Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

उच्च वसा आहार खिलाने और उच्च प्रवाह Triacylglyceride परख में Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017 doi: 10.3791/56029
Automatic Translation
1, 1, 1
1Development, Aging and Regeneration Program, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

Summary

यह एक उच्च वसा आहार खिला प्रोटोकॉल को Drosophilaमें मोटापे के लिए प्रेरित है, बुनियादी आणविक lipotoxicity में फंसा तंत्र को समझने के लिए एक मॉडल । यह भी विभिंन आहार, पर्यावरणीय, आनुवंशिक या शारीरिक स्थितियों के तहत Drosophila और संभावित अंय (कीट) मॉडल में वसा संचय को मापने के लिए एक उच्च प्रवाह triacylglyceride परख प्रदान करता है ।

Abstract

हृदय रोग दुनिया भर में मानव मृत्यु का नंबर एक कारण है । कई अध्ययनों से मनुष्य में मोटापा और हृदय खराबी के बीच मजबूत कनेक्शन दिखाया गया है, लेकिन अधिक उपकरण और अनुसंधान के प्रयासों को बेहतर स्पष्ट शामिल तंत्र की जरूरत है । एक सदी से अधिक के लिए, Drosophila के आनुवंशिक रूप से अत्यधिक असभ्य मॉडल महत्वपूर्ण जीन और आणविक रास्ते की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है कि अत्यधिक प्रजातियों में संरक्षित किया जा साबित कर दिया । कई जैविक प्रक्रियाओं और रोग तंत्र कार्यात्मक रूप से मक्खी में संरक्षित हैं, जैसे विकास (जैसे, शरीर की योजना, दिल), कैंसर, और neurodegenerative रोग । हाल ही में, मोटापा और माध्यमिक विकृतियों के अध्ययन, जैसे कि मॉडल जीवों में हृदय रोग, मानव में चयापचय सिंड्रोम में शामिल प्रमुख नियामकों की पहचान में एक अत्यंत महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।

यहां, हम एक कुशल उपकरण के रूप में इस मॉडल जीव का उपयोग करने के लिए मोटापा प्रेरित है, अर्थात्, अत्यधिक वसा संचय, और एक कुशल को टैग संचय के रूप में वसा सामग्री की निगरानी प्रोटोकॉल विकसित करने का प्रस्ताव । अत्यधिक संरक्षण के अलावा, लेकिन कम जटिल जीनोम, मक्खी भी तेजी से प्रयोग के लिए एक छोटी उंर है, लागत प्रभावशीलता के साथ संयुक्त । इस कागज उच्च वसा आहार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है (HFD) में खिला के लिए मोटापे और एक उच्च प्रवाह triacylglyceride (टैग) वसा सामग्री में संबद्ध वृद्धि को मापने के लिए परख, उद्देश्य के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि और बड़े पैमाने पर आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए कुशल । ये प्रोटोकॉल मोटापे में शामिल नियामक तंत्र की कुशलता से जांच करने के लिए नए अवसर प्रदान करते हैं, साथ ही विकास पर दवा उम्मीदवारों के प्रभाव के तेजी से परीक्षण के लिए दवा खोज अनुसंधान के लिए एक मानकीकृत मंच प्रदान करते हैं या मोटापा, मधुमेह और संबंधित चयापचय रोगों की रोकथाम.

Introduction

हम एक समय में कर रहे है जहां मोटापा, और उससे जुड़े आर्थिक बोझ, एक विश्वव्यापी समस्या है1। हर तीन अमेरिकियों से बाहर दो अधिक वजन या मोटापे से संबंधित दिल विकृतियों के साथ कर रहे हैं, वयस्क आबादी के भीतर मौत का प्राथमिक कारण2. नई कुशल तरीकों को पर्याप्त रूप से आनुवंशिक और आणविक मॉडल जीवों का उपयोग चयापचय सिंड्रोम के विनियमन में फंसा घटकों की जांच की जरूरत है । इस कारण से, हम फल मक्खी Drosophila मॉडल चुनते हैं क्योंकि यह स्तनधारियों के साथ सबसे बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं को साझा करता है, जिसमें चूहों और मनुष्यों को3,4,5,6शामिल हैं । Drosophilaके जीनोम अत्यधिक विकास के दौरान संरक्षित है, लेकिन कुल मिलाकर बहुत कम जीन दोहराव और चयापचय जटिलता के साथ छोटे, यह मौलिक कई मानव रोगों में फंसा तंत्र को समझने के लिए आदर्श बना4 , 7 , 8. इसके अलावा, विशेषता वसा ऊतक द्वारा किए गए प्रक्रियाओं, आंत और अग्ंयाशय मक्खी में प्रतिनिधित्व कर रहे है और ग्लूकोज और लिपिड चयापचय में विनियामक कार्यों मध्यस्थता, उदाहरण के लिए, कि मनुष्यों के समान हैं9, 10,11. इसके अलावा, मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध और मनुष्यों में मधुमेह के नियंत्रण में शामिल बुनियादी आणविक मार्ग कार्यात्मक रूप से Drosophila melanogasterमें संरक्षण कर रहे हैं12,13,14 , 15 , 16. उच्च जीवों की तरह, Drosophila एक धड़कन दिल है कि स्तनधारी दिल3,17की है कि इसी तरह की प्रक्रियाओं के द्वारा विकास के दौरान गठन किया है । इस प्रकार, एक विश्वसनीय HFD खिला प्रोटोकॉल और उच्च प्रवाह टैग परख के विकास, कुशल स्क्रीनिंग के आनुवंशिक उपकरण बॉक्स का उपयोग कर प्रयोजनों के लिए अनुकूलित Drosophila, एक महत्वपूर्ण का अध्ययन करने के लिए और बुनियादी आनुवंशिक आधार को समझने का मतलब प्रदान अंतर्निहित जटिल चयापचय रोगों ।

HFD भोजन ही एक मानक प्रयोगशाला से बना है नारियल तेल के साथ पूरक खाद्य मक्खी, जो ज्यादातर संतृप्त फैटी एसिड के लिए जाना जाता है चयापचय सिंड्रोम के साथ जुड़े18से बना है । जबकि स्तनधारी मॉडल में मोटापा उत्प्रेरण, ऐसे कुतर के रूप में, महीने में19,20ले सकते हैं, हमारे अनुकूलित HFD Drosophila में खिला प्रोटोकॉल प्रभावी ढंग से और reproducibly के एक मामले में जीव वसा सामग्री बढ़ जाती है दिन12,14। एक उच्च प्रवाह टैग परख के साथ संयोजन के रूप में इस प्रोटोकॉल, आनुवंशिक कारकों के प्रभाव के लिए कुशल जन स्क्रीनिंग की अनुमति देता है, पर्यावरणीय प्रभावों और दवा उंमीदवारों वसा चयापचय के नए मॉडुलन खोजने के लिए । परिणाम में, इन प्रोटोकॉल की संभावना को समझने और/या मुकाबला मोटापा और मोटापे से जुड़े मानव विकृतियों ।

खिला प्रोटोकॉल बहुमुखी है और एक संतृप्त या unसंतृप्त फैटी एसिड के चयापचय और कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । इस उच्च प्रवाह टैग परख का उपयोग melanogasterतक ही सीमित नहीं है, लेकिन छल्ली या कठिन extracellular मैट्रिक्स के साथ छोटे मॉडल जीवों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे, अंय Drosophila प्रजातियों, सी. एलिगेंस और अंय उभरते invertebrate मॉडल जीवों) विकास, वयस्कता या चयापचय रोग के चरण के किसी भी स्तर पर, विभिंन पर्यावरणीय, आनुवंशिक या शारीरिक स्थितियों के तहत वसा सामग्री को मापने के लिए । टैग परख एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के एक वर्णमिति माप पर आधारित है कि मुक्त फैटी एसिड, ग्लिसरॉल, ग्लिसरॉल 3-फॉस्फेट और अंत में एच2हे2 में टैग नीचा है कि 4 के साथ प्रतिक्रिया-aminoantipyrine (4-AAP) और 3, 5- dichloro-2-hydroxybenzene sulfonate (3, 5 DHBS) एक लाल रंग का उत्पाद है कि एक ९६-अच्छी तरह से spectrophotometer का उपयोग कर मापा जाता है उत्पादन करने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. HFD feeding प्रोटोकॉल

< p class = "jove_content" > < img alt = "तालिका 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg"/>
तालिका 1. फ्लाई फूड रेसिपी.
यह तालिका हमारे नियंत्रण भोजन तैयार करने के लिए प्रयुक्त विभिन्न अवयवों को सारांशित करती है । एक बार बनाया, भोजन के 10 मिलीलीटर शीशियों में डाल दिया है, ठंडा और संग्रहीत 4 & #176 पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए सी;

  1. HFD वडा
    1. । 1 किलो हाई फैट फूड बनाने के लिए, पहले से बने सामान्य फ्लाई फूड का ७०० ग्राम (देखें Table 1 ) और एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर दो अलग-अगल कंटेनरों में नारियल तेल की ३०० ग्राम ।
    2. माइक्रोवेव में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक कंटेनर गर्मी, जब तक सामग्री पिघल पूरी तरह से । फ्लाई फूड कंटेनर में नारियल का तेल डाल दें । एक मूंछ का उपयोग कर हलचल जब तक तेल अच्छी तरह से मक्खी भोजन में मिलाया जाता है ।
      नोट: भोजन या तेल का कोई हिस्सा दिखाई नहीं देना चाहिए । जब मक्खी खाना माइक्रोवेव में पिघल रहा है, 1 मिनट के अंतराल पर रोकने के लिए भोजन मिश्रण और अधिक उबलते को रोकने के ।
    3. पुन: उच्च वसा वाले भोजन का वजन । यदि कुल वजन 1 किलो से कम है (७०० ग्राम नारियल तेल का ३०० ग्राम), ताप के दौरान वाष्पीकरण की क्षतिपूर्ति के लिए पानी (लगभग 10 मिलीलीटर) डालें और 1 किलो वजन वापस लाने के लिए ।
    4. के बारे में 10 मिलीलीटर अच्छी तरह से मिश्रित उच्च वसा वाले भोजन (शीशी मात्रा के 25% के आसपास) डालना । अगला, मक्खियों को रोकने के लिए जाली के साथ कवर & #39; संदूषण । कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए शांत फिर 4 सप्ताह तक भण्डारण के लिए 4 & #176; C तक शीशियों का अंतरण.
      नोट: सामांय भोजन (NF) एक नियंत्रण भोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है । इसके अलावा प्रति शीशी NF की 10 मिलीलीटर (शीशी मात्रा के 25% के आसपास) डालना । HFD भोजन के लिए, नारियल तेल के साथ NF भोजन के 30% की जगह । नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों के लिए, मक्खियों NF और HFD (प्रति शीशी भोजन के 10 मिलीलीटर) की एक ही राशि दी गई ।
< p class = "jove_content" > < img alt = "figure 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg"/>
< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ . HFD पिलाना मे Drosophila .
योजना एक नियंत्रण भोजन पर मक्खियों के लिए अलग खिला कदम (नारियल तेल के अलावा बिना सामांय आहार NF) या HFD (नारियल तेल के अलावा के साथ) से पता चलता है । पूरी प्रक्रिया वयस्क मक्खियों के प्रारंभिक संग्रह के बाद 10 दिन लगते हैं । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • HFD फीडिंग ऑफ डी. melanogaster
    नोट: इस प्रोटोकॉल नियंत्रण खाद्य और HFD खिला प्रक्रियाओं है कि किसी भी मक्खी लाइन के साथ संगत कर रहे हैं शामिल हैं । नियंत्रण और प्रयोगात्मक मक्खियों एक ही राशि भोजन (NF या HFD) युक्त शीशियों में डाल रहे हैं ।
    1. उपयोग कं 2 मक्खियों को anesthetize करने के लिए.
      नोट: neophytes के लिए, कृपया संदर्भ को पढ़ें < सुप वर्ग = "xref" > 21 की स्थापना और हैंडलिंग पर अवलोकन के लिए D. melanogaster .
    2. (पहले कमरे के तापमान पर गर्म) NF युक्त नई शीशियों में मक्खियों (flipping द्वारा) शीशियों और स्थानांतरण से 0-5 दिन पुरानी मक्खियों इकट्ठा । 5 अतिरिक्त दिनों के लिए मक्खियों की आयु 21 पर दें & #176; C.
      3. 5 दिन के अंत में
    3. , 4 & #176 से HFD और NF युक्त शीशियों को बाहर निकाल लें; C.
      नोट: के रूप में ठंडा तापमान रहने वाले मक्खियों तनाव कर सकते हैं, दो शीशियों कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बैठने के लिए उपयोग करने से पहले गर्म ।
    4. का उपयोग कर पोंछे, साफ और शीशियों के किनारों से अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें ।
    5. फिल्टर कागज का एक छोटा सा टुकड़ा डालने के लिए, के बारे में 1 सेमी एक्स 3 सेमी, उच्च वसा भोजन में किसी भी अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए.
      नोट: यह कदम मक्खियों को HFD भोजन से चिपके रहने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    6. अगले, उच्च वसा वाले भोजन पर मक्खियों हस्तांतरण (flipping द्वारा) । शीशियों को क्षैतिज रूप से उनके पक्ष में रखना, (खड़े नहीं) 21-22 & #176 पर 5 दिनों के लिए C.
      नोट: उच्च तापमान से बचने के रूप में इस आंशिक रूप से उच्च वसा वाले भोजन को पिघला कर सकते हैं, मक्खियों के कारण के लिए भोजन करने के लिए छड़ी और मर जाते हैं ।
    7. 5 दिनों के बाद, स्थानांतरण (flipping द्वारा) NF और HFD से मक्खियों को भोजन के बिना नई शीशियों में 30 मिनट के लिए खाली करने के लिए अपनी हिंमत अनुमति देते हैं । आगे, मक्खियों का वजन करने के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: इस HFD खिला प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में से एक एक अच्छी तरह से मिश्रित HFD, फ्लाई खाद्य या गाढ़ा तेल के किसी भी हिस्से से मुक्त तैयार करने के लिए है । समरूप मिश्रण और ठंडा करने के लिए HFD को 45-30 & #176; ग उचित है, शीशियों में डालने से पहले और 4 & #176 पर भोजन का भंडारण; c. नियंत्रण और प्रायोगिक मक्खियों के उचित आयु मिलान के साथ ही नियंत्रित पोषण और पर्यावरण की स्थिति के रूप में महत्वपूर्ण है पहले को HFD खिलाई । खिला चरण के दौरान, नियंत्रण और प्रयोगात्मक मक्खियों NF और HFD की एक ही राशि दी जानी चाहिए । भीड़ शीशियों या बोतलों से मक्खियों इकट्ठा कभी नहीं (transgenerational प्रभाव से बचने के लिए) । हमेशा NF और HFD आहार प्रतिबंध या अंय भीड़ प्रभाव से बचने के लिए खिलाने के दौरान प्रति शीशी 25 मक्खियों की एक अधिकतम डाल दिया । HFD 30% नारियल तेल से बना है, इस प्रकार तापमान 22 से ऊपर & #176; सी आंशिक रूप से HFD पिघल सकता है, मक्खियों के कारण तेल खाने पर चिपके रहते है और मर जाते हैं । HFD पर मक्खियों डालने से पहले, किसी भी अवशिष्ट तेल को हटाने और भोजन में किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को अवशोषित करने के लिए एक फिल्टर कागज डालने के लिए शीशियों साफ । HFD पर मक्खियों की गर्मी के दौरान, शीशियों मक्खियों के लिए एक वसा मुक्त क्षैतिज सतह प्रदान करने के लिए उनके पक्ष पर रखी हैं ।
  • तौल मक्खियों
    1. प्रत्येक जीनोटाइप और लिंग के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए, एक अति संवेदनशील पैमाने का उपयोग करने के लिए पूर्व लेबल, खाली १.७ मिलीलीटर ट्यूबों के वजन रिकॉर्ड ।
    2. का उपयोग फ्लाई संवेदनाहारी या CO 2 , anesthetize और एक ब्रश के साथ एक पूर्व-तौला १.७ मिलीलीटर ट्यूब में एक ही जीनोटाइप, लिंग, और खिला स्थिति के ३६ मक्खियों इकट्ठा ।
    3. एक ही अति संवेदनशील पैमाने के साथ मक्खियों युक्त ट्यूब तौलना ।
    4. इस फार्मूले के बाद औसत मक्खी वजन निर्धारित:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg"/>
      नोट: इस प्रोटोकॉल में मक्खियों की संख्या ३६ है.
    5. फ्लैश १.७ मिलीलीटर ट्यूबों तरल नाइट्रोजन में बढ़नेवाला द्वारा मक्खियों युक्त 2 मिनट के लिए जमा और बक्से में ट्यूबों डाल दिया । इसके बाद, बक्से को हस्तांतरित करें-८० & #176; सी (भंडारण के लिए बेहतर तापमान) टैग परख के साथ उपयोग तक ।
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन एक अत्यंत कम तापमान पर है । कृपया उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक गियर का उपयोग करें ।
    • < p class = "jove_title" > 2. टैग परख

    1. टैग मानक सांद्रता की तैयारी
      1. तैयार ५०० मिलीलीटर की PBT (पंजाबियों 1x, ०.०५% ट्राइटन) ।
        2. ०.५ मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग
      2. और टैग समाधान ( Table of सामग्री ), तैयार १०० & #181; L of blank (PBT केवल) and १०० & #181; छह मानक टैग सांद्रता के l (2 & #181; g/& #181; l; 1 & #181; g/& #181; l; ०.५ & #181; g/& #181; l; ०.२५ & #181; g/& #181; l; ०.१२५ & #181; g/& #181; L; ०.०६२५ & #181; g/& #181; L) PBT.
        3. के साथ
      3. बर्फ पर ट्यूबों जगह और मक्खियों पीसने के साथ आगे बढ़ना ।
    2. पीस मक्खियों
      1. बाहर ले जमे हुए मक्खियों से-८० & #176; ग (चरण १.३) । बर्फ पर मक्खियों युक्त ट्यूबों हस्तांतरण.
      2. पहले, प्लेस 2 मिमी धातु एक ९६-अच्छी तरह से गेंद मशीन में पीसने गेंदों, एक छोटी तूलिका का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त गेंदों को हटा दें ।
      3. प्लेस ९६-अच्छी तरह से प्लेट पीस गेंद मशीन के शीर्ष पर उल्टा और धातु गेंदों स्थानांतरण सीधे पीसने की थाली में फ्लिप । अच्छी तरह से प्रति एक गेंद होना चाहिए ।
        4. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर
      4. , ६०० & #181 जोड़ने के लिए, ९६ के प्रत्येक पंक्ति में PBT के एल-अच्छी तरह से पीसने की थाली.
        5. संदंश के साथ
      5. , प्रति अच्छी तरह से 3 मक्खियों जोड़ें । जीनोटाइप, लिंग और प्रत्येक पंक्ति में मक्खियों के भोजन की स्थिति/९६-अच्छी तरह से पीसने की थाली का संकेत ।
      6. कसकर ९६ पर टोपियां प्लेस-प्लेट पीसने अच्छी तरह से । टेप शीर्ष पर रखा जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए कि वहां कोई रिसाव है ।
      7. ठीक से ९६-अच्छी तरह से पीसने की मशीन में प्लेट पीस जगह है । मशीन को उच्चतम गति से सेट करें और दबाएँ & #34; run & #34; 3 min.
        8. के लिए मक्खियों को पीसने के लिए
      8. 3 मिनट के बाद, पीस बंद करो और प्लेट केंद्रापसारक के साथ आगे बढ़ना: centrifuजीई के लिए 15 मिनट में ४,००० x g, 4 & #176; C. केंद्रापसारक के बाद, पीसने की थाली सावधानी से प्रबंधित करने के लिए गोली के साथ supernatant मिश्रण से बचें ।
    3. नमूना लोड हो रहा है और टैग सामग्री निर्धारण
      1. एक नया ९६-अच्छी तरह से spectrophotometer प्लेट ले लो । एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करना, लोड २०० & #181, प्लेट की प्रत्येक पंक्ति में टैग रिएजेंट के एल.
      2. लोड 20 & #181; PBT के एल पहली पंक्ति के पहले कुआं में, एक रिक्त बनाने के लिए । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । बुलबुले बनाने से बचें ।
      3. लोड 20 & #181; प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के एल (कदम 2.1.2 से) पहली पंक्ति के शेष कुओं में और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण. बुलबुले बनाने से बचें ।
        4. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग
      4. , हस्तांतरण 20 & #181; ९६-वेल spectrophotometer प्लेट में इसी पंक्ति को पीस प्लेट की प्रत्येक पंक्ति से supernatant के एल. पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । बुलबुले बनाने से बचें ।
      5. अगले, एक गैस-९६-अच्छी तरह से थाली के शीर्ष पर पारगंय पंनी जगह है ।
      6. मशीन पर प्लेट ३७ & #176; ग के लिए 10 min.
        नोट: यदि कुओं में बुलबुले हैं, २,००० एक्स जी में 2 मिनट के लिए प्लेट केंद्रापसारक सभी बुलबुले को दूर करने के लिए । बुलबुले की उपस्थिति अवशोषित पढ़ने के साथ हस्तक्षेप करेंगे ।
      7. एक संगत microplate रीडर का उपयोग कर ५५० एनएम पर थाली के प्रत्येक कुआं के अवशोषण पढ़ें । अगले, मानक वक्र का पता लगाने और एकाग्रता का निर्धारण [& #181; g/& #181; L] अज्ञात नमूनों की.
      8. मतलब मक्खी वजन टैग सामग्री की मात्रा निर्धारित करने के लिए, निम्न सूत्र का उपयोग करें:
        < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg"/>
        नोट: इस प्रोटोकॉल में, 3 मक्खियों ६०० में भरती थे & #181; l of PBT; परिणाम में, मक्खी प्रति माध्य मात्रा २०० & #181 है; l.
    4. ब्रैडफोर्ड परख और प्रोटीन सामग्री के साथ टैग सामग्री के सामान्यीकरण
      1. तैयार ७ १०० & #181; के एल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) मानक कमजोर पड़ने (७५ & #181; g/ml; १०० & #181; g/मब; १५० & #181; g/ml; २०० & #181; g/मब; २५० & #181; g/mL; ५०० & #181; g/mL; १,००० & #181; g/mL) PBT.
        2. के साथ
      2. एक नया ९६-अच्छी तरह से प्लेट ले लो और लोड २०० & #181; L 1x ब्रैडफोर्ड एजेंट की प्रत्येक पंक्ति में प्लेट.
      3. प्रथम पंक्ति के प्रथम well में, एक रिक्त बनाने के लिए PBT के 10 & #181; L जोड़ें । ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स । बुलबुले बनाने से बचें ।
      4. जोड़ 10 & #181; पहली पंक्ति के बचे हुए कुओं में प्रत्येक मानक कमजोर पड़ने के एल और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । बुलबुले बनाने से बचें ।
        5. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर
      5. , हस्तांतरण 10 & #181; एल पीस प्लेट की प्रत्येक पंक्ति से ९६ में इसी पंक्ति में अच्छी तरह से उड़ान supernatant की थाली । पिपेट ऊपर और नीचे अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । बुलबुले बनाने से बचें ।
      6. जगह एक गैस ९६-अच्छी तरह से थाली के शीर्ष पर पारगंय पंनी ।
      7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन । अगर वहां कुओं में बुलबुले हैं, २,००० x g पर 2 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक उंहें हटाने के लिए ।
        नोट: बुलबुले की उपस्थिति अवशोषित पढ़ने के साथ हस्तक्षेप करेंगे ।
      8. ५९५ एनएम में रिक्त, मानक और अज्ञात नमूनों के अवशोषण को पढ़ने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें । प्रत्येक पंक्ति में नमूनों की सांद्रता [& #181; g/& #181; L] का निर्धारण करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करें ।
      9. निम्न सूत्र का उपयोग करके प्रोटीन स्तर के साथ टैग सामग्री को सामान्य करें:
        < img alt = "समीकरण 3" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg"/>

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    D. melanogasterमें, के रूप में अंय प्रजातियों के साथ मामला है, वहां पुरुषों और महिलाओं के बीच यौन dimorphism है22। यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि महिलाओं को बड़े होते हैं, उनके पेट में अधिक वसा के साथ,22पुरुषों की तुलना में. हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता का परीक्षण करने के लिए, हम टैग परख के लिए पुरुषों और मानक प्रयोगशाला wildtype (डब्ल्यू१११८) मक्खियों की महिलाओं के बीच टैग सामग्री में मतभेद का निर्धारण किया । आंकड़ों से पता चलता है कि महिलाओं को अपने पुरुष समकक्षों से अधिक पूरे शरीर में वसा है (चित्रा 2ए, बी) । डेटा भी पता चला है कि परख स्थिर है, समय पर ठहराव टैग में कोई बदलाव के साथ (५० मिनट के लिए गर्मी के बाद) और कोई भिंनता जैविक नमूना आकार पर निर्भर करता है (3 या 5 मक्खियों) ।

    HFD खपत मानव और माउस19,20,23में मोटापे का कारण दिखाया गया है । हमारे खिला प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, हम अपने HFD और नियंत्रण फेड महिला मक्खियों के साथ टैग परख प्रदर्शन किया । हमने पाया है कि Drosophila में HFD की खपत वसा सामग्री है कि उत्तरोत्तर समय पर जमा (चित्रा 3ए सी) का कारण बनता है । एक अंय महत्वपूर्ण खोज है कि केवल 18 HFD खिला (चित्रा 3सी) के एच के बाद, हम इन मक्खियों में वसा सामग्री की एक महत्वपूर्ण वृद्धि पैदा कर रहे थे । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि इस आनुवंशिक मॉडल प्रणाली HFD-प्रेरित मोटापे के उपंयास नियामकों को खोजने में त्वरित अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण है ।

    Figure 2
    चित्र 2 . पुरुष और मादा मक्खियों में टैग परख ।
    2 सप्ताह पुराने एक सामांय आहार पर मक्खियों एकत्र किए गए, सेक्स (पुरुषों और महिलाओं), तौला और जमीन ऊपर (3 या 5 मक्खियों के अनुसार) टैग विश्लेषण के लिए द्वारा समूहीकृत । टैग परख इस पत्र में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद प्रदर्शन किया गया । ५५० एनएम में प्रत्येक नमूने के अवशोषण अलग समय पर पढ़ा था-अंक (0 मिनट, 5 मिनट, 20 मिनट और ५० मिनट) के लिए समय के साथ टैग ठहराव में अंतिम उतार चढ़ाव निर्धारित करते हैं, विभिंन जनसंख्या आकार में वसा सामग्री भिंनता (3 और 5 मक्खियों) w१११८ के मक्खियों, और पुरुष और महिला टैग सामग्री के बीच मतभेद । परिणाम से पता चला है कि महिलाओं को अपने पुरुष समकक्षों से अधिक वसा जमा (ए-बी), टैग मापन ५० मिनट के लिए उतार चढ़ाव नहीं है ३७ डिग्री सेल्सियस (एक-बी) में प्रतिक्रिया मशीन के बाद । इसके अलावा, मतलब टैग स्तर टैग परख 3 या 5 मक्खियों (A-B) का उपयोग कर के बीच अपरिवर्तित रहते हैं । डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM । सांख्यिकी: कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Figure 3
    चित्र 3 . वसा संचय पर HFD के प्रभाव ।
    a-B: 2 सप्ताह पुराने महिला मक्खियों के लिए एक सामांय या HFD पर उठाया 5 दिन और एकत्र टैग परख वसा के स्तर को निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया गया । टैग सामग्री या तो वजन (एक) या प्रोटीन के स्तर (ख) के साथ सामान्यीकृत किया गया । डेटा से पता चला है कि HFD उपभोग सामान्यता के दोनों तरीकों के साथ वसा की बढ़ती सामग्री की ओर जाता है. C: 2 सप्ताह पुरानी महिला पर मक्खियों सामांय/नियंत्रण खाद्य (NF) और 18 ज, 1 दिन या 2 दिन HFD पर टैग सामग्री के लिए परख रहे हैं । परिणाम HFD के लिए जोखिम के 2 दिनों के लिए 18 घंटे से टैग के स्तर के एक महत्वपूर्ण और प्रगतिशील वृद्धि दिखाते हैं । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सांख्यिकी: छात्र टी-टेस्ट । * p & #60; ०.०५, * * p & #60; ०.०१, * * * p & #60; ०.००१. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    चूहों में मोटापा प्रेरण महीने19,20ले सकते हैं । मक्खियों में, इस HFD खिला प्रोटोकॉल दिन या उससे कम के एक मामले में अतिरिक्त वसा संचय की प्रेरण के लिए अनुमति देता है, केवल 18 घंटे के बाद वसा संचय में वृद्धि के कारण ( चित्रा 2देखें) । वर्णित प्रोटोकॉल के साथ HFD फीडिंग से ग्लूकोज की सामग्री 12 बढ़ जाती है और बीएमएम lipase और PGC-1 अभिव्यक्ति24घट जाती है । यह वयस्क Drosophila के उपवास के विपरीत है कि दोनों वसा और ग्लूकोज की सामग्री में तेजी से कमी का कारण बनता है25,26 और बढ़ बीएमएम अभिव्यक्ति24. इसके अलावा, उंनयन बीएमएम या PGC-1 स्तर HFD प्रेरित मोटापा14,24के खिलाफ बचाता है । जबकि 30% HFD इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है, 3% के साथ मक्खियों खिला, 7%, या 15% वसा आहार एक खुराक में मोटापे प्रेरित-निर्भर फैशन12, के रूप में HFD खिला की अवधि में वृद्धि करता है (चित्रा 3) । हमने यह भी पाया कि नारियल के तेल के मुख्य घटकों में से एक फैटी एसिड खिला, अर्थात, 14% लॉरिक एसिड या 5% myristic एसिड, काफी ऊंचा वसा संचय12का कारण बनता है ।

    एक HFD आहार पर इन मक्खियों के साथ त्वरित चयापचय प्रतिक्रिया एक कम उम्र के27 के रूप में स्तनधारियों में मनाया28के साथ संबंधित है, लेकिन & #62; मक्खियों का ८०% पिछले HFD27पर 20 दिनों के जीवित रहते हैं । वसा संचय की तेजी से प्रेरण के संरक्षण के द्वारा मध्यस्थता सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित लिपिड और ग्लूकोज चयापचय कई मोटापे से संबंधित अध्ययन के लिए लाभप्रद है, ऐसे मधुमेह या lipotoxic cardiomyopathy के रूप में10, 12,13,14,15,16. चयापचय असंतुलन और संबंधित हृदय रोग के परिणामों में मुख्य निष्कर्षों की संभावना मानव में तुलनात्मक अनुवाद अध्ययन की अनुमति होगी ।

    HFD खिला प्रोटोकॉल अंय Drosophila प्रजातियों और कीड़ों मॉडल है कि शेयर डी. melanogasterके साथ इसी तरह के आहार के साथ प्रयोग के लिए संगत है । इस HFD खिला प्रोटोकॉल उचित रूप में सी एलिगेंस या भी अंय कीड़ों कि अलग ' सामांय ' खाद्य मीडिया की आवश्यकता की तरह जीव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । 30% HFD उच्च तापमान की आवश्यकता प्रयोग में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है; हालांकि, नारियल तेल या एक फैटी एसिड की कम सांद्रता पर्याप्त विकल्प12हो सकता है ।

    इस टैग प्रोटोकॉल पंजाबियों पर आधारित है, एक गैर विषैले बफर कि आसान हैंडलिंग और प्रयोग की अनुमति देता है एक धुएं हुड के बिना, इसके विपरीत में पहले इस्तेमाल किया कार्बनिक सॉल्वैंट्स (मेथनॉल/क्लोरोफॉर्म या diethyl ईथर) लिपिड निष्कर्षण और ठहराव में15 , 29 , 30. इस बफर का एक और लाभ यह है कि यह एक ही प्रारंभिक homogenate के आधार पर प्रोटीन सामग्री के लिए टैग के स्तर को सामान्य कर सकते हैं, छोटे ऊतक नमूनों में वसा निर्धारण आसानी से प्राप्त करने के लिए और अंग अध्ययन करने के लिए नए अवसरों की पेशकश कर जीव चयापचय homeostasis में बात पार । इसके अलावा, एक ही प्रारंभिक मक्खी homogenate पीसने के बाद प्राप्त की, समानांतर ग्लूकोज और ग्लाइकोजन परख प्रदर्शन किया जा सकता है, दोनों लिपिड और एक ही जैविक नमूनों से ग्लूकोज चयापचय में परिवर्तन के अध्ययन की अनुमति । इस टैग प्रोटोकॉल है कम श्रमसाध्य या समय लेने वाली पिछले प्रोटोकॉल की तुलना में15,29,30, और बल्कि उच्च प्रवाह है, एक ९६-well प्रारूप है कि तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति देता है का उपयोग कर करीब १०० नमूने एक घंटे के भीतर । इस प्रोटोकॉल भी उच्च चीनी आहार13,31, आहार प्रतिबंध और भुखमरी, साथ ही उंर बढ़ने के अध्ययन के लिए उंर से जुड़े परिवर्तन को समझने के लिए सहित अंय आहार शर्तों के तहत वसा सामग्री यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है वसा चयापचय में ।

    मोटापा, चयापचय सिंड्रोम और संबंधित विकृतियों मानव स्वास्थ्य1,2पर विनाशकारी परिणामों के साथ एक सभी समय उच्च पर हैं । संयुक्त HFD प्रोटोकॉल और उच्च प्रवाह टैग परख एक अनूठा मंच की पेशकश करने के लिए मॉडल जीवों का उपयोग करें, जैसे Drosophila, तेजी से पैदा करने के लिए मोटापा और आनुवंशिक कारकों के लिए स्क्रीन, या प्राकृतिक और सिंथेटिक रासायनिक यौगिकों, बेहतर समझने के लिए चयापचय असंतुलन । अंततः यह बहुत नए उपचार या चयापचय रोगों के लिए इलाज के विकास के लिए वैज्ञानिक खोजों की उंनति के लिए योगदान हो सकता है ।

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    हम इस पांडुलिपि संपादन के लिए एरिका टेलर शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (P01 HL098053, P01 AG033561 और R01 HL054732) R.B. करने के लिए, एक के बाद डॉक्टरेट अनुसंधान अनुपूरक (R01 HL085481) और फैलोशिप (AAUW) S.B.D. के लिए, और अनुदान अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से S.B.D. के लिए और R.T.B.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
    Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
    Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
    Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
    Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
    Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
    Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
    Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
    Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
    Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
    Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
    Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
    Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
    Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
    Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
    Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
    96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
    Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
    Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
    Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
    Triglyceride Standard Stanbio #2103 - 030
    Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
    Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
    PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
    Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
    Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
    filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
    Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
    Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
    FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
    Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
    2. Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
    3. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
    4. Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
    5. Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
    6. Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
    7. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
    8. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
    9. Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
    10. Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
    11. Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
    12. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
    13. Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
    14. Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
    15. Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
    16. Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
    17. Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
    18. Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
    19. Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
    20. Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
    21. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
    22. Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
    23. Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
    24. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
    25. Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
    26. Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
    27. Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
    28. Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
    29. Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
    30. Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
    31. Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).

    Tags

    आनुवंशिकी अंक १२७ मोटापा चयापचय सिंड्रोम स्क्रीनिंग आनुवंशिकी लिपिड lipotoxicity
    उच्च वसा आहार खिलाने और उच्च प्रवाह Triacylglyceride परख में <em>Drosophila Melanogaster</em>
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer,… More

    Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter