Summary
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm)、単一セルの絶対蛋白質量を決定できる液滴アレイ ・ ベース メソッドをご紹介します。ひと癌細胞における癌抑制タンパク質 p53 の発現の多様性を特徴付けるための Adm の機能を紹介します。
Abstract
しばしば細胞挙動と細胞応答は多くの細胞の応答が複雑な人口の内で豊富な単一のセル動作をマスキング平均結果として一緒にプール、人口レベルで分析しました。単細胞タンパク質検出と定量化技術は、近年顕著な影響を与えたが。ここでアドレス指定可能な液滴マイクロ アレイに基づく実用的で柔軟な単一細胞解析プラットフォームをについて説明します。本研究では、ターゲット蛋白質の絶対コピー数が単一セルの解像度を測定する方法について説明します。腫瘍抑制因子 p53 は、非正常な p53 表現パターンを示す総癌の 50% 以上のひと癌の最も一般的変異遺伝子です。プロトコルでは、発現の変動を正確に判断する単一分子分解能 10 nL 液滴内 1 つのひと癌細胞は隔離され、p53 蛋白のコピー数の測定を作成する手順について説明します。メソッドは、任意のセル型主原料を含む興味の任意のターゲット蛋白質の絶対コピー数を決定するために適用可能性があります。
Introduction
このメソッドの目的は、単一セルの解像度を持つセル人口のターゲット蛋白質の豊富さで変化を決定することです。単一細胞解析は、いくつかの伝統的なアンサンブル生化学的方法では利用できない利点を提供します。1,2,3,4,5まず、単一セルのレベルで働く伝統的なアンサンブル生化学的手法で発生するそれ以外の場合、平均することによって失われるだろう細胞集団の豊富な多様性をキャプチャできます。仕事馬の生化学的方法の大半を連れた、必要とされる職務とは多くの場合、結果を生成する細胞の数百万。もちろん、全体細胞集団の評価の結果によって異なりますいくつかの要因、たとえば、不均質構造タンパク質発現蛋白質量分布のいくつかの重要な機能を見逃す可能性があります。実用的な観点から単一のセル技術の必要な感度させる機能により敏感の一括技術も十分ではない生物学的材料の量を操作することができます。このキーの例は珍しいセルなどの循環癌細胞 (Ctc) 描画単一 7.5 mL の血液に存在する 10 の Ctc より予後見通しで貧しい患者のためにもどこの研究です。6ここでオイル キャップの液滴を用いた抗体アッセイは抗体のマイクロ アレイの印刷量を削減を用いた単一細胞蛋白質測定の実行に必要な方法論を紹介します。
マイクロ液滴プラットフォームは、高スループット、生化学的アッセイの広い配列を実行する個々 のしぶきの滴/秒との分離、及びも培養の単一セルの対応の数千を生成することです。液滴ベースの技術は、単一細胞解析、大幅の力によって支援されています DropSeq10 inDrop11を含む顕著な最近例の7,8,9に最適増幅テクニック。材料の限られた量、蛋白質のための増幅のメソッドは、単一細胞プロテオミクスを特に挑戦的なの作るに。
液滴はメソッドの数によって分析される可能性があり、蛍光顕微鏡が用いられています。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡などの単一分子技術により蛍光分子信号対雑音比の比類のない可視化することができます。12によるエバネッ セント場の指数関数的減衰、高 (100 nm オーダー) 表面近傍でのみ fluorophores が付いて興奮している複雑な混合物に少量の標的分子を検出するに全反射の良い戦略を作るします。全反射の光学セクショニング強さまた洗浄手順を避けるために、制限時間と複雑さの分析できます。全反射平面サーフェスを必要とし、流における液滴に適用される全反射型顕微鏡の例を含むイメージを平面の形成。13この目的のために単一細胞プロテオミクス技術設計マイクロ流体チップ マイクロ アレイ フォーマットでキャプチャの表面固定化エージェント周り。4,14
自分自身、液滴を形成して、平坦なサーフェス、いわゆる液滴マイクロ アレイでよい。15,16,17空間的配列に液滴を整理する便利なインデックス、簡単に時間をかけて監視、個別に対処して、必要な場合、取得することができます。液滴マイクロ アレイは、フリースタンディングまたはマイクロウェル構造体でサポートされている、チップあたりの要素の何千もの超小型原子炉の高密度を実現できます。18,19,形成することができる20液体ハンドリング ロボット、インク ジェット マニアによって順次蒸着によって先生方、院生21,22,23,24,25にお問い合わせください 26または彼らは自己 superhydrophillic などの面で組み立てることができるスポットは、超撥水表面のパターンします。27,28,29
念頭に置いてこれらの考慮点は、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ (Adm) 定量的に単一分子全反射型顕微鏡の感度と汎用性、空間のアドレッシング機能により、液滴マイクロ アレイのボリュームを減少を結合する設計されていたタンパク質の量を測定します。5 Adm は、蒸発を防ぐためにオイルの蓋は、抗体マイクロ アレイを単一細胞を含む液滴マイクロ アレイを形成する単一細胞分析を有効にします。液滴のボリュームは、オンチップ マイクロ流体連続フローで弁体によって達成されるそれ以外の場合サンプル損失を防ぐ離散。30単一のセルからのターゲット蛋白質の絶対量が非常に小さいです。しかし、水滴の量の削減により比較的高い濃度のため、順序では、彼らはサンドイッチ抗体アッセイを使用して検出されます - 抗体を固定化すると、異なる地域や順番を結合する蛋白質をキャプチャする表面上のスポット蛍光標識検出の抗体, 液滴体積中に存在。ADMs が処理血液などの主要な情報源からの細胞の分析に一般的に適用されるラベル無料アプローチ (すなわちタンパク質のターゲットを直接にラベル付けする必要はありません)、として、うまく吸引解離腫瘍生検と培養細胞を必要とその溶解液。
薬に応答して、たとえば、不均一性を左右する重要な細胞集団全体蛋白質量の変化を測定と細胞機能と経路、集団の評価に洞察力を提供するのに役立つだろう、動作と同様一括方法によってマスクされるまれな事象を識別します。このプロトコルは、生産し、アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイを使用して定量的ひとがん細胞における転写因子 p53 の豊かさを確認する方法について説明し、化学療法薬への応答における p53 の役割を調査するために使用可能性があります。ターゲット蛋白質はキャプチャと検出抗体の選択によって決定され、詳細、または別のターゲットを含めるように変更することがあります。手順は、手動でオイルを上限 10 nL 液滴を配列する一般的なラボ消耗品から同心円状のノズルを組み込んだシンプルな装置を構築する提供されます。各液滴分離するか、単一のセル、全反射顕微鏡を用いた 1 分子分解能で決定したタンパク質の発現とロードされるという完全実験のプロセスを説明します。
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Protocol
1. 準備
-
チップとプリントの抗体のマイクロ アレイ
- 抗体のマイクロ アレイをサポートする官能基化 coverslip に接着剤シリコーン/アクリル アイソレータを取り付けます。これをチップと呼びます。
注: さまざまな表面化学は、アドレス指定可能な液滴とその適合性についてテストされています。5表面の化学的性質は、代替の捕獲のエージェント用に最適化する必要があります。ADM アイソレータ、商業的に利用可能なまたはアクリル レーザー切断によって生成される (CAD ファイルのダウンロードとしてこの作業で使用する免震装置を提供;補足コード ファイルを参照してください)。 - Microarrayer に切り替え、湿度を 75% に設定します。
注: 相対湿度はマイクロ アレイ端子から印刷の溶液の蒸発を低減し、イントラ間 spot 変化を減少します。 - 5 分間超音波処理による洗浄ピンのマイクロ アレイ ピンを清掃します。超純水洗浄ボトルを使用してくださいピンをすすいで乾燥窒素を使用してください。
注: のみピン先端を浸すようピンを中断します。適切なドリル穴セットを顕微鏡スライドはピン ホルダーを取得できない場合に役立ちます。 - 5 mL の 0.01% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を添加した 1.5 M のベタイン 3 × クエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファーの印刷バッファーを構成するを確認します。無期限に 4 ° C で保存します。
- 印刷ソリューションを準備する抗 p53 抗体を解凍 (p53/Mdm2 ELISA キット; 材料の表を参照してください) 因数-80 ° C で保存それは 1:1 を最終濃度 0.5 mg/mL の印刷バッファーでミックスします。384 ウェル プレートのマイクロ ピペットを使用しての印刷ソリューションの 5-10 μ L をロードし、microarrayer に配置します。
- 1.1.1 のステップで、microarrayer に組み込まれたチップを読み込みます。アイソレータの各ウェルの中心によって定義された座標にスポットを印刷する microarrayer をプログラムします。
注: 先生方、院生採用の範囲主に、独自のソフトウェアなどの関連文献を参考にお勧め。1.1.1 のステップに付随する CAD ファイルで紹介 ADM アイソレータで長方形要素の構成に必要なマイクロ アレイ関連する距離を提供しています。 - 気密の容器でチップを格納し、アルミホイルで包みます。6 週間 4 ° C で保存します。
注: 箔写真損害を防ぐためです。4 ° C で保存生体分子とマイクロ アレイ活動を軽減する作用があります任意の有害反応の分解速度を制限します。気密の容器では、チップ表面の結露せず使用する前に室温に平衡にチップをことができます。コンタクト マイクロ アレイの印刷は、表面張力と印刷ソリューションとスポットを生成するプリント基板との密着性を悪用します。印刷前処理またはしみが付くことは、通常均一に大きさで分類されたスポットを生成するマイクロ アレイ端子から余分なソリューションを削除する必要です。バッチの品質を評価するために使用できるので、いけにえの事前印刷 coverslip は捨てないでください。
- 抗体のマイクロ アレイをサポートする官能基化 coverslip に接着剤シリコーン/アクリル アイソレータを取り付けます。これをチップと呼びます。
-
注射器を準備アドレスの液滴を吐出用チューブと同心のノズル
- (水溶液液滴) を 100 μ L を分解し、1 mL (キャップのオイル) のガラス製注射筒ハミルトンと蒸留 H2O を持つ部品をすすいでください。
- 150 μ m の 100 mm をフィード ID/360 μ m OD 溶融シリカ チューブ 40 mm 長さ 1.0 mm ID/1/16 のを通して「OD PFA チューブ 2 mm 突出それまで。これは、同心円状のノズルが形成されます。
- 10 μ L ピペット チップの端にシアノアクリ レート系接着剤の薄層を適用し、1.0 ミリメートル ID/1/16 の 40 mm の部分に挿入"OD PFA チューブ。必要な場合、接着剤が沈む前にノズルで 2 mm の突起を維持するために石英管の位置を変更します。
- 0.014"ID/0.062 の 200 mm の終わりに石英キャピラリーのもう一方の端を挿入"PTFE チューブの外径し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (PBSA) で 4% ウシ血清蛋白 (BSA) 満ちているハミルトン シリンジ 100 μ L に接続します。
注意: 蛋白質および他の生化学的な種表面に非特異結合可能性がありますとが紛失したり変性します。BSA は、'ブロック' 表面献身的これらのサーフェスにバインドすることにより非特異的結合を最小限に抑えるために使用されます。 - それは、シールを形成するまで 200 μ L ピペット チップに 400 mm 1.0 mm ID/2.0 mm 外径 FEP チューブを挿入します。別 200 μ L ピペット チップにシアノアクリ レート系接着剤の薄層を適用し、場所にチューブを修正するための最初のヒントにこれをプッシュします。鉱物油で満たされたハミルトン シリンジ 1 mL に 1.0 mm ID/2.0 mm 外径 FEP 管の開放端を接続します。
- 同心円状のノズルの 10 μ L ピペット チップに、200 μ L ピペット チップ ・ アセンブリを挿入します。独立して運営する必要があります、別のシリンジ ポンプに注射器を配置します。
- 4 %pbsa ブロッキング溶液を 100 μ L のシリンジを入力します。接続し直し、ブロッキング液で '水' チューブをフラッシュします。3 フラッシュの合計に 2 回繰り返します。
- 4 %pbsa と再アタッチ チューブを 0.125 μ g mL-1検出の抗体 (抗 p53 抗体 (か 1) アレクサ 488 付け) を 100 μ L のシリンジを入力します。調剤 25 チューブでブロッキング ソリューションを置き換える μ L 検出抗体溶液。
- すべてのチューブとノズルがオイルでいっぱいになるまでは、鉱油と '油' チューブをフラッシュします。ミネラル オイルを 1 mL の注射器を補充し、チューブを再アタッチします。XYZ マニピュレーターにチューブとノズルのアセンブリを固定します。
-
マイクロインジェクターおよびマイクロマニピュレーターを準備します。
注: 以下の手順マイクロインジェクターと材料表で指定したマイクロマニピュレーター装置のコンポーネントに特定の参照を作るなどの装置に一般的に適用されます。- ガラスシリンジをアセンブルするには、圧力管、キャピラリーのホルダーを取り付けます。
- 鉱物油が完全に行を塗りつぶすまでゆっくりとピストンのダイヤルを回転させます。
- 翻訳のヘッド マウントに毛細血管のホルダーをマウントします。
- グリップの頭で毛細血管のホルダーにキャピラリーを固定します。
- 4% の溶液をピペット PBSA アイソレータの井戸の 1 つに。
- 翻訳マニピュレーターを使用して、ソリューションに毛細血管の先端を浸します。
- ゆっくりと 4 %pbsa と 10 分のためにブロックを残す毛細血管を入力します。
- マイクロキャピ ラリーを取り出し、アセンブリがチップの明確になるので、変換モジュールを回転します。
2. 負荷とアドレス指定可能な液滴を形成する単セルで
- フォーム アドレス滴
- 顕微鏡ステージ上には、チップを固定します。
注: 顕微鏡は単一分子全反射できる自動顕微鏡装備倒立蛍光、エンコードされた XY ステージと電子電荷結合素子 (ccd 年 EM-) を乗算します。 - 自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して配列の各スポットの顕微鏡ステージ座標を記録します。
- XYZ マニピュレーターを顕微鏡ステージに設定します。50-60 ° の角度でノズルを配置します。ノズルは十分な長さとクリアランス チップに到達することを確認します。'水' と '石油' 注射器 10 分配するポンプ セット 100 μ L/min で 5 μ L、100 μ L/分、nL それぞれ。
注: の準備時にノズルのヘッドで水溶液が乾燥があります。 - 流体のビーズがノズルの先頭に表示されるまでは、水溶液を調剤します。それを削除するほこり無料ワイプで軽くたたきます。
注: 調査中の条件の数によって、細胞の貯蔵所として機能する井戸の数を有します。単一のセルのライン/タイプ単一タンクで十分です。 - 自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、coverslip 表面に配列とフォーカス抗体場所に顕微鏡ステージ座標を設定します。
- 邪魔しないように注意スポット、XYZ マニピュレーターを用いた抗体スポットの側に同心円状のノズルのガラス キャピラリー先端を合わせ、調剤 10 水溶液の nL。ステージを移動することがなく水溶液をキャップにオイルの 5 μ L を分配します。ゆっくりとノズルの液滴のクリアをあげても次に移動します。
- ステップ 2.1.6 配列ですべての抗体のスポットに対して繰り返します。
- 30 分後、各抗体細胞をロードする前にスポットにバインドされている単一の分子の背景を特定する自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して、配列内のすべてのスポットを画像します。
- 顕微鏡ステージ上には、チップを固定します。
- アドレス指定可能な液滴セルを読み込む
- インキュベーターから細胞培養フラスコを削除し、/トリプシン EDTA 溶液を使用してセルをデタッチします。
注: この研究では、BE ひと大腸癌細胞株が使用され、ダルベッコ変更イーグルス媒体 (DMEM) 10% (v/v) 胎児血清 (FBS) CO2インキュベーターでの培養します。 - 必要な場合、蛍光染色細胞。
- 10% で 0.125 μ g/mL 検出抗体 (抗 p53 抗体 (か 1) アレクサ 488 付け) の溶液中の細胞を再懸濁します FB L-15 メディアの。単一細胞懸濁液を確保するため、40 μ m ピッチ携帯こし器を通って細胞液をフィルターします。
- 診断を使用してセルを数えると希釈または 25 400 × 103セル/mL の濃度に細胞のソリューションを集中します。これにより、マイクロキャピ ラリーを快適に操作するための十分な間隔とそのセルの堆積物です。
- 単一細胞をマイクロマニピュレーターおよびマイクロキャピ ラリーを使用して細胞の貯蔵所からのアドレス指定可能な液滴に読み込みます。
注: 非付着性のセル内挿した一括で読み込まれます、アドレス指定可能な液滴に一つずつ分配されます。表面のブロック治療にもかかわらず付着性のセルラインが非具体的ガラス マイクロキャピ ラリー内壁に固執し、失われる傾向があります。 - 10 × 目的を使用して、観察、ガラスシリンジを使用して細胞の貯蔵所からマイクロキャピ ラリーに単一細胞を吸引します。
- 電子マニピュレーター ステージを使用して場合、マイクロマニピュレーター ステージ座標を格納または手動で z 位置に注意してください。
- チップの高さ 1 mm のクリアを上方向に変換することで、ピペットを撤回します。ジョイスティックまたは電子マニピュレーター段階の 'Eject' 機能を使用して自動的に手動で実行します。
- ステージ座標にアドレス指定可能な液滴を自動顕微鏡制御ソフトウェアを使用して設定します。'挿入' マイクロ ピペット ストアド (または注意) の z 位置にそれを返すことによって。ジョイスティックまたは自動的に、手動でこれを行う場合は電子マニピュレーター ステージを使用して。
注: マイクロキャピ ラリーにキャップのオイル穴を開ける、アドレス指定可能な液滴の水性部分内に位置します。 - ガラスシリンジを使用してアドレス指定可能な液滴のセルを調剤します。10 nL のアドレス指定可能な液滴の体積増 1% 未満。
- アドレス指定可能な液滴がセルを含まない実験のコントロールのいくつかの無料残して残りのアドレス指定可能な液滴に 2.2.5-2.2.9 を繰り返します。
注: マイクロキャピ ラリーとマイクロマニピュレーターを使用してアドレス指定可能な液滴への単一セルの読み込みの簡潔な代替 10 濃度 4 %pbsa 含む細胞の検出の抗体の溶液で 1.2.8 の手順でソリューションを置き換えるには5セル/mL、1 セル/10 に相当 nL。単一のセル占有率は 27ayf-3 ポワソンなり、細胞濃度を最適化する必要があります。
- インキュベーターから細胞培養フラスコを削除し、/トリプシン EDTA 溶液を使用してセルをデタッチします。
- セルとイメージ配列を溶解させます。
- 任意の蛍光イメージングなど明視野顕微鏡を用いた液滴の画像セルします。
注: 画像は、自動顕微鏡を用いた 〜 100 滴のイメージを約 3 分かかります。イメージングを実行 60 NA = 1.49 油浸対物レンズ。フィルターが明視野イメージング蛍光標準フィルターのセットが使われるに対し必要ないです。 - 単一分子の全反射型顕微鏡を使用して配列内のすべてのスポットをイメージします。
注: 特殊な全反射を 2.3.1 手順でセットのフィルター設定が使用されます。これらの画像はその後溶解前に各抗体スポットにバインドされている単一の分子の背景を特定する 3 のセクションで分析します。全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡を用いた単一分子イメージングは、〜 100 点のイメージを約 5 分かかります。 - アドレス指定可能な液滴のセルに焦点を当てます。シングル 6 に焦点を当て、完全な光の換散を達成するナノ秒レーザー パルス (波長 1064 nm、パルス当たりのパルス エネルギー 14.1 ± 0.3 μ J) セルの場所の近くにあります。
注: レーザー パルス設定拡大のキャビテーション気泡をセル、, 液滴体積に細胞成分を解放します。4,31換散のレーザー誘起による機械的なプロセスは低パルス エネルギー油水界面を妨げない。光散 100 セルを示した約 20-30 分をとります。議論の部で説明したように単一細胞を溶解光溶解セットアップができない場合の代替手段の数があります。 - セルを含むすべてのアドレス指定可能なアドレス指定可能な液滴が非分離セルを含む 5 実験的制御のために自由を残して液滴に繰り返します。
- 各セルを分離するか、時間に注意してください。
注: これらの時間は、ステップ 3.1.9 内の各スポットの個々 のバインド曲線を修正する使用されます。多くの場合、回最初と最後のセルが分離、換散イベントの間十分に一貫した時間と仮定すると残りの部分を推定であるとに注意します。 - さらに 60 分間、20 分ごとに、最初の 30 分間すべてのスポット 10 分毎の全反射蛍光顕微鏡を用いた単一分子画像を取得します。平衡結合蛋白質の量に興味を持って、だけの場合は、室温で 90 分のチップをインキュベート後すべてのスポットをイメージします。
注:, 液滴体積の試金で使用される抗体の親和性平衡に到達する時間によって異なります。レーザー励起源を用いた全反射型顕微鏡を実行 = 488 nm および 1.5 mW の発電光パワーメータを使用してバック絞りにて測定。900 ms のアクイジション時間, 1 MHz の読み出しレートで 16 ビット デジタル化する EM CCD カメラの取得設定を設定による単一分子画像と、EM ゲイン 10 倍です。アイソレータは、coverslip を慎重に外して再使用する可能性があります。
- 任意の蛍光イメージングなど明視野顕微鏡を用いた液滴の画像セルします。
3. データ分析
-
単一分子 (非混雑/デジタル政権) を数える
- フィジー (または Matlab) を用いた非輻輳抗体の任意の場所、換散 (背景、BKD) 前に取得したイメージを読み込みます。
注: 以下の手順で操作は、素直フィジー画像解析ソフトウェアを使用しています。ユーザー ガイドは、次のリンクの https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html で見つけることが。 - フィジー、BKD イメージを選択します。「イメージ」メニューの下には、重複した BKD に「重複した」を選択します。重複する画像を選択し「プロセス > フィルター」の下で「ガウスぼかし」を選択し 50 ピクセル半径を指定します。
- BKD 画像で BKD_FLAT を生産、ぼやけの BKD イメージを分割して励起光源の効果的な均一な強度分布がある、BKD のイメージを平らにします。
- 「プロセス」の下で選択「画像電卓...」、画像が必要な操作の「われ」を指定するとボックス「を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択
- 1、イメージの各ピクセルを減算 (「プロセス > 数学」、「減算...」を選択し 1 値を指定)。平均輝度は 0 にする必要があります。
注: フィールドの平坦化と、すべてのピクセルの合計は 0 にする必要があります、任意の残りのオフセットにより素直の補償される場合がありますので、フラットな背景画像を簡単にチェックすることがあります。 - BKD_FLAT 画像の 4隅のいずれかで 50 ピクセル × 50 ピクセル領域を選択します。「分析」と「測定」を選択してピクセル強度の標準偏差 (σ) を測定します。
注: 結果ウィンドウで選択範囲の集計値が表示します。これは、スポットを背景を決定しますある単一分子の高密度をする可能性があります。測定する領域はデフォルト メニューの選択ツールを使用して手動で選択可能性がありますまたは実行するマクロ コード"makeRectangle (x、y、幅、高さ)";これは矩形の選択範囲を作成し、x と y 引数が左上隅の座標を (ピクセル) で。 - 3 σ にイメージしきい値を設定し、SM_MASK のバイナリ イメージを作成します。
- 「イメージ > 調整」、の下で「しきい値...」を選択し、3 σ に低いしきい値レベルを設定します。
注: 値がしきい値を下回っているピクセルが 0 に設定し、しきい値を超えるピクセルは 1 に設定されます。しきい値は、どちらられるピクセルは、単一分子に属する信頼を決定します。
- 「イメージ > 調整」、の下で「しきい値...」を選択し、3 σ に低いしきい値レベルを設定します。
- 分割画像 SM_MASK、4-9 ピクセルの2サイズ、0.5 - の真円度を持たないオブジェクトのゼロに設定されているピクセル強度値で「分析」を選択して 1 に続いて「分析粒子」サイズと真円度を指定します。
注: ピクセル サイズ可能性がありますその他のフルオロおよび顕微鏡セットの最適化が必要な ups。カメラのノイズのタイプのため単一のピクセルはこのしきい値を超える可能性があり、ない単一分子であるにもかかわらずは破棄されません。ピクセル サイズの基準は、このようなピクセルを正しく破棄されます。単一分子形で一般に循環しています。1 の真の値は、値 0 に近づいて徐々 に引き延ばされた形に対し完璧な円を示します。残りのオブジェクトは単一の分子であり、カウントがあります。マスクがスポット上を差別するスポットの領域を区別するため、スポットをフレームごとに 1 カウントします。フレーム後に取得が簡単です、十分な信号場で以前のフレームに、適用することができます。 - 同じ抗体の非混雑スポット ロードし、手順 3.1.1 - すべての画像フレームの 3.1.7 キャプチャ時間分解シリーズ取得ポスト換散を繰り返します。2.3.5 の手順に記載されている溶解時間を使用します。バインディングの任意の曲線を修正しました。
- フィジー (または Matlab) を用いた非輻輳抗体の任意の場所、換散 (背景、BKD) 前に取得したイメージを読み込みます。
-
単一分子 (混雑/アナログ政権) を数える
- 次に進む前に、単一の分子の平均強度を計算するために手順 3.1.1 - 3.1.8 を繰り返します。
- 0 以外のピクセル値が単一分子に関連付けられてであるというイメージを生成する BKD_FLAT と SM_MASK の画像を乗算します。
- 「プロセス」メニューの下これを実行、"イメージ計算..."を選択、「乗算」操作と、必要なイメージを指定、ボックス"を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択するには
- 「分析」と、「測定」; を選択してすべてのピクセルの輝度の値を合計します。選択範囲の集計値は、結果ウィンドウに表示されます。ステップ 1 分子あたりの平均強度を計算する 3.1.8 に従ってカウントの単一分子の数で除算します。
- 混雑した抗体スポット、イメージ取得後換散を読み込むし、平ら 3.1.2、3.1.3 の手順に従って背景をぼかし画像で。
- 1 によって平坦化されたイメージの各ピクセルを減算 (「プロセス > 数学」、「減算...」を選択し 1 値を指定)
- 画像の 4隅のいずれかで 50 ピクセル × 50 ピクセル領域を選択し、ピクセル強度の標準偏差 (σ) を測定します。手順 3.1.5 詳細を参照してください。
- 3 σ にイメージのしきい値を設定することによってバイナリ イメージ マスクを作成し、未満 4 ピクセルの2サイズの任意のオブジェクトのゼロにピクセルの明度の値を設定します。「解析」メニューの下で、これを実行、「粒子の分析」を選択し、サイズ、真円度を指定します。
- バイナリ イメージ マスクをフラットな混雑している抗体スポット像を掛けます。
- 「プロセス」メニューの下これを実行、"イメージ計算..."を選択、「乗算」操作と、必要なイメージを指定、ボックス"を作成する新しいウィンドウ」と「32 ビット (浮動小数点) 結果」を選択するには
- 「分析」を選択して残りのピクセル強度の合計は続いて「測定」;選択範囲の集計値は、結果ウィンドウに表示されます。
- 混雑した場所にバインドされている単一の分子の数を計算する平均単一分子強度によってピクセル強度の合計を除算します。
-
絶対定量のための検
- セクション 1 および 4 %pbsa 溶液濃度既知遺伝子組換えタンパク質をスパイクで 10 nL アドレス指定可能な液滴検出の抗体を形成する 2 を繰り返します。
- 10 の一連の濃度の実行2- 10 ソリューションに追加組換え蛋白質の既知濃度を変化させることで液滴あたり7遺伝子組換え蛋白質。キャリブレーションの 1 つのセルのデータを簡単に液滴あたり蛋白質の数の面で動作するようにそれをお勧めします。
- タンパク質豊富な単一セルごと延長蛋白質量、液滴あたりにスポットあたり一連の濃度の任意の単一の分子を調整 3.3.2 の手順でデータ カウントを使用します。
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Representative Results
P53 の絶対根元タンパク質コピー数は、ひと大腸癌細胞株、ある細胞の単一セルの解像度が定められました。P53 桁違いに異なり、休憩する細胞集団内のセル サイズとタンパク質コピー数の間弱く肯定的な相関関係を示す方法を紹介しています。
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、水滴は抗体の場所にスポットで調剤され、オイルを頂いたときに形成されています。ここでは、水滴は敏感な p53 蛋白質の試金をサポートします。Coverslips は連絡先 microarrayer とピンを使用してキャプチャ抗体スポットで配列されます。抗 p53 キャプチャ抗体は、市販 ELISA テスト キットから取得されます。印刷の条件は、キャプチャ スポットがあたり 6.2 ± 0.5 × 105タンパク質の最大キャプチャ容量直径約 100 μ m など。32
Coverslip に接着型アイソレータ使用する抗体キャプチャ スポットの近くに油の広がりを制限するために形成される液滴の密度が高い。アイソレータの水滴は蒸発 (図 1 a) を防ぐためにオイルの蓋は、水溶液の塗布によって形成されます。液滴; をキャップにオイルの最小限の量に分配されることただし、各アイソレータも正確、油面がイメージング用フラット満たす量を分配することをお勧めします。アイソレータは、商業的供給またはレーザー カット アクリル シート製。シリコーン アイソレータが 4 x 6 配列で利用可能なカット済み井戸 (n = 24) 4 x 11 配列に変更される可能性しますが、(n = 44) 革生検または多穴パンチを使用して。図 1 bにアイソレータをカット レーザーは 2.89 mm、3.9 mm のセンターに分離、高さ 0.5 mm 最大径井戸 100 六角形構造の配列を示しています。水滴格納可能性があります、(観察された最大 3 カ月) 時間の長時間安定したまま。
水滴は、自作の装置で、2 つのシリンジ ポンプ (図 1 a) に接続されている同心円チューブ ノズル (図 1) を変換を使用して手動で作成されます。同心円チューブ ノズルは、溶融シリカ毛細管、水相、油相に分配する PEEK チューブの短い長さによって供給を分配するので構成されます。顕微鏡を使用して、抗体スポットにノズルを配置、ポンプとオイル (図 1E手順 1-4) の直後に続く水溶液を分配して最初。ADM で全ての滴が形成されるマイクロインジェクターとマイクロマニピュレーター (材料の表を参照) 単一のセル (図 1) に各液滴の読み込みに使用されます。マイクロ ピペット細胞の貯水池からセルをキャプチャする、チップ上の井戸の一つで、液滴によく翻訳される、水溶液液滴 (図 1手順 5 ~ 8) にセルを提供するオイル キャップに浸透します。
液滴内で、すべてのスポット溶解前にイメージングが、スポット (図 2 a) への非特異的結合度を決定するために使用されます。(核) を含む単一のセル、によって完全に光学的手法を用いたします。31光溶解セルを破壊する拡大のレーザー パルスによるキャビテーション気泡のせん断力に依存します。油水界面によって妨げられないこれらのプロセスによってパルス エネルギーを制限し、油/水界面から細胞を堆積するケアを行う必要があります。自動顕微鏡を用いた全反射蛍光顕微鏡による細胞を溶解し, 一度配列をイメージします。フレーム取得 10 分 30 分と、さらに 60 分のすべての 20 分。抗体の親和性、タンパク質拡散, 液滴体積などの条件は、90 分取得内に達する平衡をバインドなどです。典型的な単一セルのプルダウンを図 2 aに示します。
単一の分子の数を決定する画像解析のプロセス概略図 2 bに描かれています。スポットのイメージがターゲット蛋白質の集中はように単一分子が十分に離れていると容易に区別か混雑している、ターゲット蛋白質の集中がより高いおよび単一分子画像非輻輳と見なされるかオーバー ラップとは、もはや個別に識別可能です。全反射蛍光励起プロファイルが不均等であるので、フラット フィールド補正をする画像を取得するすべてが重要です。ガウス分布のぼかしは、ディテールとノイズを削除し、全反射蛍光励起プロファイルの平均的なプロファイルを持つイメージを生成する平滑化フィルターとして機能する非輻輳のフレームに適用されます。この処理後の画像 '' 元のイメージを平らにするためのもの。非輻輳画像をどこで、平衡でも、いくつかの単一分子自体を修正するフレームを処理できます。この方法は、単一分子が密集スポットに占める、混雑している場所には、買収の平坦化の背景イメージが必要です。フラットなフレームが強度少なくとも 3 ピクセルのどちらられる回のバック グラウンドの標準偏差と平均値です。単一分子は真円度 0.5 フィジーの粒子解析機能を使用してより大きいと 4-9 クラスター化されたピクセルを識別することによって自動的に検出します。結果から、単一分子の平均強度を計算することがあります。単一の分子の知られている平均強度による抗体スポット合計強度で割って混雑した場での単一分子の数を決定するものです。フィジーのスクリプト エディターを使用してこれらの手順を自動化する可能性があります。
一連の濃度は、組換え p53 蛋白 (図 3 a) の既知濃度の液滴の平衡で、単一分子の数を決定する. します。条件は、キャプチャー抗体スポット合計ターゲット蛋白質の直線性の地域に約 1% の割合をキャプチャするよう (液滴 R2あたり 10 の5-108タンパク質 = 0.99)。液滴の非特異的結合のレベルは、187 ± 60 分子です。単一セルのプルダウンの結果は、セルあたり絶対タンパク質コピー数の分布を達成するために変換可能性があります。図 3 bは、Adm を使用して単一のあるセルの絶対 p53 蛋白発現の分布を示します。可能性がありますは遺伝的に同一または非常に類似したとされる、ある細胞における P53 蛋白発現は、確率論的プロセスです。分布はガンマのような非対称と長い尾を持つ単峰性。その結果、平均 (1.82 × 106蛋白質) することができますモーダル蛋白質量 (ビン 0 - 5.0 × 105蛋白質) を過大評価、標準偏差 (1.88 × 106蛋白質) は完全に分布の特徴をキャプチャしていません。このディストリビューションは、一括測定、平均にそれ以外の場合失われてしまうセル人口の蛋白質の表現の多様性をキャプチャする単一セル測定の重要性の例です。各セルの追加のパラメーターを測定することがあります。ここでは、細胞体積はしぶきの換散の前に各セルの直径を測定し、セルがおよそ球形と仮定すると推定されます。図 3は、セル サイズの関数として単一 BE 細胞における p53 蛋白質絶対コピー数の比較を示しています。高い総 p53 コピー数を持っているより大きいセルのための傾向があります。興味深いことに、それは最小 p53 コピー数のセルをするようですので、p53 の発現と細胞サイズの調整は分布から可能ただし、これが発生するメカニズムはさらに調査が必要です。
図 1: アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイ装置およびチップ。同心円チューブ ノズルを翻訳する 3 軸マニピュレーターを使用して手動で (、) の液滴が分配されます。水溶液中の液滴がオイルをキャップに続いて抗体のマイクロ アレイの特定の場所で分配されます。アイソレータ (b) により、油の拡散を制限することによって基板上のアドレス指定可能な水滴の密度が高い。アイソレータは、レーザー切断の 0.5 mm のアクリル シートによって生成されます。装置を用いた食品色素を着色を蒸着液滴、青色の可視化を支援するために、)。棒 10 mm、はめ込みスケール スケール バー 1 mm。 (c) 同心管ノズルにより形成される液滴をアドレス指定可能なプロトコルのステップ 1.2 のように組み立てられます。(d) マイクロインジェクターおよびマイクロマニピュレーターを使用して、手順 1.3 プロトコルのように、個々 のアドレス指定可能な液滴に細胞を分離します。(e) の作成とアドレス指定可能な液滴を読み込みプロセスの主要な手順が表示されます。抗体スポット、エンコードされた翻訳の段階 (1) キャピラリー チューブの先端を揃え (2) 水溶液 (3)、油 (4) コンポーネントは、調剤を使用していることをあります。単一のセルは、ガラス マイクロキャピ ラリー (5-8) を繰り返し水溶液液滴 (7) に対処し、預金セル (8) を使用して読み込む可能性があります。スケール バー 100 μ m です。赤い矢印の先端 (5) と (8) 分離の 1 つのセルを強調表示し、(8) のはめ込みが高倍率 (スケール バー 10 μ m) で分離された単一のセルを示しています。この数字の部分は、参照12王立化学協会の許可を得て再現から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 解析の手順を画像します。配列内の各スポットの全反射顕微鏡による定期的にイメージを作成 (p53 の試金のため 90 分) に達する平衡 (tEq) まで。平衡時間は t ソリューションだけでなく、標的蛋白質の抗体のペアの親和性に依存します。例 a) 単一分子 TIRF 顕微鏡画像例セルのプルダウン (スケール バー 20 μ m) と同様に、バック グラウンドの。はめ込み画像は、赤い矢印 (スケール バー 5 μ m) で強調表示されたいくつかの単一の分子と背景画像の一部を拡大を示しています。b) プロトコルの手順 3 での詳細な画像解析の概要。簡単に言えば、非輻輳、単一分子がまばらで、混雑しているスポットを考慮可能性があります、2 つの広範な制度がある、単一分子の密度、重要な重複があるようは、もはや可能性がありますが単独で個人を特定できます。画像解析の重要なステップは、励起レーザーの非一様分布の効果を削除するフィールドが平坦化です。デジタル カウント政権で単一分子は、直接識別されます、その強度と形状パラメーターに基づいています。アナログの政権をカウント、単一分子の数は平衡とデジタル カウント政権から知られている単一の分子の平均強度で割ることで総スポット強度を測定することによって計算されます。ステップは、データを分析する ImageJ で素直自動化される可能性があります。イメージの下のパネルの順序抗体キャプチャのターゲット蛋白質の蓄積を示します、スポット。最初は、スポットがない単一分子標的タンパク質は抗体場所に蓄積されるにつれて、ますますなれるに対し、(1) を混雑 (teq) 平衡に達するまでに (tn) を混雑しています。かどうかスポット非輻輳のまま、または混雑した場合は分析ボリュームのターゲット蛋白質の豊富な特定の要因の数に依存します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 1 つのセルのデータ。絶対定量は、検量線を使用して実現されます。(な) 単一の分子の数は、組換えタンパク質の既知濃度を使用して作られています。これは校正曲線し分析ボリュームのターゲット蛋白質の数に各スポットに数えられる単一分子の変換に使用し、それ故に単一のセルのコピーの数。水平方向の赤の破線は、187 ± 60 分子の非特異的結合のレベルを示します。誤差がある実験 3 の平均の標準偏差の値を実行します。破線は、100% のタンパク質の検出を表します。長い尾を持つガンマのような分布を示すいくつかの細胞における p53 蛋白発現はモーダル値より有意に高いが癌細胞の単一細胞基底 p53 の分布 (b) 蛋白質の表現が表示されます。p53 タンパク質コピー数の関数としてセル当たりタンパク質発現がセル サイズの関数としてどのように変化するかを示すセル ボリューム (c) 散布プロット。この図の部分を12から変更し、許可を得て再現します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
アドレス指定可能な液滴マイクロ アレイは、単一細胞内でタンパク質の絶対コピー数を決定する定量的敏感かつ拡張可能な方法です。
非特異的結合のレベルを制限すること (NSB) は、低として可能な限り検出限界を達成するためにプロトコル内で重要です。蛋白質および他の生化学的な種がありますバインド インターフェイス液滴内に存在の数非具体的-coverslip 表面、スポットの抗体・油/水界面。タンパク質は、インターフェイスまたはオイル自体に分割が失われることができます。我々 は 4 %bsa 水溶液液滴内に存在がプロトコルで指定した抗体を用いてタンパク質の NSB を限ることができることを示しています。代わりとなる蛋白質の目標とそれらを検出するために使用する抗体は、代替ブロック的なアプローチ、そのような非イオン性洗剤または互換性のある界面活性剤を必要があります。フッ素オイルもソリッド オイルとしての適合性をテストできます。このような場合、臨界ミセル濃度とキャッピングの油の密度などの追加の考慮事項を行う必要があります。
各スポットの位置配置でエイズを配列複写するあとに残る印刷の洗っていないバッファー。水滴を当初溶着時に注意が必要ないキズまたは抗体スポットを損傷する同心円チューブ ノズルの先端で。さらにメソッドを開発する上でキャプチャ抗体に加えて離れなくなります抗体印刷バッファーに蛍光色素ドープされます。これにより液滴を配列複写する; する前に実行する、洗浄の手順をブロックしかし、このようなステップことは必ずしも必要なインク ジェット印刷方法など配列複写する液滴の自動化された方法を使用している場合。
液滴を形成する商業的食 coverslips は親水性ポリマーと水溶液液滴表面 nL は 751 ± の直径を持つ 10 の容積とそれらに生産 42 mm。蒸着液滴が表面を濡らす必要がありますどのくらい制限があるまたはスプレッド最小厚さの下があるのでキャップ オイルの重量のため全反射蛍光励起レーザーからの光の散乱を増加しました。散布はバック グラウンドの平均レベルを増加し、単一分子を検出するとき信号をかき消すことができます。励起レーザー光が部分的にまたは水溶液液滴の外部の領域を完全に打つので抗体スポットも液滴端からの距離に位置してある必要があります。臨界角条件がもはやガラス水インターフェイスではなくガラス油界面を印象的な光の満たされます。
定量的タンパク質スポットにバインドされている単一の分子の数の豊富さを決定するには、画像解析で決定する必要があります。合計を決定するには、単一分子数検量線から溶液中の蛋白質の量が必要と、絶対に定量する技術を有効に。
スポットは継続的に、退色を最小限に抑えるないイメージが、励起レーザー ソース出力の全反射が最小限に抑えられます。提示プロトコルは Alexa Fluor 色素などある fluorophores の正常に使用されています。代替フルオロを使用可能性がありますが、退色が評価されなければならないし、イメージング プロトコル適応に応じて。フレームあたり 1 つの分子の合計数は、これは確かに拘束運動は求めたとイメージングではない場合平衡で、単一のフレームで十分ですが必要ではありませんが、結合曲線を再現する時間に対してプロット可能性があります。
高親和性抗体の 2 つの要件がありますが、これは単一セルのレベルでの測定の重要な非常に敏感な非常に特定のアッセイで結果します。このプロトコルで使われる p53 抗体は、単一セルから無料の p53 の検出にも最適化されています。ターゲット蛋白質抗体の選択によって決定され、いくつかの方法で変更する可能性があります: 1、キャプチャと検出の両方の抗体は、代替のターゲットをバインドする交換します。2、検出の抗体は蛋白質蛋白質の相互作用を調査する置き換え可能性がありますまたはポスト翻訳の修正蛋白質にキャプチャ抗体にバインドされている、例えばキャプチャされた p53; のリン酸化状態を確認3、多重アッセイは、近くに複数のキャプチャ抗体スポットを印刷によって成し遂げられるかもしれません-3 × 3 を印刷スポットの配列は 10 nl 液滴内で可能。もちろん、ターゲット蛋白質抗体の画面数の変更にコントロールと最適化、行われなければなりません。
単一セルを分離させるいくつかの方法が報告されています。33光溶解、セルの内容を変更してタンパク質との複合体の整合性を維持することがなく個々 の細胞を急速に溶解する化学物質フリーのアプローチです。洗剤を使用して化学溶解鉱物油を使用して滴の整合性に問題がポーズと分子間相互作用を妨げることができます。34化学溶解は互換性のある試金のためそれは、魅力的なアプローチ レーザーやマイクロパターニングゲル電極などの機器に依存してないので。35
水滴は、セルの代替の方法で同等の性能を示します。提案された p53 抗体を用いた液滴の現在の世代の NSB のレベルは 187 スポットあたり ± 60 分子です。単一分子数展示強い直線性 (R2 = 0.99) 105-108遺伝子組換え p53 蛋白質液滴あたりにまたがる地域で。一方、細胞内タンパク質の低レベルを検出ことがあります、105 p53 蛋白質の定量の限界があることが示唆されました。これは 901 ± 83 点の単一分子数に対応します。これは主に小液滴およびインターフェイスへの吸着量によって制限されます。P53 の試金のパフォーマンスは合計ターゲット蛋白質の 0.2% がソリューションからキャプチャ 10 nL ボリュームだけ 1.1 ± で実行されるとき85 ± 9 %0.2 解析量を減らす向上 nL。36 1nL 下に水滴の量を減らすと吸着を減らすこと、可能性があるに検出限界を向上させる p53 に指定した抗体を使用して < セルあたり 50 タンパク質。したがって、アドレス指定可能な液滴を使用して単一セルからの非常に低い豊富な蛋白質を測定する可能性があります。
簡単に貫通オイル キャップによってもたらされる液滴のアドレスは、順番に挑戦する細胞解析体積を許可します。マイクロ ピペットの使用する必要な細胞数のボリュームを大幅に増加させない 10 20 pL のプラグで各液滴注入できます。液滴の形成と単セルで通常のロードは 75-90 分ロード セル 100 井戸を図 1 bに示すチップは同心の管のノズル、マイクロ ピペットではなくまたは使用を用いた液滴に取り組むことによっても実現可能性があります、当初、液滴を形成するときに、セルを含むソリューションです。後者の役に立つだろう両方のケースで、しかし、プロトコルでの手順の数を制限する、液滴人数がポアソン分布に従うでしょう。これはチップあたりの 1 つのセル データの割合を制限しかし、ゼロまたは複数のセルを持つ液滴制御として役立つで 。アドレス液滴に同心円状のノズルを使用して追加の制限は 10 nl 単位で, 液滴体積を増やすでしょうです。この上記提案の修正で改善できます。チップ上の液滴マイクロ流体システムが生み出す高周波滴と生成液滴を操作、および平面の配列でそれらを預ける順番に Adm と自動的に結合されているの可能性を秘めています。これは確かにも水滴の単一分子の読み出しを実現しながらの Adm の生産の制限を克服するため。
個々 の液滴に対処する能力の可能な用途の範囲があります。我々 は、単一のセルを順番にロードする能力を実証しました。また、他の方法を使用して分析のためのピペットで非連結の細胞材料ポスト換散およびポスト分析の除去を許可します。量的なリアルタイム PCR や質量分析法、その後の分析の例が含まれます。
単一細胞タンパク質解析に量的なアプローチを取るしたい所の現在のボトルネックは、ハイバリア技術と特殊な装置の必要性があります。ADMs、小型、高感度分析ラボ-オン-チップのマイクロ流体デバイスを製造するためクリーン ルーム設備を必要とせず達成する可能性があります。実験は、チップのデザインに制限はなく、ボリューム、位置は、新しいマスター シェイプを加工することがなく改変すること。確かに、技術を簡素化し、抗体と液滴マイクロ アレイとイメージの蛍光マイクロ プレート リーダーの両方を印刷するだけ microarrayer、単一細胞分析のための参入障壁を下げることで改善の余地があります。
単一細胞分析の臨床応用の数は、がんの治療に特に現れています。腫瘍の不均一性は、有効な化学療法が重要な課題です。腫瘍の開発の突然変異発生頻度は高まっていると不均一性は、形態的、遺伝的、れることとプロテオーム変動。単一細胞解析は腫瘍内の細胞異質性を解決しよりよく理解し、予測性ガイドの薬物療法を支援するプラットフォームを提供することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ASR は、実験を設計プロトコルを開発し、データを分析しました。SC と PS は、セル サイズの実験を行った。ASR では、OC は、原稿を書いていた。著者は機器へのアクセスを提供するため教授デビッド r. Klug のサポートを感謝したいです。著者作製と試作設備にアクセスするために帝国大学高度な Hackspace を感謝したいです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
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