Summary
Nous présentons ici des gouttelettes adressable microarrays (SMA), une méthode de tableau basé de gouttelettes en mesure de déterminer l’abondance absolue de protéine dans des cellules individuelles. Nous démontrent la capacité des SMA pour caractériser l’hétérogénéité dans l’expression de la tumeur suppresseur protéine p53 dans une lignée de cellules cancéreuses humaines.
Abstract
Comportement souvent cellulaire et les réponses cellulaires sont analysés au niveau des populations où les réponses de nombreuses cellules sont regroupées ensemble comme un résultat moyen masquant le comportement unicellulaire riche au sein d’une population complexe. Technologies de détection et de quantification protéines unicellulaires ont eu un impact remarquable ces dernières années. Nous décrivons ici une plateforme d’analyse unicellulaire pratique et flexible basée sur gouttelette adressable microarrays. Cette étude décrit comment le nombre de copies absolue de protéines cibles peut-être être mesuré avec une résolution de cellule unique. Le suppresseur de tumeur p53 est le gène le plus fréquemment muté dans le cancer humain, avec plus de 50 % des cas de cancer total expose un modèle d’expression de p53 non saines. Le protocole décrit les étapes pour créer 10 gouttes de nL au sein de laquelle les cellules cancéreuses humaines unique sont isolés et le nombre de copies de la protéine p53 est mesuré avec une résolution de la molécule unique afin de déterminer avec précision la variabilité dans l’expression. La méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule dont la matière première pour déterminer le nombre de copies absolue de toutes les protéines cibles d’intérêt.
Introduction
L’objectif de cette méthode consiste à déterminer la variation dans l’abondance d’une protéine cible dans une population de cellules avec une résolution de cellule unique. Cellule analyse fournit un certain nombre d’avantages qui ne sont pas disponibles avec les méthodes biochimiques ensemble traditionnel. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 tout d’abord, travaillant au niveau de la cellule unique peut capturer l’hétérogénéité riche d’une population cellulaire qui serait autrement perdue par la moyenne qui se produit avec des techniques biochimiques ensemble traditionnel. La majorité des méthodes biochimiques de cheval de travail travaillent avec la plus grande partie, exigeant, comme ils le font souvent, des millions de cellules pour produire un résultat. Bien sûr, les conséquences de l’évaluation des populations de cellules entières repose sur un certain nombre de facteurs, par exemple, l’hétérogénéité dans l’expression de la protéine où certaines caractéristiques importantes de la distribution de l’abondance de la protéine peuvent être manquées. D’un point de vue pratique, la sensibilité requise des techniques de la cellule unique rendent capable de fonctionner avec des quantités de matériel biologique qui est insuffisant pour même les plus sensibles techniques en vrac fonctionner. Un exemple de ceci est l’étude des types de cellules rares tels que les cellules tumorales (CTC) où même pour les patients avec une perspective de pronostique pauvre moins que 10 PTC peut être présent dans un unique 7,5 mL sang tracer en circulation. 6 nous présentons ici la méthodologie requise pour effectuer des mesures de protéine monocellulaire en utilisant un test anticorps utilisant des gouttelettes d’huile diablotin imprimé sur un microréseau d’anticorps à volume réduit.
Plateformes de gouttelettes microfluidiques sont haut débit, capable de générer des milliers de gouttelettes par seconde et capable d’isoler et même de la culture, les cellules individuelles en gouttelettes individuels pour effectuer un large éventail de tests biochimiques. Techniques axées sur les gouttelettes sont bien adaptés pour l’analyse de la cellule unique,7,8,9 , avec des exemples récents notables dont DropSeq10 et inDrop11, qui ont été grandement aidés par la puissance de techniques d’amplification. La quantité limitée de matériel et aucune méthode d’amplification pour les protéines font unicellulaire protéomique particulièrement difficile.
Gouttelettes peuvent être analysés par un certain nombre de méthodes et la microscopie de fluorescence a été largement utilisée. Techniques de molécules simples telles que la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion totale interne permet aux molécules fluorescentes à visualiser avec incomparable rapport signal-bruit. 12 en raison de la décroissance exponentielle du champ évanescent, seulement des fluorophores dans la grande proximité de la surface (l’ordre de 100 nm) sont excités faisant FRBR une bonne stratégie dans la détection de petites quantités d’une molécule cible dans un mélange complexe. La force de sectionnement optique inhérente de la FRBR contribue également à éviter les lavages et limites de dosage temps et la complexité. Toutefois, la FRBR nécessite des surfaces planes et exemples du microscope TIRF appliqué à gouttelettes en suspension dans le flux impliquent la formation d’une surface plane qui à l’image. 13 à cette fin, des techniques protéomiques unicellulaire conçoivent souvent puces microfluidiques autour des agents de surface immobilisée capture dans un format de microarray. 4 , 14
Les gouttelettes, eux-mêmes, peuvent se former dans des tableaux sur des surfaces planes, soi-disant gouttelette microarrays. 15 , 16 , 17 organisation dans l’espace des gouttelettes dans les tableaux permet qu’ils soient idéalement indexées, facilement surveillés au fil du temps, individuellement adressée et, le cas échéant, récupérée. Microarrays de gouttelettes peuvent atteindre une forte densité de micro-réacteurs avec des milliers d’éléments par puce qui sont soit encastrées ou pris en charge par une structure de microtitration. 18 , 19 , 20 ils peuvent être formés par le dépôt séquentiel par manipulation de liquides robots, jet d’encre spotters, contacter microarrayeurs21,22,23,24,25, 26 , ou ils peuvent s’auto-assembler sur des surfaces comme superhydrophillic taches modelée sur une surface SUPERHYDROPHOBE. 27 , 28 , 29
Avec ces considérations à l’esprit, adressable Droplet Microarrays (SMA) ont été conçus pour combiner la polyvalence, les adressabilité spatiale et les volumes réduits de gouttelettes microarrays avec la sensibilité du microscope TIRF seule molécule à quantitativement mesurer l’abondance de la protéine. 5 SMA activer l’analyse du unicellulaire formant un microarray de gouttelettes contenant des cellules individuelles sur un microréseau d’anticorps, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation. Les volumes des gouttelettes sont discrètes pour éviter toute perte d’échantillon, qui serait autrement réalisée par sur puce robinetterie en flux continu microfluidique. 30 la quantité absolue de la protéine-cible d’une seule cellule est extrêmement faible ; Toutefois, la diminution du volume des gouttelettes permet de relativement haute concentration locale afin qu’ils soient détectés à l’aide d’un test d’anticorps "sandwich" - anticorps est immobilisé dans une région distincte, ou spot, sur une surface qui capte des protéines qui à son tour se lie à un anticorps de détection fluorescent marqué présent dans le volume de la goutte. Comme une approche sans étiquette (c'est-à-dire des protéines cibles n’ont pas besoin d’être étiquetés directement), SMA est généralement applicables à l’analyse de cellules provenant de sources primaires, tels que le sang transformé, bien besoin de ponction et biopsies tumorales dissociés, ainsi que les cellules de la culture et les lysats.
Mesurant la variation dans l’abondance de la protéine sur une population de cellules est important dans la détermination de l’hétérogénéité en réponse, par exemple, à un médicament et aidera en donnant un aperçu en fonctions cellulaires et voies, évaluation de sous-populations et leur comportement, ainsi que d’identifier des événements rares qui seraient autrement être masquées par des méthodes en vrac. Ce protocole décrit comment produire et utiliser des microarrays gouttelette adressable pour déterminer quantitativement l’abondance de la p53 de facteur de transcription dans des cellules cancéreuses humaines et peut être utilisé pour étudier le rôle de p53 dans la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. La protéine cible est déterminée par le choix de la capture et la détection des anticorps et peut-être être modifiée pour inclure des cibles différentes ou plus. Les instructions sont fournies pour construire un appareil simple incorporant une buse concentrique consommables de laboratoire général d’array manuellement 10 gouttes de nL recouverts d’huile. Le processus complet expérimental est décrit par lequel chaque gouttelette est ensuite chargé avec une seule cellule, qui est ensuite lysée et l’expression de protéine déterminée avec résolution seule molécule TIRF microscopie.
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Protocol
1. préparation
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Faire des copeaux et puces à anticorps impression
- Fixer un isolant adhésif silicone/acrylique sur un lamelle couvre-objet fonctionnalisé pour prendre en charge un microréseau d’anticorps. Ceci est dénommé la puce.
NOTE : Différentes chimies de surface ont été testés pour leur adéquation avec les gouttelettes adressables. 5 surfaces chimies doive être optimisé pour les agents de capture alternative. Isolateurs de SMA sont disponibles dans le commerce ou peuvent être produites par acrylique découpe laser (CAD fichier pour isolateur utilisée dans ce travail est fourni en téléchargement ; Voir le Fichier de Code supplémentaires). - Allumer la microarrayer et la valeur de l’humidité à 75 %.
NOTE : hygrométrie réduit l’évaporation de la solution d’impression de la goupille de microarray et réduit la variation intra - et inter - sondage. - Nettoyer l’axe « microarray » dans la solution pendant 5 min de nettoyage par ultrasons de pin. Rincez la broche avec de l’eau ultra pure à l’aide d’une pissette et sécher à l’aide d’azote.
NOTE : Suspendre la broche quant à seulement plonger l’extrémité de la broche. Une lame de microscope avec un ensemble convenablement percé de trous aidera si un support de broche ne peut être obtenu. - Faire 5 mL de tampon impression comprenant 3 × tampon de solution saline-sodium citrate (SSC), bétaïne de 1,5 M additionné de 0,01 % dodécylsulfate de sodium (SDS). Conserver à 4 ° C indéfiniment.
- Pour préparer une solution d’impression, décongeler les anticorps anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit ; Voir la Table des matières) aliquotes à-80 ° C. Mélanger 1:1 avec impression tampon à une concentration finale de 0,5 mg/mL. Charge de 5 à 10 µL de solution d’impression dans une plaque de 384 puits à l’aide d’une micropipette et placer dans le microarrayer.
- Charger des morceaux assemblés à l’étape 1.1.1 dans le microarrayer. Le programme de la microarrayer pour imprimer des taches au point de coordonnées définies par le centre de chaque puits de l’isolateur.
Remarque : Microarrayeurs emploient un éventail de, principalement, un logiciel propriétaire et si le lecteur est invité à consulter la documentation pertinente. La biopuce requise pour l’isolateur de SMA en vedette dans le fichier CAD à l’étape 1.1.1 est composé d’éléments rectangulaires ; les distances pertinentes sont fournies. - Stocker les jetons dans des récipients hermétiques et l’envelopper avec du papier. Stocker à 4 ° C jusqu'à 6 semaines.
Remarque : La feuille est d’empêcher tout dommage-photo. Stockage à 4 ° C limite le taux de dégradation des biomolécules et des réactions nocives qui peuvent agir pour réduire l’activité de microarray. Une boîte hermétique permet de puces s’équilibrer à température ambiante avant de l’utiliser sans condensation sur la surface de la puce. Contacter « microarray » tension superficielle des exploits d’impression et l’adhérence entre la solution impression et impression substrat afin de produire des spots. Pre-printing ou éponger est normalement nécessaire pour retirer l’excédent de solution de la goupille de microarray de céder les taches uniformément tailles. Ne jetez pas la lamelle pré impression sacrificielle puisqu’il peut être utilisé pour évaluer la qualité du lot.
- Fixer un isolant adhésif silicone/acrylique sur un lamelle couvre-objet fonctionnalisé pour prendre en charge un microréseau d’anticorps. Ceci est dénommé la puce.
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Préparer les seringues, tube et concentrique de buse pour distribuer des gouttelettes adressables
- Démonter les 100 µL (pour la goutte de solution aqueuse) et 1 mL (pour l’huile de coupe) Hamilton seringues en verre et rincer les pièces avec distillée H2O.
- Alimentation d’une longueur de 100 mm de 150 µm ID/360 µm OD fusionnés avec tube de silice dans une longueur de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 » tube d’OD PFA jusqu'à ce qu’il dépasse de 2 mm. Cela formera la buse concentrique.
- Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate à l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 µL et insérez la pièce 40 mm 1,0 mm ID/1/16 » tube d’OD PFA. Si nécessaire, repositionner le tube de silice fondue pour maintenir une saillie de 2 mm au niveau du bec avant le coucher adhésif.
- Insérez l’autre extrémité de la silice fondue capillaire dans la fin d’une longueur de 200 mm de 0,014" ID/0,062" OD tubing PTFE et raccordez-le à un 100 µL Hamilton seringue remplie de 4 % albumine de sérum bovin (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (LNPP).
NOTE : Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifiquement aux surfaces et peut être perdu ou dénaturé. BSA est utilisé pour « bloquer » les surfaces pour minimiser non-spécifiques en sacrifice liant à ces surfaces. - Insérez une longueur de 400 mm de tubes de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP dans un cône de pipette de 200 µL jusqu'à ce qu’il forme un sceau. Appliquer une fine couche de colle cyanoacrylate à une autre pointe de pipette 200 µL et pousser cela dans la première astuce pour fixer le tuyau en place. Connectez l’extrémité ouverte du tuyau FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm à 1 mL d’une seringue de Hamilton rempli d’huile minérale.
- Insérer la pointe de pipette 10 µL de la buse concentrique à l’Assemblée de pointe 200 µL pipette. Placez les seringues dans les pompes à seringue séparée car ils devront fonctionner indépendamment.
- Remplir la seringue de 100 µL de solution de saturation LNPP 4 %. Réinstaller et rincer le tube « aqueux » avec la solution de blocage. Répéter deux fois pour un total de 3 bouffées de chaleur.
- Remplir la seringue de 100 µL de 0,125 µg mL-1 détection de d’anticorps (anticorps anti-p53 (DO-1) étiqueté avec Alexa 488) dans 4 % LNPP et re-joindre des tubes. Remplacer la solution blocage en tuyau de distribution 25 µL de solution de détection anticorps.
- Rincer le tube « pétrole » avec de l’huile minérale, jusqu'à ce que tous les tuyaux et la buse se remplit avec de l’huile. Remplir la seringue de 1 mL d’huile minérale et ré-attacher le tube. Fixez l’ensemble tuyau et la buse d’un manipulateur XYZ.
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Préparer microinjector et micromanipulateur
Remarque : Les étapes ci-dessous font spécifiquement référence aux composants des microinjector et des appareils de micromanipulateur spécifié dans la Table des matières, mais sont généralement applicables à tous les appareils.- Assembler le microinjector en attachant la pression de la tubulure et le titulaire de la capillaire.
- Tournez lentement le cadran de piston jusqu'à ce que l’huile minérale remplit complètement la ligne.
- Fixer le support capillaire dans la traduction tête de montage.
- Fixer le tube capillaire dans le capillaire porte avec la poignée de la tête.
- Déposer une solution de 4 % LNPP dans un puits de l’isolateur.
- Traduire en utilisant le micromanipulateur et plongez l’extrémité du capillaire dans la solution.
- Remplissez lentement le tube capillaire avec 4 % LNPP et laisser bloquer pendant 10 min.
- Éjecter le microcapillaire et faites pivoter le module de traduction afin que l’Assemblée est claire de la puce.
2. former des gouttelettes adressables et charge avec cellules individuelles
- Former des gouttelettes adressables
- Fixer la puce sur la platine du microscope.
Remarque : Le microscope est une fluorescence inversée microscope automatisé capable de seule molécule FRBR équipé d’un un stade XY codé et un électron multipliant caméra dispositif à couplage de charge (EM-CCD). - Enregistrer les coordonnées de scène de microscope de chaque tache dans le tableau en utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope.
- Définissez le manipulateur XYZ sur la platine du microscope. Placez l’embout sous l’angle de 50-60°. Veiller à ce que le bec a une longueur suffisante et autorisation à atteindre la puce. Set « aqueuse » et « huile » seringue pompes pour distribuer 10 nL de 100 µL/min à 5 µL à 100 µL/min, respectivement.
Remarque : Lors de la préparation, la solution aqueuse à la tête de la buse peut sécher. - Distribuer la solution aqueuse jusqu'à ce qu’une perle de liquide est visible à la tête de la buse. Tamponnez avec un chiffon de poussière gratuit pour l’enlever.
Remarque : Selon le nombre d’assignations sous enquête, réserve un certain nombre de puits pour servir de réservoirs pour les cellules. Pour un type de cellule unique/ligne un réservoir unique suffira. - En utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope, définir les coordonnées de scène de microscope à un endroit d’anticorps dans le tableau et se concentrer sur la surface de la lamelle couvre-objet.
- Attention à ne pas perturber la place, en utilisant le manipulateur XYZ, alignez la pointe capillaire de verre de la buse concentrique du côté de la place de l’anticorps et verser 10 ml d’une solution aqueuse. Sans bouger les étapes, déposer 5 µL d’huile pour plafonner la solution aqueuse. Soulevez la buse de la goutte lentement et se déplacer à l’autre bien.
- Répétez l’étape 2.1.6 pour toutes les taches d’anticorps dans le tableau.
- Après 30 min, l’image toutes les taches dans le tableau en utilisant le logiciel de contrôle automatisé de microscope pour déterminer l’arrière-plan de molécules uniques liés à chaque anticorps spot avant le chargement de cellules.
- Fixer la puce sur la platine du microscope.
- Charger des gouttelettes adressables avec cellules
- Sortir les flacons de culture cellulaire de l’incubateur et détacher les cellules à l’aide de la solution de trypsine/EDTA.
Remarque : Dans cette étude, la lignée humaine de cellule carcinome BE de colon a été utilisée et cultivées à l’aide modifié Eagles (DMEM de Dulbecco) additionné de 10 % (v/v) sérum bovin fœtal (SVF) dans un incubateur à CO2 . - Si nécessaire, fluorescent tacher les cellules.
- Remettre en suspension les cellules dans une solution d’anticorps de détection 0,125 µg/mL (anticorps anti-p53 (DO-1) étiqueté avec Alexa 488) dans 10 % FBS dans les médias L-15. Pour assurer une suspension monocellulaire, filtrer la solution de la cellule à travers un tamis de cellule 40 µm pitch.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer ou concentrer la solution de cellules à une concentration de 25-400 × 103 cellules/mL. Cela garantit que sédiments de cellules avec un espacement suffisant pour manipuler confortablement le microcapillaire.
- Charger des cellules individuelles dans adressables gouttelettes provenant du réservoir de cellules utilisant le micromanipulateur et microcapillaire.
Remarque : Les cellules Non adhérentes peuvent être chargées en vrac dans une micropipette et distribué un par un en gouttelettes adressables. Malgré le traitement de surface bloquant, lignées de cellules adhérentes tendra à non spécifiquement collent à la paroi intérieure de verre microcapillaire et être perdu. - À l’aide d’un objectif de 10 × pour observer, utiliser le microinjector pour aspirer une cellule unique dans le microcapillaire provenant du réservoir de la cellule.
- Stocker les coordonnées de scène micromanipulateur si vous utilisez une platine manipulateur électronique ou noter manuellement la position z.
- Rétracter la micropipette en la traduisant vers le haut pour dégager la hauteur de 1 mm de la puce. Exécutez cette fonction manuellement avec un joystick ou automatiquement à l’aide de la fonctionnalité « Eject » d’un stade de manipulateur électronique.
- Ensemble, que la scène se coordonne pour que des gouttelettes d’un diamètre adressable l’à l’aide de microscope contrôle logiciel automatisé. « Injecter » la micropipette en le renvoyant à la position z stockée (ou indiquée). Cela effectuer manuellement avec un joystick ou automatiquement si vous utilisez une platine manipulateur électronique.
Remarque : Le microcapillaire va percer le plafonnement de l’huile et être situé dans la partie aqueuse de la gouttelette adressable. - Distribuer la cellule dans la goutte adressable à l’aide de la microinjector. Le volume d’une goutte d’adressable nL 10 augmentera de moins de 1 %.
- Répétez les 2.2.5-2.2.9 pour les gouttelettes adressables restants, laissant certains gratuits pour le contrôle expérimental où les gouttelettes adressables ne contiennent pas une cellule.
NOTE : Une alternative plus simple aux cellules individuelles de chargement en gouttelettes adressables en utilisant un microcapillaire et micromanipulateur consiste à remplacer la solution à l’étape 1.2.8 avec une solution d’anticorps de détection à 4 % LNPP contenant des cellules à une concentration sur l’ordre de 10 5 cellules/mL, équivalent à 1 cellule/10 nL. Occupation de la cellule unique sera poissonnienne et la concentration cellulaire devront être optimisées.
- Sortir les flacons de culture cellulaire de l’incubateur et détacher les cellules à l’aide de la solution de trypsine/EDTA.
- Lyse des cellules et la matrice image
- Cellules d’image au microscope à fond clair, y compris toute imagerie de fluorescence des gouttelettes.
Remarque : L’imagerie prend environ 3 min à ~ 100 gouttes à l’aide d’un microscope automatisé d’images. Effectuer l’imagerie avec une NA 60 = 1.49 objectif immersion dans l’huile. Aucuns filtres ne sont nécessaires pour fond clair d’imagerie tandis que jeux de filtres standard est utilisés pour l’imagerie de fluorescence. - Tous les spots dans le tableau en utilisant la seule molécule TIRF microscopie de l’image.
Remarque : Les paramètres sont utilisés comme à l’étape 2.3.1 avec une FRBR spécialisée filtrer l’ensemble. Ces images seront analysées par la suite à l’article 3 pour déterminer l’arrière-plan de molécules uniques liés à chaque spot anticorps avant la lyse. Imagerie de molécule unique à l’aide de la microscopie de fluorescence (FRBR) réflexion interne totale prend environ 5 min pour ~ 100 points d’image. - Mettre l’accent sur une cellule dans une gouttelette adressable. Atteindre la lyse optique complete en se concentrant un célibataire 6 ns laser pulse (longueur d’onde 1064 nm, pouls énergies 14.1 ± 0,3 µJ par impulsion) à proximité de l’emplacement de la cellule.
Remarque : L’impulsion laser met en place une bulle de cavitation en expansion qui cisaille la cellule et libère des constituants cellulaires dans le volume de la goutte. 4 , 31 les processus mécaniques en raison de la lyse induite par laser ne pas dérangent l’interface huile / eau à énergies pouls faible. Lyse optique prend généralement environ 20-30 min à lyser les 100 cellules. Tel que discuté dans la section Discussion, il y a un certain nombre de méthodes alternatives à la lyse des cellules individuelles si installation de lyse optique n’est pas possible. - Répétez pour tous les gouttelettes contenant des cellules adressables laissant 5 gratuit pour le contrôle expérimental où adressables gouttelettes contiennent une cellule non lysée.
- Notez l’heure à laquelle chaque cellule est lysée.
Remarque : Ces temps servira à corriger les courbes de liaison individuelle pour chaque tache à l’étape 3.1.9. Souvent, il suffit de noter les moments où les cellules des premières et la dernières sont lysées et estiment le reste en supposant une durée suffisamment cohérente entre la lyse. - Acquisition d’images de molécules simples TIRF microscopie de tous les spots toutes les 10 min pendant les premières 30 min puis toutes les 20 min pour un autre 60 min. Si seulement l’intérêt d’un montant de protéine liée à l’équilibre, l’image toutes les taches après incubation la puce pendant 90 min à température ambiante.
Remarque : Le temps pour atteindre l’équilibre dépendra du volume de la goutte et les affinités des anticorps utilisés dans le test. La microscopie FRBR est effectuée en utilisant une source d’excitation de laser à = 488 nm et 1,5 puissance mW mesurée à l’ouverture arrière à l’aide d’un wattmètre optique. Images de molécules simples sont acquises en définissant les paramètres d’acquisition sur l’EM-CCD caméra à 900 ms temps d’acquisition, la numérisation au taux de lecture de 1 MHz 16-bit et un EM gain facteur de 10. L’isolant peut être réutilisé en enlevant soigneusement la lamelle.
- Cellules d’image au microscope à fond clair, y compris toute imagerie de fluorescence des gouttelettes.
3. analyse des données
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Molécule unique comptant (régime non congestionné/numérique)
- À l’aide de Fidji (ou Matlab), pour n’importe quel endroit d’anticorps non encombrées, charger l’image acquise avant la lyse (fond, BKD).
Remarque : Les opérations dans les étapes suivantes sont exécutées carrément à l’aide de logiciels d’analyse image Fidji. On trouvera à la https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html lien suivant un guide de l’utilisateur. - Aux Fidji, sélectionnez l’image BKD. Dans le menu « Image », sélectionnez « Duplicate » à BKD en double. Sélectionnez l’image dupliquée et sous les « processus > filtres », sélectionnez « Flou gaussien » et spécifier un rayon de 50 pixels.
- Aplatir l’image BKD afin qu’il y a une distribution efficace d’intensité uniforme de la source lumineuse de l’excitation en divisant l’image BKD par l’image floue de BKD, produisant des BKD_FLAT.
- Au titre de « Processus » sélectionnez « Image calculatrice... », spécifie l’opération de « Fossé », les images nécessaires et en sélectionnant les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
- Soustraire chaque pixel de l’image de 1 (« processus > Math », sélectionnez « soustraire » et spécifiez une valeur de 1). L’intensité moyenne de pixels doit être 0.
NOTE : Champ aplatissement et images d’arrière-plan aplatie peuvent être vérifiés facilement puisque la somme de tous les pixels doit être 0 et tout décalage restant peut être compensée plus carrément. - Sélectionnez une zone de pixels × 50 50 pixels dans l’un des 4 coins de l’image BKD_FLAT. Mesurer l’écart d’intensité pixel (σ) en sélectionnant « Analyser » et « Mesure ».
NOTE : Les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats. Cela détermine la place hors contexte où il y a probablement pas une forte densité de molécules simples. La zone à mesurer peut être sélectionnée manuellement à l’aide des outils de sélection de menu par défaut ou en exécutant la macro code » makeRectangle (x, y, largeur, hauteur) » ; Cela crée une sélection rectangulaire, où x et y les arguments sont les coordonnées (en pixels) de l’angle supérieur gauche. - Définissez le seuil de l’image à 3σ et créer une image binaire SM_MASK.
- Sous « Image > réglage », sélectionnez « seuil » et définissez le niveau de seuil inférieur à 3σ.
Remarque : Les Pixels dont la valeur est inférieure au seuil sont mises sur zéro et dépassant le seuil de pixels ont la valeur 1. Le seuil détermine la confiance avec laquelle seuillées pixels appartiennent à une seule molécule.
- Sous « Image > réglage », sélectionnez « seuil » et définissez le niveau de seuil inférieur à 3σ.
- Dans l’image segmenté SM_MASK, valeurs d’intensité de pixel réglée à zéro de tous les objets qui n’ont pas une taille de 4 à 9 pixels2 et une circularité de 0,5 - 1 en sélectionnant « Analyser » puis « Analyser les particules » et en spécifiant la taille et la circularité.
Remarque : La taille en pixels devrez peut-être être optimisée pour les autre jeu fluorophores et microscope ups. En raison du type de bruit caméra unique pixels peuvent être au-dessus de ce seuil et ne pas rejetées malgré n’étant ne pas de molécules simples. Le critère de taille de pixel rejettera correctement ces pixels. Molécules simples sont généralement de forme circulaire. Circularité la valeur 1 indique un cercle parfait, alors qu’une valeur approchante 0 indique une forme plus allongée. Les objets restants sont des molécules simples et peuvent être comptés. Un masque peut être défini pour délimiter la zone de la place de discriminer sur place et hors place compte par image. C’est plus facile pour les images acquises à des moments plus tard lorsqu’il y a un signal suffisant sur place qui peut être appliqué ensuite aux trames précédentes. - Pour la même place d’anticorps non encombrées, charger et répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.7 pour toutes les trames d’images saisies comme une série temporelle acquis lyse post. Utiliser les temps de lyse notés à l’étape 2.3.5. pour corriger les courbes de liaison.
- À l’aide de Fidji (ou Matlab), pour n’importe quel endroit d’anticorps non encombrées, charger l’image acquise avant la lyse (fond, BKD).
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Molécule unique comptant (régime congestionné/analogique)
- Afin de calculer l’intensité moyenne d’une molécule unique, avant de poursuivre, répétez les étapes 3.1.1 - 3.1.8.
- Multipliez les images BKD_FLAT et SM_MASK pour produire une image selon laquelle les valeurs nulles pixel sont associés aux molécules simples.
- Pour effectuer ceci, sous le menu « Process », choisissez « Image calculatrice... », spécifier l’opération de « Multiplier » et les images nécessaires et sélectionnez les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
- La somme de toutes les valeurs d’intensité de pixel en sélectionnant « Analyser », puis « Mesure » ; les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats. Diviser par le nombre de molécules simples comptés comme par l’Etape 3.1.8 pour calculer l’intensité moyenne par molécule.
- Pour n’importe quel anticorps congestionnées spot, charger la lyse post image acquise et l’aplatir avec une image d’arrière-plan flou comme par les Etapes 3.1.2 et 3.1.3.
- Soustraire de chaque pixel dans l’image pixellisée en 1 ("processus > Math », sélectionnez « soustraire » et spécifiez une valeur de 1)
- Sélectionnez une zone de pixels × 50 50 pixels dans l’un des 4 coins de l’image et de mesurer l’écart d’intensité pixel (σ). Voir l’étape 3.1.5 pour plus de détails.
- Créer un masque d’image binaire en définissant le seuil de l’image à 3σ et valeurs d’intensités de pixels la valeur zéro de tous les objets d’une taille inférieure à 4 pixels2. Pour effectuer ceci, sous le menu « Analyser », sélectionnez « Analyser les particules » et spécifiez la taille et la circularité.
- Multiplier l’image spot aplatie anticorps congestionnées par le masque de l’image binaire.
- Pour effectuer ceci, sous le menu « Process », choisissez « Image calculatrice... », spécifier l’opération de « Multiplier » et les images nécessaires et sélectionnez les cases « Create new window » et « résultat 32 bits (float). »
- Somme des intensités pixels restants en sélectionnant « Analyze » suivi de « Mesure » ; les statistiques sommaires de la sélection seront présentées dans une fenêtre de résultats.
- Diviser la somme des intensités des pixels par l’intensité de la molécule unique moyen pour calculer le nombre de molécules uniques liés à l’endroit encombrés.
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Courbe d’étalonnage pour quantification absolue
- Répétez les points 1 et 2 pour former 10 nL adressable des gouttelettes avec l’anticorps de détection en solution à 4 % LNPP additionnée d’une protéine recombinante de concentration connue.
- Effectuer une série de concentrations de 102- 107 protéines recombinantes par goutte en faisant varier la concentration de la protéine recombinante, ajoutée à la solution. Il est recommandé de travailler en termes de nombre de protéines par goutte pour rendre les données de cellule unique étalonnage simple.
- Utiliser la série de concentration compte de données à l’étape 3.3.2 pour calibrer toute seule molécule par la tache à l’abondance de la protéine par goutte, ainsi que par l’abondance de protéine extension par une cellule unique.
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Representative Results
Le nombre de copies de protéine basal absolu de p53 a été déterminé avec une résolution de cellule unique dans une lignée de cellules de cancer du côlon humain, cellules BE. Nous démontrons comment expression de p53 peut varier au fil de plusieurs ordres de grandeur et montrent une corrélation faiblement positive entre taille et protéine nombre de copie cellule au sein de la population de cellules BE au repos.
Adressable Microarrays gouttelettes se forment lorsque aqueux gouttelettes sont distribués aux endroits spot anticorps et recouvert d’huile. Ici, les gouttelettes de soutiennent un dosage de protéine p53 sensibles. Lamelles sont rangés avec des taches d’anticorps de capture à l’aide d’un microarrayer de contact et d’une broche. Les anticorps anti-p53 de capture est tirée d’une trousse commerciale du test ELISA. Les conditions d’impression étaient tels que les spots de capture ont été environ 100 µm de diamètre, avec une capacité maximale de capture de 6,2 ± 0,5 x 105 protéines par endroit. 32
L’utilisation d’un isolant collé sur la lamelle couvre-objet permet une densité plus élevée des gouttelettes de se former, car elle limite la propagation de pétrole à proximité lieux de capture d’anticorps. Dans chaque puits de l’isolateur gouttelettes sont forment en distribuant une solution aqueuse, qui est ensuite coiffée avec de l’huile pour éviter l’évaporation (Figure 1 a). Une quantité minimale d’huile peut-être être administrée pour couronner la goutte ; Toutefois, il est utile distribuer une quantité qui remplit chaque isolateur bien exactement telle que la surface de l’huile est plane pour l’imagerie. Isolateurs sont commercialement source ou faites de feuilles d’acrylique découpe laser. Isolateurs de silicone sont disponibles puits prédécoupés dans un tableau de 4 x 6 (n = 24) mais peut être modifiée dans un tableau de 4 x 11 (n = 44) à l’aide d’un punch biopsie ou plusieurs trous de cuir. Le laser cut isolateur dans la Figure 1 b montre un tableau de 100 puits hexagonales chaque avec un diamètre maximal de 2,89 mm, une séparation de centre à centre de 3,9 mm et une hauteur de 0,5 mm. Les gouttelettes peuvent être conservés et restent stables pendant de longues périodes de temps (observé jusqu'à 3 mois).
Des gouttelettes sont créés manuellement à l’aide d’un appareil de construction artisanale, qui se traduit par une buse concentrique tube (Figure 1), qui est reliée à deux pompes à seringue (Figure 1 a). La buse concentrique tube est composée d’une capillaire, en silice fondue qui distribue la phase aqueuse, alimentée par une courte longueur de tube PEEK, qui distribue la phase huileuse. À l’aide d’un microscope, la buse est alignée à un endroit d’anticorps et les pompes auraient tout d’abord répartir la solution aqueuse, immédiatement suivie de l’huile (Figure 1E, étapes 1-4). Une fois que toutes les gouttelettes dans le SMA sont formés, un microinjector et un micromanipulateur (voir la Table des matières) sont utilisés pour charger chaque gouttelette avec une cellule unique (Figure 1). Une micropipette saisirait une cellule provenant d’un réservoir de cellules, dispensé dans un puits sur la puce, être traduite dans une gouttelette bien et puis percer le bouchon d’huile pour livrer la cellule dans la goutte aqueuse (Figure 1, étapes 5-8).
Tous les spots dans les gouttelettes sont imagés avant la lyse et servira à déterminer le degré de liaison non spécifique aux spots (Figure 2 a). Cellules sont lysées entièrement (y compris le noyau) à l’aide de méthodes optiques. 31 la lyse optique s’appuie sur la force de cisaillement d’une bulle de cavitation induite par l’impulsion laser en expansion pour perturber les cellules. Les soins doivent être faites que l’interface huile / eau ne pas être perturbé par ces processus en limitant les énergies de l’impulsion et en déposant des cellules de l’interface huile/eau. Une fois que les cellules sont lysées, le tableau est imagé par microscopie FRBR en utilisant un microscope automatisé ; cadres sont acquis toutes les 10 min pendant 30 min et puis toutes les 20 min pour un autre 60 min. Les conditions, telles que l’affinité de l’anticorps, diffusion de protéine et le volume de la goutte, sont telles que la liaison d’équilibre est atteint dans l’acquisition de 90 min. Un pulldown unicellulaire typique est montré dans la Figure 2 a.
Le processus d’analyse d’image pour déterminer que la molécule unique compte est schématiquement représenté dans la Figure 2 b. Images des points sont soit considérés comme non encombrées, où la concentration de protéines cibles est telle que les molécules simples sont bien séparées et facilement distinguées ou congestionnés, où la concentration de protéines cibles est supérieur et unique molécule images chevauchement et sont non plus individuellement distinguable. Puisque le profil d’excitation de la FRBR est inégal, il est essentiel que tous acquis images être plat-champ corrigé. Un flou gaussien est appliqué à une image non encombrées, qui agit comme un filtre de lissage pour éliminer en détail et bruit et produire une image avec le profil moyen du profil FRBR excitation. Cette image traitée peut servir à « aplatir » l’image d’origine. Pour les images non encombrées, où, même à l’équilibre, il y a quelques molécules uniques, un cadre peut-être être traité pour corriger lui-même. Cette approche n’est pas applicable à un endroit encombré, où les molécules simples occupent densément place et nécessite une image d’arrière-plan à acquérir pour aplatir. Images aplaties sont alors seuillée pour pixels avec une intensité au moins 3 fois l’écart-type de fond, plus sa valeur moyenne. Molécules simples sont alors automatiquement détectés en identifiant les pixels en cluster 4-9 avec la circularité supérieure à 0,5 en utilisant les fonctionnalités d’analyse des particules de Fidji. D’après les résultats, l’intensité moyenne d’une molécule unique peut être calculée. Il est utilisé pour déterminer le nombre de molécules uniques sur un endroit encombré en divisant l’intensité totale spot anticorps par l’intensité moyenne connue d’une seule molécule. Ces étapes peuvent être automatisés en utilisant l’éditeur de script de Fidji.
Une série de concentration est exécutée pour déterminer le nombre de molécules simples à l’équilibre dans les gouttelettes avec des concentrations connues de la protéine p53 recombinante (Figure 3 a). Les conditions sont telles que les taches d’anticorps de capture capturent une fraction de la protéine cible totale, environ 1 % dans la région de linéarité (pour5-10 108 protéines par gouttelettes R2 = 0,99). Le degré de liaison non spécifique dans les gouttelettes est 187 ± 60 molécules. Les résultats de la seule cellule pulldowns peuvent ensuite être convertis pour obtenir la répartition du nombre de copies de protéine absolue par cellule. Figure 3 b montre la répartition des expression absolue de p53 dans des cellules individuelles de BE à l’aide de SMA. Expression de la protéine p53 dans les cellules BE, qui peut être censé pour être génétiquement identiques ou très similaires, est un processus stochastique. La distribution est de type Gamma - asymétrique et unimodale avec une longue queue. Par conséquent, la moyenne (1,82 × 106 protéines) peut surestimer l’abondance de la protéine modale (bin 0 - 5,0 × 105 protéines), et l’écart-type (1,88 × 106 protéines) n’est pas pleinement saisir les caractéristiques de la distribution. Cette distribution est un exemple de l’importance des mesures de la cellule unique pour capturer l’hétérogénéité de l’expression de la protéine dans la population de cellules, qui serait autrement perdue quand une moyenne avec les mesures en vrac. Des paramètres supplémentaires pour chaque cellule peuvent être mesurées. Ici, le volume de la cellule est estimé en mesurant chaque diamètre cellulaire avant lyse dans la goutte et en supposant que la cellule est approximativement sphérique. Figure 3 montre une comparaison du nombre de copies absolue de protéine p53 dans des cellules individuelles de BE en fonction de la taille des cellules. Il y a une tendance pour les plus grosses cellules à un plus grand nombre de copie totale de p53. Fait intéressant, il est possible de la distribution qu’il existe une coordination entre l’expression de p53 et la taille des cellules, puisqu’il semble y avoir un nombre de copies de p53 minimale par cellule ; Toutefois, les mécanismes par lesquels cette question se pose exige davantage enquête.
Figure 1 : gouttelettes adressable Microarray appareil et puce. (un) des gouttelettes sont distribués manuellement à l’aide d’un manipulateur 3 axes à traduire une buse de tuyaux concentriques. La goutte de solution aqueuse est dispensée à des emplacements spécifiques dans un microréseau d’anticorps suivie d’écrêtement huile. (b) l’isolant permet une plus grande densité de gouttelettes adressables sur le substrat en limitant la propagation de l’huile. Isolateurs peuvent être produits par laser coupe 0,5 mm acrylique de feuilles. Pour faciliter la visualisation des gouttelettes, bleus colorant colorant alimentaire se dépose à l’aide de l’appareil en un). Balance bar 10 mm, échelle en médaillon bar mm 1. (c) la buse concentrique tube permet aux gouttelettes adressables à se former, assemblés comme à l’étape 1.2 du protocole. (d) un microinjector et un micromanipulateur sont utilisés pour isoler les cellules goutelettes adressable individuels, préparé comme au point 1.3 du protocole. (e) les principales étapes dans le processus de création et chargement des gouttelettes adressables est montré. Un endroit d’anticorps se trouve à l’aide d’une étape de traduction codée (1) lorsque l’extrémité du tube capillaire est alignée (2) et les composants aqueux (3), puis l’huile (4) sont dispensés. Cellules individuelles peuvent être chargés à l’aide d’un verre de microcapillaire (5-8), qui peut traiter la goutte aqueuse (7) et déposer une cellule (8) à plusieurs reprises. 100µm de barreaux de l’échelle. La flèche rouge (5) et (8) met en évidence la seule cellule isolée et l’encart (8) montre la cellule unique isolée à fort grossissement (échelle bar 10 µm). De référence12, reproduit avec la permission de la Royal Society of Chemistry, certaines parties de cette figure a été modifiée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : étapes d’analyse d’Image. Chaque tache dans le tableau est périodiquement photographié au microscope TIRF jusqu'à ce que l’équilibre (tEq) est atteint (90 min pour l’analyse de p53). Le temps d’équilibre dépend de t dans la solution ainsi que les affinités de paire des anticorps à la protéine ciblée. ) une images de microscopie FRBR exemple seule molécule de l’arrière-plan, mais aussi un exemple unicellulaire pulldown (échelle bars 20 μm). Image en médaillon montre une portion agrandie de l’image de fond avec quelques molécules simples mis en évidence par les flèches rouges (échelle bar 5 μm). b) schéma d’analyse d’images exposées à l’étape 3 du protocole. Brièvement, il existe deux grands régimes où les taches peuvent être considérés des molécules simples, non encombrées sont clairsemées et congestionné, où la densité des molécules simples est telle qu’il y a un chevauchement important et ne peut-être plus être identifiables individuellement. Une étape cruciale dans l’analyse d’image est champ aplatissement pour supprimer l’effet du profil non-uniforme intensité du laser excitation. Dans le régime de comptage numérique, molécules simples sont identifiés directement, basé sur les paramètres de leur intensité et la forme. Dans l’analogue comptage de régime, le nombre de molécules uniques est calculé en mesurant l’intensité totale de spot en équilibre et en divisant par l’intensité moyenne d’une molécule unique, qui est connue par le régime de comptage numérique. Étapes peuvent être carrément automatisés dans ImageJ pour analyser les données. La séquence de panneau de fond d’images montre l’accumulation de la protéine-cible sur la capture des anticorps spot ; au départ, les spots ne sont pas congestionné (t1) alors que comme protéine cible s’accumule sur le spot de l’anticorps, les molécules simples peuvent devenir de plus en plus congestionné (tn) jusqu'à ce que l’équilibre est atteint (teq). Remarque que si une tache reste non encombrées ou devient congestionnée dépend d’un certain nombre de facteurs, en particulier l’abondance de protéine cible dans le volume de l’analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : simple des données de la cellule. Quantification absolue est obtenue à l’aide d’une courbe d’étalonnage. (un) unique molécule compte est fabriquée en utilisant des concentrations connues de protéine recombinante. C’est une courbe d’étalonnage et sert à convertir la seule molécule compté sur chaque terrain pour nombre de protéines cibles dans le volume de l’analyse et donc simple nombre de copie de cellules. La ligne pointillée rouge horizontale indique le niveau de liaison non-spécifique de 187 ± 60 molécules. Les barres d’erreur sont un écart-type de la moyenne des 3 expérimental s’exécute. La ligne pointillée représente 100 % de détection de la protéine. (b), une distribution de la p53 basale de cellule unique expression de la protéine dans les cellules cancéreuses BE s’affiche montrant une distribution de type gamma à longue queue où l’expression de la protéine p53 dans certaines cellules est significativement plus élevée que la valeur modal. terrain (c), à la dispersion du nombre de copies de protéine p53 par cellule en fonction du volume des cellules montrant comment l’expression de la protéine varie en fonction de la taille des cellules. Certaines parties de cette figure ont été modifiés du 12 et reproduits avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Adressable Droplet Microarrays sont une méthode sensible et extensible pour déterminer quantitativement le nombre de copies absolue de protéine dans une seule cellule.
Limiter le degré de liaison non spécifique (NSB) est critique au sein du protocole à la réalisation plus bas une limite de détection que possible. Protéines et autres espèces biochimiques pouvant lier non spécifique à un certain nombre d’interfaces présentes dans les gouttelettes — la surface de la lamelle couvre-objet, l’anticorps spot et l’interface huile/eau. Les protéines peuvent être perdus en partitionnant dans l’interface ou l’huile elle-même. Nous avons montré que 4 % de BSA présente dans les gouttelettes aqueux est capable de limiter l’ONN des protéines utilisant les anticorps spécifiés dans le protocole. Alternatives de protéines cibles et les anticorps utilisés pour détecter les peuvent exiger des modes de blocage, ces détergents non ioniques ou compatibles agents tensio-actifs. Les huiles fluorées peuvent également être testés pour leur aptitude à servir comme l’huile de coupe. Dans ce cas, des considérations supplémentaires tels que la concentration micellaire critique et la densité de l’huile de coupe s’impose.
Le tampon d’impression non lavé, qui reste fixée à chaque localisation spot après parant de sida dans l’alignement. Quand au départ du dépôt les gouttelettes, il faut pour pas rayer ou d’endommager le spot d’anticorps par l’extrémité de la buse de tuyaux concentriques. En développant la méthode plus loin, un colorant fluorescent peut être dopé dans le tampon d’impression d’anticorps qui devient immobilisé en plus de l’anticorps de capture. Cela permettrait pour le lavage et blocage des étapes à accomplir avant de gouttelettes parant ; Toutefois, une telle mesure serait pas nécessairement requise si vous utilisez des méthodes automatisées de gouttelettes qui parant comme méthodes d’impression jet d’encre.
La surface des lamelles sur le marché de produits locaux sur laquelle sont forment les gouttelettes est recouvert d’un polymère hydrophile et aqueux gouttelettes produites sur eux avec un volume de 10 nL ont un diamètre de 751 ± 42 mm. Il y a une limite à combien la gouttelette déposée doit mouiller la surface ou se propage à cause du poids de l’huile de bouchage puisqu’il y a dessous une épaisseur minimum a augmenté de dispersion optique du laser d’excitation de la FRBR. La dispersion augmente le niveau moyen de fond et peut se noyer un signal lors de la détection de molécules simples. Le spot d’anticorps doit également être situé loin du bord de la goutte, puisque la lumière de laser d’excitation peut partiellement ou entièrement frapper une zone à l’extérieur de la goutte de solution aqueuse. La condition de l’angle critique sera n’est plus remplie pour la lumière frappant l’interface verre-huile, par opposition à l’interface eau-verre.
Pour déterminer quantitativement l’abondance de protéine le nombre de molécules uniques lié à un endroit doit être déterminés par analyse d’image. Pour déterminer le total quantité de protéines dans la solution du comte de la molécule unique une courbe d’étalonnage est nécessaire et permet à la technique d’être absolument quantitatif.
Pour minimiser le photoblanchiment, taches sont imagés pas en permanence et la puissance de source du laser d’excitation FRBR est réduit au minimum. Le protocole présenté a été utilisé avec succès pour PhotoStation fluorophores tels que l’Alexa Fluor dyes. Fluorophores alternatifs peuvent être utilisés mais le photoblanchiment doit être évalué et le protocole d’imagerie adaptée si nécessaire. Le nombre total de molécules uniques par image peut-être être tracé contre la montre pour reproduire la courbe de liaison, bien que ce n’est certainement pas nécessaire que si la cinétique de liaison n’est pas recherchés et d’imagerie un cadre unique à l’équilibre suffira.
Même si on a besoin de deux anticorps de haute affinité, cela se traduit par un dosage très sensible et très spécifique, crucial pour les mesures au niveau de la cellule unique. Les anticorps de p53 utilisés dans le présent protocole sont bien optimisés dans la détection de p53 libre de cellules individuelles. La protéine-cible est déterminée par le choix des anticorps et peuvent être modifiée dans un certain nombre de façons : 1, les deux les anticorps de détection et de capture peuvent être remplacées pour lier des cibles alternatives ; 2, l’anticorps de détection peuvent être remplacés pour sonder les interactions protéine-protéine ou des modifications post-traductionnelles à la protéine liée à l’anticorps de capture, par exemple déterminer l’état de phosphorylation de la p53 capturé ; 3, dosages multiplexés peuvent être réalisés en imprimant plusieurs spots d’anticorps de capture à proximité — impression un 3 × 3 spot tableau est possible au sein de gouttelettes 10nL. Bien sûr, pour toute modification de la protéine cible un nombre d’écrans d’anticorps, contrôles et optimisations doivent être entreprises.
Plusieurs méthodes pour lyser les cellules individuelles ont été signalés. 33 optique lyse est une approche sans produits chimiques pour rapidement lyse des cellules individuelles sans altérer le contenu des cellules et maintenir l’intégrité des protéines et de leurs complexes. Lyse chimique à l’aide de détergents pose un problème pour l’intégrité des gouttelettes lors de l’utilisation de l’huile minérale et peuvent interférer avec les interactions entre les molécules. 34 Toutefois, pour les essais où lyse chimique est compatible C’est approche intéressante puisqu’il n’est pas tributaire de l’équipement comme les lasers ou les électrodes micromotifs. 35
Les gouttelettes montrent des performances comparables avec des méthodes alternatives unicellulaire. Dans l’actuelle génération de gouttelettes en utilisant les anticorps p53 suggéré, le niveau de NSB est 187 ± 60 molécules par endroit. Les comtes de la molécule unique pièce forte linéarité (R2 = 0,99) dans la région s’étendant sur 108 5 –10, p53 recombinant protéines par goutte. Ceci suggère que bien que les niveaux inférieurs de la protéine peuvent être détectées dans les cellules, il y a une limite de quantification de 10 protéines p53 de5 ; Cela correspond à un décompte de la molécule unique sur les spots de 901 ± 83. Ceci est principalement limitée par le volume des gouttelettes et adsorption à l’interface. La performance du test p53 est telle que lorsque effectuée chez un 10 nL volume seulement 1,1 ± 0,2 % de la protéine cible totale est capturée de solution ; Cela augmente à 85 ± 9 % lorsque la réduction du volume de l’analyse à 0,2 nL. 36 en réduisant le volume des gouttelettes de dessous 1nL et l’adsorption, il est possible en utilisant les anticorps anti-p53 dans l’amélioration de la limite de détection à spécifié < 50 protéines par cellule. Par conséquent, gouttelettes adressables sont susceptibles de servir à mesurer des protéines de très faible abondance de cellules individuelles.
L’adressabilité des gouttelettes offerte par le bouchon d’huile facilement pénétrable permet le volume d’analyse cellulaire à être contesté dans l’ordre. L’utilisation d’une micropipette permet l’injection d’un nombre souhaité de cellules dans chaque goutte sur une fiche de 10-20 pL, qui n’augmente pas significativement le volume. Pour la puce présentée dans la Figure 1 b avec 100 puits, pour former des gouttelettes et de les charger avec des cellules individuelles en général prend 75-90 min. cellules de chargement peut également être réalisée en se penchant sur la goutte en utilisant le tuyau buse au lieu de la micropipette concentriques ou en utilisant un solution contenant des cellules lors de la formation initialement les gouttelettes. Ce dernier serait utile en limitant le nombre d’étapes dans le protocole, mais, dans les deux cas, le taux d’occupation par goutte suivrait une distribution poissonnienne. Cela limiterait la proportion des données de cellule unique par puce ; Toutefois, des gouttelettes avec zéro, une ou plusieurs cellules servirait de contrôles. Une limitation supplémentaire à l’aide de la buse concentrique à gouttelettes d’adresse est que le volume de la goutte augmenterait 10nL incréments. Avec les modifications suggérées ci-dessus présente pourraient être améliorées. Gouttelette microfluidique est capables de produire des gouttelettes à haute fréquence et ont un potentiel en étant automatiquement combinés avec SMA pour produire et manipuler des gouttelettes et déposez-les dans l’ordre dans un reseau planaire sur puce. Cela aurait certainement surmonter les limitations dans la production des SMA tout en permettant aussi à lecture seule molécule de gouttelettes.
La capacité d’adresser chaque gouttelette individuelle a une gamme d’utilisations possibles. Nous avons démontré la possibilité de charger dans l’ordre des cellules individuelles. Elle permet également le déménagement indépendant post matériel cellulaire lyse de l’analyse post pour analyse à l’aide d’autres méthodes à l’aide d’une pipette. Exemples d’analyses ultérieures comprendraient quantitative PCR en temps réel ou spectrométrie de masse.
D'entre les goulots d’étranglement actuels pour les laboratoires souhaitant adopter une approche quantitative à l’analyse des protéines monocellulaires est la barrière technique élevée et le besoin d’équipement spécialisé. Avec SMA, miniaturisés, des analyses de sensibilité élevée peuvent être obtenus sans la nécessité pour les salles blanches pour la fabrication des dispositifs microfluidiques lab-on-a-chip. Des expériences ne sont pas limités par la conception de la puce et leur volume et leur position peuvent être modifiées sans le besoin de fabriquer de nouveaux maîtres. Certes, il y a des possibilités d’amélioration de la simplification de la technique et en abaissant la barrière à l’entrée pour l’analyse de la cellule unique à juste un microarrayer, pour imprimer les anticorps et gouttelettes microarrays et un lecteur de microplaques de fluorescence, à l’image.
Un certain nombre d’applications cliniques de l’analyse de la cellule unique font leur apparition, notamment dans le traitement du cancer. L’hétérogénéité tumorale est un défi majeur à la chimiothérapie efficace. Dans le développement de tumeurs, les mutations surviennent avec une fréquence croissante et peut entraîner la hétérogénéité morphologique, génétique et la variabilité de la protéomique. Analyse de cellule unique est capable de résoudre l’hétérogénéité cellulaire au sein d’une tumeur et fournir une plate-forme pour aider à mieux comprendre et prédire la pharmacothérapie de guide et de résistance.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
ASR conçu des expériences, mis au point des protocoles et analysé les données. SC et PS effectué des expériences de taille de cellule. ASR et OC a écrit le manuscrit. Les auteurs tiennent à remercier sincèrement le soutien du professeur David R. Klug pour donner accès au matériel. Les auteurs tiennent à remercier l’Imperial College Advanced Hackspace pour l’accès aux installations de prototypage et de fabrication.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
