Summary
在这里, 我们提出了可寻址的液滴微阵列 (ADMs), 一种能够确定单细胞中绝对蛋白质丰度的液滴数组方法。我们展示了 ADMs 的能力来表征肿瘤抑制蛋白 p53 在人类癌细胞系中表达的异质性。
Abstract
通常, 在人口层面分析细胞行为和细胞反应, 在这种情况下, 许多细胞的反应汇集在一起, 平均结果掩盖了复杂人群中丰富的单细胞行为。单细胞蛋白检测和定量技术近年来取得了显著的效果。在这里, 我们描述了一个实用的和灵活的单细胞分析平台, 基于可寻址滴微阵列。本研究描述了如何用单细胞分辨率测量靶蛋白的绝对拷贝数。抑癌 p53 是人类癌症中最常见的突变基因, 超过50% 的癌症病例表现出一种非健康的 p53 表达模式。该协议描述了创建10个 nL 液滴的步骤, 其中单独的人类癌细胞被隔离, p53 蛋白的拷贝数用单分子分辨率测量, 以精确确定表达的变异性。该方法可应用于任何细胞类型, 包括主要材料, 以确定任何感兴趣的目标蛋白的绝对拷贝数。
Introduction
该方法的目的是确定单个细胞分辨率的细胞群体中目标蛋白丰度的变化。单细胞分析提供了一些不具备传统的集成生物化学方法的好处。1,2,3,4,5首先, 在单细胞水平上工作可以捕捉到一个细胞群的丰富异质性, 否则会因传统的集成生物化学技术所产生的平均值而丧失。大多数的工作-马生物化学方法与散装工作, 要求, 因为他们经常做, 数以百万计的细胞产生的结果。当然, 评估整个细胞数量的后果取决于许多因素, 例如, 蛋白质表达的异质性可能会遗漏蛋白质丰度分布的一些重要特征。从实际的角度来看, 单细胞技术所需的灵敏度使它们能够处理大量的生物材料, 即使是更敏感的散装技术也不足以发挥作用。这方面的一个关键例子是研究稀有细胞类型, 如循环肿瘤细胞 (CTCs), 即使对于预后较差的患者, 也不到 10 CTCs 可能会出现在一个7.5 毫升的血液抽取中。6在这里, 我们提出了执行单细胞蛋白测量所需的方法, 采用减少体积抗体为基础的检测, 使用在抗体芯片上印有油的水滴。
微流控液滴平台是高通量, 能够产生数以千计的水滴每秒, 并能够隔离, 甚至培养, 单个细胞在单个的水滴, 以执行广泛的一系列生化化验。基于雾滴的技术非常适合于单细胞分析,7,8,9 , 最近的例子包括 DropSeq10和 inDrop11, 这已经大大的力量帮助放大技术。蛋白质的有限数量和不扩增方法使单细胞蛋白质组学特别具有挑战性。
液滴可通过多种方法分析, 荧光显微镜已得到广泛应用。单分子技术, 如全内反射荧光 (TIRF) 显微术, 使荧光分子能够被可视化的信噪比无与伦比。12由于消逝的领域的指数衰变, 只有显影在高接近度到表面 (顺序 100nm) 是激动的做 TIRF 一个好战略在检测少量目标分子在复杂混合物。TIRF 固有的光学切片强度也有助于避免洗涤步骤和限制化验时间和复杂性。然而, TIRF 需要平面和 TIRF 显微镜的例子, 用于流中的水滴涉及形成一个平面表面的图像。13为此, 单细胞蛋白质组技术通常以微阵列的形式在表面固定化的捕获剂周围设计微流控芯片。4,14
水滴, 本身, 可以形成在阵列上的平面表面, 所谓的水滴微阵。15,16,17在空间上组织的水滴进入阵列, 使它们能够方便地编制索引, 在一段时间内易于监测, 单独寻址, 并在需要时检索。液滴微阵列可以实现高密度的微型反应堆, 每个芯片上有数以千计的元素, 它们要么是自由的, 要么由 microwell 结构支撑。18,19,20可通过液体搬运机器人、喷墨检举器、接触 microarrayers21、22、23、24、25等顺序沉积形成 26或者他们可以自组装在表面上, 如 superhydrophillic 斑点在超疏水性表面图案。27,28,29
考虑到这些因素, 可寻址液滴微阵列 (ADMs) 设计为将微滴微阵列的多功能性、空间寻址和体积减小与单分子 TIRF 显微镜的灵敏度相结合, 以定量测量蛋白质丰度。5 ADMs 使单细胞分析形成一个含有单细胞的液滴微阵列在抗体微阵列上, 然后用油覆盖以防止蒸发。水滴的体积是离散的, 以防止样本损失, 否则将通过芯片阀门在连续流微流体实现。30单个细胞中靶蛋白的绝对量非常小;然而, 减少的水滴体积允许相对较高的局部浓度, 以便他们被检测使用三明治抗体检测-抗体是固定在一个明显的区域, 或斑点, 在一个表面上, 捕捉蛋白质, 从而绑定荧光标记的检测抗体存在于液滴容积中。作为一个无标签的方法 (即蛋白质靶不需要直接标记), ADMs 一般适用于分析主要来源的细胞, 如处理的血液, 精细需要吸出物和分离的肿瘤活检, 以及细胞从文化和他们的裂解物。
测量细胞中蛋白质丰度的变化在确定反应的异质性方面很重要, 例如药物, 并有助于提供对细胞功能和通路的洞察, 评估亚人口及其行为, 并确定罕见的事件, 否则将掩盖的散装方法。本协议描述了如何生产和使用可寻址的液滴微阵列来定量地测定人类癌细胞中转录因子 p53 的丰度, 并可用于研究 p53 在化疗药物反应中的作用。靶蛋白由捕获和检测抗体的选择决定, 并可被修改以包含更多或不同的目标。提供说明, 以建立一个简单的设备, 其中包含一个同心喷嘴从一般实验室消耗品, 手动阵列 10 nL 油滴。充分的实验过程被描述, 每滴然后被装载与一个单细胞, 然后裂解和蛋白质的表达由单分子决议决定使用 TIRF 显微镜。
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Protocol
1. 准备
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制作芯片和打印抗体微阵列
- 将粘合剂硅胶/丙烯酸隔离器附着在盖玻片功能上, 以支持抗体芯片。这被称为芯片。
注: 各种表面化学试剂已经过测试, 以适合与可寻址的水滴。5表面化学物质可能需要对替代捕获剂进行优化。ADM 隔离器是可利用的商业或可由激光切割丙烯酸 (CAD 文件为隔离器使用的这项工作是作为下载提供; 请参阅补充代码文件)。 - 打开 microarrayer, 将湿度设置为75%。
注意: 相对湿度减少了芯片针的打印溶液蒸发, 减少了内部和点间的变化。 - 用超声波清洗针清洗液中的微阵列针5分钟。用洗瓶器用超纯水冲洗别针, 用氮气干燥。
注: 将 pin 挂起, 只浸入针脚尖端。如果无法获得 pin 夹, 则用适当钻孔的一组孔进行显微镜滑动会有帮助。 - 制作5毫升的打印缓冲器, 包括 3 x 盐水钠 (SSC) 缓冲器, 1.5 米甜菜碱补充0.01% 的月桂酸钠 (SDS)。储存在4摄氏度无限期。
- 要准备一个打印解决方案, 解冻 anti-p53 抗体 (p53/Mdm2 ELISA 试剂盒; 见材料表) 整除数存储在-80 摄氏度。将其与打印缓冲器混合 1:1, 最终浓度为0.5 毫克/毫升。使用微和 microarrayer 中的位置在384µL 中加载5-10 的打印解决方案。
- 加载芯片组装在步骤1.1.1 进入 microarrayer。程序的 microarrayer 打印点的坐标定义的每个井的隔离器。
注: Microarrayers 采用了一系列的、主要的专有软件, 因此鼓励读者查阅相关文献。在1.1.1 中, 伴随 CAD 文件中的 ADM 隔离器所需的微阵列包括矩形元件;提供了相关的距离。 - 将芯片存放在密闭的容器中, 用箔包装。存储在4°c 6 周。
注: 箔是为了防止任何照片损坏。存储在4°c 限制生物分子的降解率和任何可能采取行动减少微阵列活动的有害反应。密闭容器允许芯片在使用前平衡到室温, 而不会在芯片表面形成冷凝。接触芯片印刷利用表面张力和附着力之间的打印解决方案和印刷承印物产生斑点。印前或印迹通常需要从微阵列中去除多余的溶液, 以产生均匀大小的斑点。不要丢弃牺牲预打印盖玻片, 因为它可以用来评估批次质量。
- 将粘合剂硅胶/丙烯酸隔离器附着在盖玻片功能上, 以支持抗体芯片。这被称为芯片。
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准备注射器, 油管和同心喷嘴来分配可寻址的水滴
- 拆卸100µL (为水滴) 和1毫升 (用于封盖油) 玻璃哈密尔顿注射器和漂洗的零件与蒸馏的 H2O。
- 将100毫米长度的150µm ID/360 µm 外径熔融硅胶油管通过40毫米长度1.0 毫米 ID/1/16 "外径粉煤灰油管, 直到它突出了2毫米。这将形成同心喷嘴。
- 将一层薄薄的氰胶涂在10µL 吸管尖端的末端, 并插入40毫米的1.0 毫米 ID/1/16 "外径的粉煤灰导管"。如果需要, 重新定位熔融硅胶油管, 以保持在喷嘴前的2毫米突出的粘合剂集。
- 将熔融二氧化硅毛细管的另一端插入200毫米长 0.014 "ID/0.062" 外径聚四氟乙烯油管的一端, 并将其连接至100µL 哈密尔顿注射器, 填充有4% 牛血清蛋白 (BSA) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (PBSA)。
注意: 蛋白质和其他生化物种可能非特异地绑定到表面, 并且可以丢失或变性。BSA 用于 "阻止" 曲面, 通过牺牲绑定到这些曲面来最小化非特定绑定。 - 插入一个400毫米长1.0 毫米的 ID/2.0 毫米外径 FEP 油管到200µL 吸管提示, 直到它形成一个印章。将一层薄薄的氰胶水涂到另一200µL 吸管尖端, 并将其推入第一个尖端, 以固定油管到位。将 1.0 mm ID/2.0 mm 外径 FEP 油管的开口端连接到一个1毫升的哈密尔顿注射器中, 填充矿物油。
- 将200µL 吸管尖端组件插入同心喷嘴的10µL 吸管尖端。将注射器放在单独的注射器泵中, 因为它们需要独立操作。
- 用 4% PBSA 阻断溶液填充100µL 注射器。用堵塞溶液重新连接并冲洗 "水" 油管。重复两次, 总共3个刷新。
- 填充100µL 注射器与0.125 µg mL-1检测抗体 (anti-p53 抗体 (DO-1) 标签与 Alexa 488) 在 4% PBSA 和重新连接油管。用25µL 检测抗体溶液代替油管中的堵塞液。
- 用矿物油冲洗 "油" 油管, 直到所有油管和喷嘴充满油。用矿物油重装1毫升注射器, 再附加油管。将油管和喷嘴组件固定到 XYZ 机械手上。
-
准备 microinjector 和机器人
注: 下面的步骤具体提到材料表中指定的 microinjector 和机器人设备的组件, 但通常适用于任何此类设备。- 通过附加压力管和毛细管支架装配 microinjector。
- 慢慢旋转活塞表盘, 直到矿物油完全填满线。
- 将毛细管支架装入平移头安装。
- 用握头固定毛细管的毛细管。
- 将 4% PBSA 的溶液注入隔离器的一个井中。
- 使用机器人进行翻译, 并将毛细管的尖端浸入溶液中。
- 慢慢地用 4% PBSA 填充毛细管, 然后离开以阻挡10分钟。
- 弹出 microcapillary 并旋转平移模块, 使组件清除芯片。
2. 用单细胞形成可寻址的水滴和负载
- 形成可寻址的水滴
- 在显微镜阶段保护芯片。
注: 显微镜是一种倒置荧光自动显微镜, 可单分子 TIRF 装有一个编码 XY 阶段和电子倍增电荷耦合装置摄像头 (EM CCD)。 - 使用自动显微镜控制软件记录阵列中每个点的显微镜阶段坐标。
- 在显微镜阶段设置 XYZ 机械手。把喷嘴放在50-60°的角度。确保喷嘴有足够的长度和间隙到达芯片。设置 ' 水 ' 和 ' 油 ' 注射器泵分配 10 nL 在100µL/分钟和5µL 在100µL/分钟, 分别。
注: 在准备过程中, 喷嘴头部的水溶液可能会干燥。 - 分配水溶液直到喷嘴头部可见液体珠子。用无尘擦拭擦除。
注: 根据调查的条件, 预留数口水井作为细胞的储层。对于单个单元格线/类型单个水库就足够了。 - 使用自动显微镜控制软件, 将显微镜阶段坐标设置为阵列中的抗体点, 并将焦点放在盖玻片表面。
- 小心不要扰乱现场, 使用 XYZ 机械手, 将同心喷嘴的玻璃毛细管尖端对准抗体点的一侧, 并分配 10 nL 水溶液。没有移动的阶段, 分配5µL 的油来盖水溶液。慢慢地提高喷嘴清除液滴和移动到下一个井。
- 对阵列中的所有抗体点重复步骤2.1.6。
- 30分钟后, 图像所有斑点在阵列使用自动显微镜控制软件, 以确定单一分子的背景, 每一个抗体斑点之前, 加载细胞。
- 在显微镜阶段保护芯片。
- 用单元格加载可寻址的水滴
- 使用胰蛋白酶/EDTA 溶液从孵化器中取出细胞培养瓶和分离细胞。
注: 本研究采用 Dulbecco 修饰鹰培养基 (DMEM) 对人结肠癌细胞系进行培养, 并辅以 10% (v/v) 胎牛血清 (血清), 共2个孵化器。 - 如果需要, 荧光染色细胞。
- 并用重悬细胞中的0.125 微克/毫升检测抗体 (anti-p53 抗体 (DO-1) 标签与 Alexa 488) 10% 血清在 L-15 媒体。为了确保单个细胞悬浮, 过滤细胞溶液通过40µm 间距细胞过滤器。
- 用 hemocytometer 计数细胞, 稀释或浓缩细胞溶液浓度为 25-400 x 103细胞/毫升。这确保了细胞沉积有足够的间距, 以舒适地操纵 microcapillary。
- 使用机器人和 microcapillary 将单个细胞从细胞库中加载到可寻址的水滴中。
注意: 非粘附细胞可以大量加载到微中, 并将一个人分成一个可寻址的水滴。尽管表面阻断处理, 黏附细胞线将倾向于不明确地坚持玻璃 microcapillary 内壁和丢失。 - 使用10×目的观察, 使用 microinjector 从细胞库中吸入单个细胞进入 microcapillary。
- 如果使用电子机械手舞台或手动记下 z 位置, 则存储机器人阶段坐标。
- 将微向上平移, 以清除芯片的1毫米高度。用操纵杆手动执行此操作, 或自动使用电子机械手阶段的 "弹出" 功能。
- 使用自动显微镜控制软件将舞台坐标设置为可寻址的水滴。' 注入 ' 微通过返回到存储 (或指出) z 位置。使用操纵杆手动执行此操作, 或在采用电子机械手阶段时自动进行。
注: microcapillary 将刺穿盖油并且位于可寻址的水滴的水部分之内。 - 使用 microinjector 在可寻址的水滴中分配单元格。10 nL 寻址液滴的体积将增加不到1%。
- 重复 2.2. 5-2. 2.9 为剩余的可寻址的水滴留下一些免费的实验控制, 其中可寻址的水滴不包含细胞。
注意: 使用 microcapillary 和机器人将单个单元格加载到可寻址的水滴的一个简单的替代方法是在步骤1.2.8 中替换该解决方案, 并在 4% PBSA 中包含细胞的检测抗体的解决方案, 其浓度为105细胞/毫升, 相当于 1 cell/10 nL。单细胞占用将泊松, 细胞浓度将需要优化。
- 使用胰蛋白酶/EDTA 溶液从孵化器中取出细胞培养瓶和分离细胞。
- 溶解细胞和图像阵列
- brightfield 显微镜下的水滴中的图像细胞, 包括任何荧光成像。
注: 成像需要大约3分钟的图像 ~ 100 滴使用自动显微镜。用 60 NA = 1.49 的油浸泡目标进行成像。brightfield 成像不需要过滤器, 而标准过滤器集用于荧光成像。 - 使用单分子 TIRF 显微镜对阵列中的所有斑点进行图像处理。
注意: 设置在步骤2.3.1 中用作专用的 TIRF 筛选器集。这些图像将随后分析在3节, 以确定的背景下, 单个分子绑定到每个抗体斑点之前, 裂解。使用全内反射荧光 (TIRF) 显微镜的单分子成像大约需要5分钟到100点的图像。 - 聚焦在一个可寻址的水滴中的细胞上。通过聚焦单个 6 ns 激光脉冲 (波长 1064 nm, 脉冲能量 14.1, 每脉冲0.3 µJ) 接近细胞的位置, 实现完整的光裂解。
注: 激光脉冲建立了一个膨胀的空化气泡, 它能剪切细胞并释放细胞成分进入水滴体积。4,31由于激光诱导裂解而产生的机械过程不会干扰低脉冲能量的油水界面。光裂解通常需要大约20-30 分钟溶解100细胞。正如讨论部分所讨论的那样, 如果不能进行光学裂解设置, 就有许多替代方法来溶解单个细胞。 - 对所有含有细胞的可寻址液滴重复5个自由的实验控制, 其中可寻址的水滴含有不裂解的细胞。
- 记下每个单元格裂解的时间。
注意: 这些时间将用于纠正步骤3.1.9 中每个点的单个绑定曲线。通常, 要注意第一个和最后一个单元格是裂解的, 并且估计其余的时间假设在裂解事件之间有足够的一致性。 - 使用 TIRF 显微术获取单个分子图像, 每10分钟为前30分钟, 然后每20分钟为60分钟。如果只对蛋白质在平衡中的数量有兴趣, 在室温下孵化芯片90分钟后, 图像所有斑点。
注: 达到平衡的时间取决于液滴体积和检测中所用抗体的亲和力。TIRF 显微镜是使用激光励磁源在 = 488 毫微米和1.5 兆瓦功率测量在后光圈使用光功率计。通过将 EM CCD 摄像机的采集设置设置为900毫秒采集时间, 16 位数字化, 1 MHz 读出率和 em 增益因子 10, 获得单分子图像。隔离器可通过仔细拆卸盖玻片重新使用。
- brightfield 显微镜下的水滴中的图像细胞, 包括任何荧光成像。
3. 数据分析
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单分子计数 (非拥塞/数字体制)
- 使用斐济 (或 Matlab), 对于任何非拥塞抗体点, 加载在裂解前获得的图像 (背景, BKD)。
注意: 使用斐济图像分析软件直接执行以下步骤中的操作。在以下链接 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html 中可以找到用户指南。 - 在斐济, 选择 BKD 图像。在 "图像" 菜单中选择 "复制" 来复制 BKD。选择重复图像并在 "进程 > 筛选器" 下, 选择 "高斯模糊" 并指定50像素半径。
- 将 BKD 图像通过模糊 BKD 图像分割, 产生 BKD_FLAT, 使 BKD 图像扁平化, 从而使励磁光源有有效的均匀强度分布。
- 在 "过程" 中选择 "图像计算器...", 指定操作 "除法", 所需的图像, 并选择框 "创建新窗口" 和 "32 位 (浮动) 结果"。
- 将图像中的每个像素减去 1 ("进程 > 数学", 选择 "减法..." 并指定值 1)。平均像素强度应为0。
注意: 由于所有像素的总和应该是 0, 并且任何剩余的偏移量可能更直接地得到补偿, 所以可以轻松地检查字段拼合和拼合的背景图像。 - 在 BKD_FLAT 图像的4个角中, 选择50像素 x 50 像素区域。通过选择 "分析" 和 "度量" 来测量像素强度标准偏差 (σ)。
注意: 所选内容的摘要统计信息将显示在结果窗口中。这决定了非现场背景, 那里不可能有高密度的单一分子。可以使用默认菜单选择工具或运行宏代码 "makeRectangle (x、y、宽度、高度)" 手动选择要测量的区域;这将创建一个矩形选区, 其中 x 和 y 参数是左上角的坐标 (以像素为单位)。 - 将图像阈值设置为 3σ, 并创建二进制图像 SM_MASK。
- 在 "图像 > 调整" 下, 选择 "阈值...", 并将较低的阈值级别设置为3σ。
注意: 在阈值以下的像素被设置为零, 超过阈值的像素设置为1。阈值将决定阈值像素属于单个分子的置信度。
- 在 "图像 > 调整" 下, 选择 "阈值...", 并将较低的阈值级别设置为3σ。
- 在分割图像 SM_MASK 中, 通过选择 "分析" 后跟 "分析粒子" 并指定大小和圆形, 将像素强度值设置为零, 不具有4-9 像素2和圆形 0.5-1 的任何对象。
注意: 像素大小可能需要优化其他显影和显微镜设置 ups。由于相机噪声的类型, 单像素可能高于此阈值, 而不会被丢弃, 尽管不是单一分子。像素大小标准将正确丢弃此类像素。单个分子通常呈圆形。圆形值为1表示一个完美的圆圈, 而值接近0表示形状越来越长。其余的物体是单个分子, 可以计数。可以将掩码设置为标定现场的面积, 以区分每帧的现场和非现场计数。当有足够的信号当场, 然后可以应用于较早的帧时, 在以后获取的帧会更容易。 - 对于相同的非拥塞抗体点, 加载和重复步骤 3.1.1 3.1.7 的所有图像帧捕获的时间分辨系列获得后裂解。使用步骤2.3.5 中提到的溶解时间。以更正任何绑定曲线。
- 使用斐济 (或 Matlab), 对于任何非拥塞抗体点, 加载在裂解前获得的图像 (背景, BKD)。
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单分子计数 (拥塞/模拟机制)
- 为了计算单个分子的平均强度, 在继续之前, 重复步骤 3.1.1 3.1.8。
- 将图像 BKD_FLAT 和 SM_MASK 相乘, 产生一个图像, 即非零像素值与单个分子相关联。
- 要执行此操作, 请在 "进程" 菜单中选择 "图像计算器...", 指定运算 "相乘" 和所需的图像, 然后选择 "创建新窗口" 和 "32 位 (浮点) 结果" 框。
- 通过选择 "分析" 和 "度量" 来求和所有像素强度值;所选内容的摘要统计信息将在结果窗口中显示。除以每步3.1.8 计数的单个分子的数量, 计算每单个分子的平均强度。
- 对于任何拥挤的抗体点, 加载图像后溶解和扁平化的背景图像模糊的每步3.1.2 和3.1.3。
- 将拼合图像中的每个像素减去 1 ("进程 > 数学", 选择 "减法..." 并指定值 1)
- 在图像的4个角中选择一个50像素 x 50 像素区域, 并测量像素强度标准偏差 (σ)。有关详细信息, 请参阅步骤3.1.5。
- 通过将图像阈值设置为 3σ, 并将像素强度值设置为小于4像素2的任何对象的零, 创建二进制图像掩码。要执行此操作, 请在 "分析" 菜单下选择 "分析粒子" 并指定大小和圆形。
- 用二进制图像掩模将扁平拥塞抗体斑点图像相乘。
- 要执行此操作, 请在 "进程" 菜单中选择 "图像计算器...", 指定运算 "相乘" 和所需的图像, 然后选择 "创建新窗口" 和 "32 位 (浮点) 结果" 框。
- 剩余像素强度的总和, 选择 "分析" 后跟 "度量";所选内容的摘要统计信息将在结果窗口中显示。
- 用平均单分子强度除以像素强度的总和, 以计算绑定到拥塞点的单个分子的数量。
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绝对量化的标定曲线
- 重复1和2节, 形成 10 nL 可寻址液滴与检测抗体在 4% PBSA 溶液中的已知浓度重组蛋白。
- 通过改变添加到溶液中已知的重组蛋白浓度, 执行 102-107重组蛋白每液滴的浓度系列。建议在每液滴的蛋白质数量方面工作, 以使校准单细胞数据简单明了。
- 使用步骤3.3.2 中的浓度序列数据来校准每一个点的任何单个分子计数, 每液滴的蛋白质丰度, 以及每单个细胞的可拓蛋白质丰度。
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Representative Results
p53 的绝对基底蛋白拷贝数是在人结肠癌细胞系中以单细胞分辨率确定的, 是细胞。我们展示了 p53 的表达如何在几个数量级上变化, 并显示在静止的细胞群中细胞大小和蛋白质复制数之间的弱正相关。
可寻址液滴微阵列是当水滴在抗体斑点位置, 并以油为上限时形成的。在这里, 水滴支持一个敏感的 p53 蛋白检测。盖玻片使用接触 microarrayer 和 pin 排列捕获抗体斑点。anti-p53 捕获抗体取自商业 ELISA 检测试剂盒。印刷条件是这样, 捕获斑点约100µm 直径, 最大捕获能力为 6.2, 0.5 x 105蛋白质每点。32
使用与盖玻片结合的隔离器, 可以形成更高的水滴密度, 因为它限制了油的扩散到附近的抗体捕获点。在隔振液滴的每个井中, 通过分配水溶液来形成, 然后用油封上以防止蒸发 (图 1A)。少量的油可以被免除, 以限制液滴;然而, 它是有用的, 以分配的数量, 填补每个隔离器, 准确地说, 油面是平坦的成像。隔离器要么是商业来源, 要么是由激光切割丙烯酸片制成。硅胶隔离器是可用的预切井在 4 x 6 阵列 (n = 24), 但可能被修改为 4 x 11 阵列 (n = 44) 使用活检或多孔皮革冲床。图 1B中的激光切割隔离器显示了100个六角井的阵列, 每一个最大直径为2.89 毫米, 中心到中心的分离3.9mm 和高度0.5mm。水滴可以储存和保持稳定的时间长 (观察到3月)。
水滴是手工制作的, 使用家庭制造的设备, 它转换同心油管喷嘴 (图 1C), 这是连接到两个注射器泵 (图 1A)。同心油管喷嘴由熔融二氧化硅毛细管组成, 它通过短时间的 PEEK 油管, 使油相免除, 从而使水相分散。使用显微镜, 喷嘴与抗体点对齐, 泵首先将水溶液立即分配给油 (图 1E, 步骤 1-4)。当 ADM 中的所有水滴形成后, microinjector 和机器人 (见材料表) 被用来装载单个单元格的每个水滴 (图 1D)。微将从细胞库中捕获一个细胞, 在芯片上的一个井中, 被转化成一滴油井, 然后穿透油帽将细胞输送到水滴 (图 1D, 步骤 5-8)。
水滴内的所有斑点都在裂解之前被成像, 并将被用来确定非特定的结合点的程度 (图 2A)。单细胞是完全裂解 (包括细胞核) 使用光学方法。31光学裂解依赖于膨胀激光脉冲诱导的空化气泡的剪切力来破坏细胞。必须注意的是, 油-水界面不被这些过程干扰, 限制了脉冲能量和沉积细胞远离油/水界面。一旦细胞裂解, 该阵列是通过 TIRF 显微镜成像, 使用自动显微镜;帧被获取每10分钟为30分钟, 然后每20分钟为进一步60分钟。条件, 如抗体亲和性, 蛋白质扩散和水滴体积, 是这样的约束平衡是在90分钟的收购。典型的单个单元格下拉显示在图 2A中。
图 2B描述了用于确定单个分子计数的图像分析过程。斑点的图像要么被认为是不拥挤的, 其中目标蛋白质浓度是这样的, 单一分子是良好的分离和容易区分, 或拥挤, 其中靶蛋白浓度较高, 单分子图像重叠, 不再单独区分。由于 TIRF 励磁剖面不均匀, 所以所有获得的图像都是平场校正的关键。高斯模糊被应用到一个非拥塞的框架, 它充当平滑过滤器, 以消除细节和噪音, 并产生一个图像的平均轮廓的 TIRF 励磁剖面。此处理后的图像可用于 "拼合" 原始图像。对于非拥塞图像, 即使在平衡状态下, 也很少有单个分子, 所以可以处理一个框架来纠正它本身。这种方法不适用于一个拥挤的地方, 其中单个分子密集地占据现场, 需要一个背景图像, 以获得扁平化。然后, 将平坦的帧阈值为像素, 其强度至少为背景标准偏差的3倍, 加上其平均值。通过使用斐济的粒子分析特征, 通过识别4-9 个圆形大于0.5 的聚集像素, 然后自动检测出单个分子。结果表明, 单个分子的平均强度可以计算出来。它是用来确定一个拥挤的地方的单一分子的数量, 通过划分抗体点总强度的已知平均强度的单一分子。这些步骤可以使用斐济的脚本编辑器进行自动化。
用浓度序列来确定单分子计数在平衡中的液滴与已知浓度的重组 p53 蛋白 (图 3A)。条件是, 捕获抗体斑点捕获总靶蛋白的一小部分, 大约1% 在线性区域 (为 105-108蛋白质每滴 R2 = 0.99)。液滴中的非特异结合水平为 187, 60 分子。单细胞 pulldowns 的结果可以转换为实现每个细胞的绝对蛋白拷贝数的分布。图 3B显示了使用 ADMs 的单细胞细胞中绝对 p53 蛋白表达的分布。P53 蛋白在细胞中的表达, 可以假定为基因相同或非常相似, 是一个随机过程。分布是伽玛样不对称和单单峰与长的尾巴。因此, 平均 (1.82 x 106蛋白质) 可以高估模态蛋白丰度 (bin 0-5.0 x 105蛋白质), 标准偏差 (1.88 x 106蛋白质) 不能完全捕捉分布的特征。这种分布是单个细胞测量的重要性的一个例子, 用来捕捉细胞群中蛋白质表达的异质性, 否则在平均体积测量时会丢失。可以测量每个单元格的附加参数。在这里, 细胞体积的估计是通过测量每个细胞的直径之前, 溶解在液滴和假设细胞是近似球形。图 3C显示了 p53 绝对蛋白拷贝数在单细胞中作为细胞大小函数的比较。较大的单元格有一个更高的总 p53 拷贝数的倾向。有趣的是, 从分布来看, p53 表达式和单元格大小之间有协调, 因为每个单元格中似乎有一个最小的 p53 拷贝数;然而, 由此产生的机制需要进一步调查。
图 1: 可寻址滴微阵列装置和芯片.(a) 用3轴机械手手动分配液滴, 以翻译同心油管喷嘴。水滴在抗体微阵列中的特定位置被配发, 然后用封盖油。(b) 隔离器通过限制油的扩散, 使基板上可寻址的水滴密度更高。隔离器可由激光切割0.5 毫米丙烯酸片生产。为了帮助可视化的水滴, 蓝色食品着色染料是用仪器存放在一个)。刻度条10毫米, 内镶刻度条1毫米 (c) 同心油管喷嘴, 使可寻址的水滴形成, 组装如协议的步骤1.2。(d) microinjector 和机器人用于将细胞隔离成单独的可寻址液滴, 如议定书的步骤1.3 所准备。(e) 显示了在创建和加载可寻址水滴过程中的主要步骤。抗体斑点是使用编码的翻译阶段 (1), 其中毛细管的尖端是对齐 (2) 和水 (3) 然后油 (4) 组分被免除。单个细胞可以使用玻璃 microcapillary (5-8) 来加载, 它可以重复地处理水滴 (7) 和沉积细胞 (8)。缩放条形图100µm。(5) 和 (8) 中的红色箭头突出显示隔离的单个单元格, (8) 的嵌入在高放大倍数 (缩放条10µm) 上表示孤立的单个单元格。这一数字的部分已从参考12修改, 由皇家化学学会许可转载。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 图像分析步骤.阵列中的每个点都通过 TIRF 显微镜周期性地成像, 直到达到平衡 (tEq) (p53 测定的90分钟)。平衡时间依赖于溶液中的 t, 以及抗体对靶蛋白的亲和性。a) 示例单分子 TIRF 显微图像的背景以及一个例子单细胞下拉 (鳞片酒吧20微米)。嵌入图像显示了一个放大部分的背景图像与一些单一的分子突出的红色箭头 (鳞片酒吧5微米)。b) 《议定书》步骤3详述的图像分析概述。简单地说, 有两个广泛的制度, 其中的斑点可能被认为是不拥挤, 单一分子是稀疏的, 和拥挤, 其中单一分子的密度是如此, 有明显的重叠, 可能不再是单一的识别。图像分析中的一个关键步骤是场平坦, 以消除励磁激光器非均匀强度剖面的影响。在数字计数机制中, 根据它们的强度和形状参数直接识别出单个分子。在模拟计数机制中, 单分子的数量是通过测量平衡点的总光斑强度和除以由数字计数机制所知道的单个分子的平均强度来计算的。在 ImageJ 中可以直截了当地自动化步骤来分析数据。图像的下面板序列显示靶蛋白在抗体捕获点上的积累;最初, 斑点不拥挤 (t1), 而当目标蛋白质积累在抗体斑点, 单一分子可能变得越来越拥挤 (tn) 直到平衡到达 (teq)。请注意, 一个点是否保持不拥挤或变得拥挤取决于许多因素, 特别是分析量中的目标蛋白丰度。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 单个单元格数据.用定标曲线实现绝对量化。(a) 使用已知的重组蛋白浓度进行单分子计数。这是一个校准曲线, 用于将每个点上计数的单个分子转换为分析量中的目标蛋白质数量, 从而使单个细胞复制数。水平红色虚线表示 187 "60" 分子的非特定绑定级别。误差条是3实验运行平均值的一个标准偏差。虚线代表100% 检测蛋白质。(b) 在癌细胞中单细胞基底 p53 蛋白表达的分布表现为长尾伽玛样分布, 其中某些细胞的 p53 蛋白表达明显高于模态值。(c) p53 蛋白拷贝数的散布图, 作为细胞体积的函数, 显示蛋白质表达如何随着细胞大小的函数而变化。这一数字的部分已从12修改, 并经许可转载。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
可寻址液滴微阵列是一种灵敏的、易于扩展的方法, 用于定量确定单个细胞内蛋白质的绝对拷贝数。
在协议中限制非特定绑定 (NSB) 的级别对于尽可能低的检测限制是至关重要的。蛋白质和其他生物化学物种可能不专门绑定到许多界面中存在的水滴-盖玻片表面, 抗体斑点和油/水界面。蛋白质可以通过分成接口或油本身而丢失。我们已经表明, 在水滴中存在的 4% BSA 可以使用协议中指定的抗体限制蛋白质的 NSB。替代蛋白靶和用于检测它们的抗体可能需要其他阻断方法, 如非离子洗涤剂或相容的表面活性剂。氟化油也可以测试其作为上限油的适用性。在这种情况下, 必须作出额外的考虑, 如临界胶束浓度和上限油的密度。
未清洗的打印缓冲器, 在排列帮助下保持在每个当场位置在对齐。当最初沉积的水滴, 必须注意不要抓伤或损害抗体点的尖端的同心油管喷嘴。在进一步开发该方法时, 荧光染料可以掺杂到抗体印刷缓冲器中, 而这种缓冲剂除了捕获抗体外, 还被固定化。这将允许在液滴排列之前进行洗涤和堵塞步骤;但是, 如果使用自动滴排列方法 (如喷墨打印方法), 则不一定需要这样的步骤。
在商业来源的盖玻片的表面上形成的水滴被涂上亲水性聚合物, 其产生的水滴, 其体积为 10 nL 的直径为 751, 42 毫米。有一个限制, 多少沉积液滴应该湿的表面或扩散由于重量的上限油, 因为低于最低厚度, 有增加的光散射从 TIRF 励磁激光器。散射增加了背景的平均水平, 在检测单个分子时可以淹没信号。抗体斑点也必须位于远离液滴边缘, 因为激发激光可能部分或完全击中一个区域以外的水滴。对于与玻璃-水界面相对的轻触玻璃油界面, 将不再满足临界角度条件。
为了定量确定蛋白质的丰度, 必须通过图像分析确定单分子的数量。要确定溶液中蛋白质的总量, 从单一分子计数的校准曲线是必需的, 使技术是绝对定量的。
为了使漂白最小化, 点不连续成像, TIRF 励磁激光源功率最小化。所提出的协议已成功地用于 photostable 显影, 如 Alexa 氟染料。可使用替代显影, 但必须对漂白进行评估, 并在必要时调整成像协议。每帧的单个分子总数可以绘制与时间, 以重现绑定曲线, 虽然这是肯定没有必要的, 如果不寻求约束动力学和成像一个单一的框架在平衡将足够。
虽然有两种高亲和性抗体的要求, 这导致了高度敏感和高度特异性的检测, 关键的测量在单细胞水平。该协议中使用的 p53 抗体在检测单个细胞的游离 p53 方面得到了很好的优化。靶蛋白是由抗体的选择决定的, 可以通过多种方式进行修改: 1、捕获和检测抗体均可替换为约束替代目标;2、检测抗体可被替换为探针蛋白蛋白相互作用或转化后的蛋白质对捕获抗体绑定, 例如确定被捕获的 p53 的磷酸化状态;3、多路复用检测可以通过在近距离印刷中打印多个捕获抗体点来实现, 在10nL 水滴中可能有 3 x 3 点阵列。当然, 对于目标蛋白的任何改变, 必须进行一系列的抗体筛选, 控制和优化。
报告了株溶藻单细胞的几种方法。33光学裂解是一种无化学方法快速溶解单个细胞, 不改变细胞的含量和保持蛋白质及其复合物的完整性。用洗涤剂进行化学裂解会对油滴的完整性造成问题, 因为使用矿物油可以干扰分子间的相互作用。34然而, 对于化学裂解是相容的化验, 它是有吸引力的方法, 因为它不依赖于设备, 如激光或 micropatterned 电极。35
液滴表现出与替代单细胞方法的可比性能。在电流产生的水滴使用建议的 p53 抗体, NSB 的水平是 187, 每点60分子。单分子计数表现出强线性 (R2 = 0.99) 在区域横跨 105–108重组 p53 蛋白质每滴。这表明, 虽然细胞中可以检测到较低的蛋白质水平, 但有 105 p53 蛋白的定量限度;这对应于一个单一的分子计数的斑点 901, 83。这主要由水滴的容量和对接口的吸附限制。p53 试验的性能是这样的, 当在 10 nL 量中进行, 只有 1.1, 0.2% 的总靶蛋白从溶液中捕获;这增加到 85 @ 9%, 当减少分析容量到 0.2 nL。36通过将水滴的体积减少到1nL 以下并减少吸附, 有可能使用指定的抗体 p53, 以提高每细胞 < 50 蛋白质的检测限度。因此, 可寻址的水滴有可能被用来测量来自单细胞的极低丰度蛋白质。
容易穿透油帽所提供的水滴的寻址允许细胞分析量按顺序受到挑战。使用微可以将所需数量的细胞注入到 10-20 pL 的插头中的每个水滴中, 这不会显著增加体积。对于图 1B中显示的100口井的芯片, 形成液滴并将其加载到单个细胞通常需要75-90 分钟. 通过用同心管喷嘴代替微或使用在最初形成水滴时含有细胞的溶液。后者将有助于限制议定书中的步骤数目, 但在这两种情况下, 每个水滴的占用量将遵循泊松分布。这将限制每个芯片的单个单元数据的比例;然而, 有零个或多个细胞的水滴将作为控制。使用同心喷嘴处理液滴的附加限制是水滴体积将增加10nL 增量。以上建议的修改可以改进。片上滴微流体能够产生高频率的水滴, 并有潜力自动与 ADMs 结合, 产生和操作液滴, 并按顺序将其存入平面阵列。这肯定会克服 ADMs 生产中的局限性, 同时也能使单分子的水滴读数。
处理每个液滴的能力有一系列可能的用途。我们已经演示了按顺序加载单个单元格的能力。它还允许去除未绑定的细胞材料后裂解和后分析的吸管进行分析使用其他方法。随后分析的例子包括定量实时 PCR 或质谱。
目前需要对单细胞蛋白质分析进行定量处理的实验室的瓶颈之一是高技术壁垒和对专用设备的需求。ADMs, 小型化, 高灵敏度分析, 可以实现不需要洁净室设施, 以制造微流控实验室的芯片设备。实验不受芯片设计的限制, 其体积和位置可能会被改变, 而不需要制造新的大师。当然, 在简化技术和降低单细胞分析进入的门槛, 仅仅是一个 microarrayer, 要打印抗体和液滴微阵列, 以及一个荧光微板块阅读器, 都有改进的余地。
单细胞分析的一些临床应用正在出现, 特别是在癌症治疗中。肿瘤异质性是有效化疗的主要挑战。在肿瘤的发育中, 突变随频率的增加而变化, 异质性会导致形态学、遗传和蛋白质组变异。单细胞分析能够解决肿瘤内的细胞异质性, 并提供一个平台, 帮助更好地了解和预测抗药性和指导治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
ASR 设计的实验, 开发的协议和分析数据。SC 和 PS 进行了细胞大小实验。ASR 和 OC 写了手稿。提交人希望感谢 David 斯科特·克鲁格教授提供设备的支持。作者希望感谢帝国学院先进的 Hackspace, 以获得制造和原型设施。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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