש ב פרוטוקול זה, להאכיל את הזבובים עם 3%, 7% או 15% שומן לדיאטה השמנה המושרה תלוי במינון אופנה12, כמו גם הגדלת משך HFD האכלה (איור 3). מצאנו גם כי האכלה חומצות שומן אחד המרכיבים העיקריים של שמן קוקוס, קרי, חומצה lauric 14% או 5% חומצה מיריסטית, גורם משמעותי גבוהות הצטברות שומן12.
התגובה מטבולית מואץ עם אלה זבובים על משטר HFD הוא מתואם עם תוחלת החיים מופחתת27 כפי שנצפתה יונקים28, אבל > 80% של הזבובים שורדים 20 ימים HFD27. אינדוקציה מהירה של הצטברות שומן מתווך על ידי תהליכים תאית ומולקולרית שנשמרת שליטה השומנים, מטבוליזם הגלוקוז יש יתרון למחקרים רבים הקשורים להשמנה, כגון סוכרת או lipotoxic של שריר הלב10, 12,13,14,15,16. הממצאים העיקריים בההשלכות של חוסר איזון מטבולי, הקשורה בתפקוד הלב יאפשר סביר השוואתי translational בבני אדם.
HFD האכלה פרוטוקול מתאים לשימוש עם דרוזופילה מינים וחרקים דגמים אחרים המשתפים דיאטות דומה עם melanogaster ד. זה HFD האכלה פרוטוקולים יכול להתאים כראוי עבור האורגניזם כמו C. elegans , או גם חרקים אחרים שדורשים מדיה מזון 'נורמאלי' שונים. את ה-30 אחוז ש-HFD אינו מתאים להשתמש בניסויים הדורש טמפרטורות גבוהות; עם זאת, ריכוז מופחתת של שמן קוקוס או חומצות שומן יחיד יכול להיות חלופות נאותה12.
פרוטוקול תג זה מבוסס על PBS, מאגר רעיל זה מאפשר טיפול קל וניסוי בלי גג fume, בניגוד ל בעבר בשימוש ממיסים אורגניים (מתנול/הכלורופורם או דיאתיל אתר) השומנים החילוץ, כימות15 , 29 , 30. יתרון נוסף של מאגר זה הוא כי זה ניתן לנרמל את רמות תג לחלבון תוכן המבוסס על homogenate הראשוני אותו, ביצוע קביעת השמן דגימות רקמה קטנה הזדמנויות חדשות הצעה וברות בקלות ללמוד עוגב צולבות לדבר בהומאוסטזיס מטבולית organismal. כמו כן, homogenate אותו לעוף הראשונית שהושג לאחר שחיקה, יכול לשמש לביצוע מבחני גלוקוז גליקוגן מקבילים, מאפשר המחקר של שינויים בחילוף החומרים השומנים וגם גלוקוז בין דגימות ביולוגיות זהה. פרוטוקול זה תג הוא פחות מייגעת או אורכת זמן רב יותר הקודם פרוטוקולים15,29,30, היא גבוהה למדי תפוקת, באמצעות תבנית 96-ובכן זה מאפשר בדיקה מהירה של קרוב 100 דגימות בתוך שעה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לכמת את תכולת שומן תחת תנאים תזונתיים אחרים, כולל סוכר גבוה דיאטה13,31, הגבלת תזונה ורעב, וכן ללימודי הזדקנות להבין שינויים הקשורים גיל ב חילוף החומרים של השומן.
השמנת יתר, תסמונת מטבולית, פתולוגיות הקשורות הם הגיע לשיא עם השלכות הרסניות על בריאות האדם1,2. את הפרוטוקול HFD משולב ואת התפוקה גבוהה לתייג assay להציע פלטפורמה ייחודית לשימוש מודל אורגניזמים, כגון דרוזופילה, לזירוז במהירות את השמנת יתר, מסך עבור גורמים גנטיים, או תרכובות כימיות טבעיים וסינתטיים, טוב יותר להבין חוסר איזון מטבולי. בסופו של דבר זה אולי תורמים רבות לקידום של התגליות המדעיות לפיתוח טיפולים חדשים או תרופות למחלות מטבוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אריקה טיילור עבור עריכת כתב היד הזה. עבודה זו מומן על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (P01 HL098053, P01 AG033561 ו- R01 HL054732) כדי R.B., תוספת מחקר פוסט דוקטורט (R01 HL085481), מלגת (AAUW) S.B.D., מענקים של איגוד הלב האמריקני S.B.D. ואני חוזר לבסיס
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
