Summary
Her præsenterer vi adresserbare droplet microarrays (Søren Peter), en droplet array baseret metode kan afgøre absolutte protein overflod i enkelte celler. Vi demonstrere evne til Søren Peter at karakterisere heterogenitet i udtryk for tumor suppressor protein p53 i en menneskelige cancer cellelinie.
Abstract
Ofte cellulære adfærd og cellulære svar der analyseres på befolkningsniveau hvor svar af mange celler er samlet sammen som en Gennemsnitsresultat maskering rige enkelt celle adfærd inden for en kompleks befolkning. Enkelt celle protein påvisning og kvantificering teknologier har gjort en bemærkelsesværdig indvirkning i de seneste år. Her beskriver vi et praktisk og fleksibel enkelt celle analyse platform baseret på adresserbare droplet microarrays. Denne undersøgelse beskriver hvordan de absolutte kopi numre af target proteiner kan måles med en enkelt celle opløsning. Tumor suppressor p53 er de mest almindeligt muterede gen i menneskelige kræft, med mere end 50% af samlede kræfttilfælde udviser en ikke-sund p53 udtryk mønster. Protokollen beskriver trin for at oprette 10 nL droplets for enkelt menneskelige kræftceller er isoleret og eksemplarnummer p53 protein er målt med enkelt molekyle opløsning til netop afgøre variationen i udtrykket. Metoden kan anvendes til enhver celletype herunder kildemateriale til at bestemme det absolutte kopi antal enhver target proteiner af interesse.
Introduction
Målet med denne metode er at bestemme variationen i overflod af en target protein i en celle population med enkelt celle opløsning. Enkelt celle analyse giver en række fordele, som ikke er tilgængelige med traditionel ensemble biokemiske metoder. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 for det første, arbejde på de enkelt celle niveau kan fange de rige heterogenitet af en celle befolkning, som ellers ville være tabt af det gennemsnit, der opstår med traditionelle ensemble biokemiske teknikker. Størstedelen af arbejdet-hest biokemiske metoder arbejde med bulk, kræver, som de ofte gør, millioner af celler til at producere et resultat. Selvfølgelig, konsekvenserne af vurderingen af hele cellepopulationer afhænger af en række faktorer, eksempelvis heterogenitet i protein udtryk hvor nogle vigtige funktioner i fordelingen af protein overflod kan blive savnet. Fra et praktisk perspektiv, den følsomhed, der kræves af enkelt celle teknikker gør dem i stand til at arbejde med mængder af biologisk materiale, der er utilstrækkelig til selv de mere følsomme bulk teknikker til at fungere. Et vigtigt eksempel på dette er studiet af sjældne celletyper såsom cirkulerende tumorceller (CTCs) hvor selv for patienter med en dårlig prognostiske outlook mindre end 10 CTCs kan være til stede i en enkelt 7,5 mL blod tegne. 6 her præsenterer vi den metode, der kræves for at udføre enkelt celle protein målinger ved hjælp af en reduceret mængde antistof-baseret analyse beskæftiger olie-udjævnede dråber trykt på et antistof microarray.
Mikrofluid dråbe platforme er høj overførselshastighed, stand til at generere tusindvis af dråber per andet og i stand til at isolere, og endda dyrkning, enkelt celler i enkelte dråber til at udføre en bred vifte af biokemiske assays. Droplet-baserede teknikker er velegnet til enkelt celle analyse,7,8,9 med bemærkelsesværdige seneste eksempler herunder DropSeq10 og inDrop11, som har været stærkt hjulpet af magt forstærkning teknikker. Den begrænsede mængde af materiale og ingen metoder til forstærkning af proteiner gør enkelt celle proteomics især udfordrende.
Dråberne kan analyseres ved en række metoder og Fluorescens mikroskopi har været meget udbredt. Enkelt molekyle teknikker som total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi tillader fluorescerende molekyler til visualiseres med enestående signal / støj-forhold. 12 på grund af den eksponentiel henfald af feltet flygtige, kun fluorophores i høje nærhed til overfladen (rækkefølgen af 100nm) er glade for at gøre JOHANNAS en god strategi til at opdage små mængder af et target molekyle i en kompleks blanding. Den iboende optiske skære styrke af JOHANNAS også hjælper til at undgå wash skridt og grænserne assay tidsforbruget og kompleksiteten. Men JOHANNAS kræver plane overflader og eksempler på JOHANNAS mikroskopi anvendes til dråber i flow involverer dannelsen af en planar overflade som på billedet. 13 herpå enkelt celle proteom teknikker ofte design mikrofluid chips omkring overflade-immobiliseret capture agenter i en microarray format. 4 , 14
Dråber, selv, kan dannes i arrays på plane overflader, såkaldte droplet microarrays. 15 , 16 , 17 rumligt organisere dråber i arrays tillader dem at være bekvemt indekseret, let overvåges over tid, individuelt rettet og, om nødvendigt hentes. Droplet microarrays kan opnå en høj tæthed af mikro-reaktorer med tusindvis af elementer pr. chip, som er enten fritstående eller understøttet af microwell strukturer. 18 , 19 , 20 de kan være dannet af sekventielle deposition af flydende håndtering robotter, inkjet spottere, kontakt microarrayers21,22,23,24,25, 26 , eller de kan selv samle på overflader som superhydrophillic steder mønstret på en superhydrophobic overflade. 27 , 28 , 29
Med disse overvejelser i tankerne, var adresserbare Droplet Microarrays (Søren Peter) designet til at kombinere alsidighed, rumlige adresserbarhed og reducerede mængder af droplet microarrays med følsomheden af enkelt molekyle JOHANNAS mikroskopi til kvantitativt måle protein overflod. 5 Søren Peter aktiverer enkelt celle analyse danner en droplet microarray med enkelt celler over et antistof microarray, som er så udjævnet med olie til at forhindre fordampning. Mængderne af dråberne er diskret at forhindre tab af prøven, der ellers ville være opnået ved-chip ventilfunktionen i kontinuerlig flow mikrofluidik. 30 det absolutte antal mål protein fra en enkelt celle er ekstremt lille; dog reduceret mængden af dråber giver mulighed for forholdsvis høj lokal koncentration, således at de er opdaget ved hjælp af en sandwich antistof assay - antistof er immobiliseret i et særskilt område, eller spot, på en overflade, som indfanger protein som igen binder til en fluorescently mærket påvisning antistof i droplet volumen. En label-fri tilgang (dvs protein mål ikke skal mærkes direkte), Søren Peter er generelt anvendes til at analysere celler fra primære kilder, såsom forarbejdede blod, fint har brug for aspirates samt dissocierede tumor biopsier og celler fra kultur og deres lysates.
Måle variationen i protein overflod på tværs af en celle population er vigtigt ved fastsættelsen heterogenitet i svar, for eksempel, at et lægemiddel og vil hjælpe med at give indsigt i cellulære funktioner og veje, vurdering af delpopulationer og deres adfærd samt identificere sjældne hændelser, der ellers ville være maskeret af bulk metoder. Denne protokol beskriver, hvordan at producere og anvende adresserbare droplet microarrays fastlægges kvantitativt overflod af transskription faktor p53 i menneskelige kræftceller og kan bruges til at undersøge rollen af p53 svar på kemoterapeutiske stoffer. Target proteinet bestemmes af valget af opsamling og registrering af antistoffer og kan ændres til at omfatte flere eller forskellige mål. Anvisninger til at bygge et simpelt apparat indarbejde en koncentrisk dyse fra generelle lab forbrugsvarer til manuelt array 10 nL dråber udjævnede med olie. Den fulde eksperimenterende proces er beskrevet hvor hver dråbe der derefter indlæses med en enkelt celle, som er så mængden og udtryk for protein bestemmes med enkelt molekyle opløsning ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse
-
Gøre chips og print antistof microarrays
- Tillægge en coverslip functionalized til at understøtte et antistof microarray en selvklæbende silicone/akryl isolator. Dette er benævnt chip.
Bemærk: Forskellige overfladen kemi er blevet testet for deres egnethed med adresserbare dråber. 5 overfladen kemi skal være optimeret til alternative capture agenter. ADM isolatorer findes i handelen eller kan fremstilles af laser opskæring akryl (CAD fil af isolator bruges i dette arbejde tilbydes som en download, se Supplerende kodefil). - Tænd for microarrayer og sæt fugtighed til 75%.
Bemærk: relativ luftfugtighed reducerer fordampning af udskrivning løsning fra microarray pin og reducerer intra og Inter-Diesel spot variation. - Ren microarray pin PIN rengøring løsning for 5 min ved ultralydbehandling. Skyl pin med ultra-rene vand ved hjælp af en vaskeflaske og tørre ved hjælp af kvælstof.
Bemærk: Suspendere pin, kun fordybe pin tip. Et objektglas med et passende boret huller vil hjælpe hvis en pin indehaveren ikke kan opnås. - Gøre 5 mL udskriftsbufferen bestående af 3 × saltvand-natrium citrat (SSC) buffer, 1,5 M betain suppleret med 0,01% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS). Opbevares ved 4 ° C på ubestemt tid.
- For at forberede en udskrivning opklaring, tø anti-p53 antistof (p53/Mdm2 ELISA kit; se tabel materialer) delprøver opbevares ved-80 ° C. Bland det 1:1 med bufferen til en endelig koncentration på 0,5 mg/mL. Indlæse 5-10 µL af udskrivning opløsning i en 384 godt-plade ved hjælp af en mikropipette og plads i microarrayer.
- Indlæse chips samlet i trin 1.1.1 i microarrayer. Programmet microarrayer til at udskrive steder ved koordinater, fastlagt i midten af hver brønd med en isolator.
Bemærk: Microarrayers beskæftiger en række, overvejende, proprietær software og så læseren opfordres til at konsultere den relevante litteratur. Microarray kræves for ADM isolator featured i den ledsagende CAD-filen i trin 1.1.1 består af rektangulære elementer; de relevante afstande er fastsat. - Gemme chips i lufttætte beholdere og wrap med folie. Opbevares ved 4 ° C til 6 uger.
Bemærk: Folien er at forebygge foto-skader. Opbevaring ved 4 ° C begrænser forringelse sats af biomolekyler og eventuelle skadelige reaktioner, der kan handle for at reducere microarray aktivitet. En lufttæt beholder tillader chips til Reagensglasset stuetemperatur før anvendelse uden kondens dannes på chip overflade. Kontakt microarray udskrivning udnytter overfladespænding og vedhæftning mellem den print løsning og print substrat til at fremstille steder. Før udskrivning eller blotting er normalt forpligtet til at fjerne overskydende løsning fra microarray pin til at give ensartet størrelse steder. Smid ikke den opoffrende pre print coverslip, da det kan bruges til at vurdere batch kvalitet.
- Tillægge en coverslip functionalized til at understøtte et antistof microarray en selvklæbende silicone/akryl isolator. Dette er benævnt chip.
-
Forberede kanyler, slanger og koncentrisk dyse for udlevering adresserbare dråber
- Adskille 100 µL (for en vandig droplet) og 1 mL (for takstlofter olie) glas Hamilton sprøjter og skyl dele med destilleret H2O.
- Fodre en 100 mm længde på 150 µm ID/360 µm OD fused silica slanger gennem en 40 mm længde af 1.0 mm ID/1/16 "OD PFA rør indtil det stikker ud af 2 mm. Dette vil danne koncentriske dysen.
- Påfør et tyndt lag af ren lim til slutningen af en 10 µL pipette tip og indsætte i 40 mm stykke 1.0 mm ID/1/16 "OD PFA slanger. Hvis det er påkrævet, flytte smeltet kvarts rør for at opretholde en 2 mm fremspring på dysen før de selvklæbende sæt.
- Indsæt anden enden af smeltet kvarts kapillær i slutningen af en 200 mm længde af 0.014" ID/0.062" OD PTFE slanger og Tilslut det til en 100 µL Hamilton sprøjte fyldt med 4% bovint serum æggehvidestof (BSA) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (PBSA).
Bemærk: Proteiner og andre biokemiske arter kan ikke-specifikt bindes til overflader og kan være mistet eller denatureres. BSA bruges til at blokere overflader for at minimere ikke-specifik binding ved sacrificially bindende til disse flader. - Indsæt en 400 mm længde af 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP slangen i en 200 µL pipette spids, indtil det danner en forsegling. Påfør et tyndt lag af ren lim til en anden 200 µL pipette tip og skubbe det ind i den første tip til fix slangen på plads. Skal den åbne ende af 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP slangen til en 1 mL Hamilton sprøjte fyldt med mineralsk olie.
- Indsæt den 200 µL pipette tip forsamling i 10 µL pipette spidsen af koncentriske dysen. Placere sprøjter i separat sprøjte pumper, som de bliver nødt til at operere uafhængigt.
- Fyld i 100 µL sprøjten med 4% PBSA blokerende løsning. Vedhæfte og flush 'vandigt' slangen med den blokerende løsning. Gentag to gange i alt 3 flushes.
- Fyld i 100 µL sprøjten med 0,125 µg mL-1 registrering af antistoffer (anti-p53 antistof (-1) mærket med Alexa 488) i 4% PBSA og re-vedhæfte slanger. Erstatte blokerende løsning i slangen ved udlevering 25 µL påvisning antistof løsning.
- Flush 'olie' slangen med mineralsk olie, indtil alle slanger og dysen fyldes med olie. Refill 1 mL sprøjte med mineralsk olie og re-vedhæfte slanger. Sikre den rør og mundstykke forsamling til en XYZ manipulator.
-
Udarbejde microinjector og micromanipulator
Bemærk: Nedenstående trin specifik henvisning til komponenter af microinjector og micromanipulator apparater som nævnt i tabel materialer, men gælder generelt for alle sådanne apparater.- Samle microinjector ved at knytte trykslanger og kapillær indehaveren.
- Langsomt dreje stempel skiven indtil mineralsk olie helt udfylder linjen.
- Montere kapillær indehaveren i oversættelse hoved mount.
- Lave kapillar i kapillær indehaveren med greb hoved.
- Med pipette udtages en løsning på 4% PBSA i en af brøndene af en isolator.
- Oversætte ved hjælp af micromanipulator og fordybe spidsen af kapillar i løsningen.
- Langsomt fylde kapillar med 4% PBSA og orlov til at blokere for 10 min.
- Skubbe microcapillary og dreje oversættelse modul, således at forsamlingen er klart af chippen.
2. danner adresserbare dråber og belastning med enkelt celler
- Form adresserbare dråber
- Sikre chippen på stadiet mikroskop.
Bemærk: Mikroskop er en inverteret fluorescens automatiseret mikroskop i stand til at enkelt molekyle JOHANNAS monteret med en en kodet XY fase og en elektron at multiplicere charge - sammen enhedens kamera (EM-CCD). - Optage mikroskop fase koordinaterne for hvert sted i matrixen ved hjælp af automatiserede mikroskop kontrol software.
- Indstille XYZ manipulator på stadiet mikroskop. Placer dysen i en vinkel af 50-60°. Sikre, at dysen har tilstrækkelig længde og regnskabsafslutning at nå chippen. Sæt 'vandigt' og 'olie' sprøjten pumper for at give afkald på 10 nL på 100 µL/min og 5 µL 100 µL/min., henholdsvis.
Bemærk: Under tilberedning, den vandige opløsning i spidsen af dysen kan tørre. - Dispensere vandig opløsning, indtil en perle af væske er synlig på hovedet af dysen. DAB med en støvfri tør for at fjerne den.
Bemærk: Afhængigt af antallet af betingelser under undersøgelsen, reservere et antal brønde til at tjene som reservoirer for celler. For en enkelt celle/linjetype et enkelt reservoir vil være tilstrækkeligt. - Ved hjælp af automatiserede mikroskop kontrol software, sæt mikroskop fase koordinater til et antistof spot i array og fokus på coverslip overflade.
- Pas på ikke at forstyrre sted, ved hjælp af XYZ manipulator, justere glas kapillær spidsen af den koncentriske dyse til siden af antistof spot og dispensere 10 nL i vandig opløsning. Uden at flytte stadierne, der afpipetteres 5 µL af olie til cap den vandige opløsning. Langsomt hæve dysen klart af denne droplet og flytte til næste godt.
- Gentag trin 2.1.6 for alle antistof steder i matrixen.
- Efter 30 min, billede alle steder i matrixen ved hjælp af automatiserede mikroskop kontrol software til at bestemme baggrunden for enkelt molekyler er bundet til hver antistof spot forud for lastning celler.
- Sikre chippen på stadiet mikroskop.
- Indlæse adresserbare dråber med celler
- Fjerne celle kultur kolberne fra rugemaskinen, og frigør celler ved hjælp af trypsin/EDTA-oploesning.
Bemærk: I denne undersøgelse, BE menneskelige kolon karcinom cellelinje blev brugt og kulturperler bruger Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% (v/v) føtale bovint serum (FBS) i en CO2 inkubator. - Hvis det er påkrævet, fluorescently pletten celler.
- Resuspend celler i en opløsning af 0,125 μg/mL detektor-antistof (anti-p53 antistof (-1) mærket med Alexa 488) i 10% FBS i L-15 medier. For at sikre en enkelt cellesuspension, celle Opløsningen filtreres gennem et 40 µm pitch celle si.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer og fortyndet eller koncentrere celle løsning til en koncentration på 25-400 × 103 celler/mL. Dette sikrer, at celler sediment med tilstrækkelig afstand til komfortabelt manipulere microcapillary.
- Indlæse enkelt celler i adresserbare dråber fra celle reservoiret ved hjælp af micromanipulator og microcapillary.
Bemærk: Ikke-tilhænger celler kan indlæses i løs vægt til mikropipette og udleveres én efter én ind i adresserbare dråber. Trods blokerende overfladebehandling, vedhængende cellelinjer tendens til at ikke-specifikt klæbe til glas microcapillary indre væg og gå tabt. - Ved hjælp af en 10 × mål at observere, bruge microinjector til Aspirér en enkelt celle i microcapillary fra celle-reservoiret.
- Gemme micromanipulator fase koordinater, hvis ved hjælp af en elektronisk manipulator stage eller manuelt Bemærk z-position.
- Trække mikropipette ved at oversætte det opad for at rydde den 1 mm højde af chippen. Udføre det manuelt med et joystick eller automatisk ved hjælp af funktionen 'Eject' af en elektronisk manipulator fase.
- Sæt scenen koordinater til at en adresserbare droplet den ved hjælp af automatiserede mikroskop kontrol software. 'Injicere' mikropipette ved at returnere det til den lagrede (eller bemærket) z-position. Udføre det manuelt med et joystick eller automatisk hvis ved hjælp af en elektronisk manipulator stage.
Bemærk: Microcapillary vil gennembore takstlofter olien og være placeret i den vandige del af adresserbare slipværktøjet. - Give afkald på cellen i adresserbare slipværktøjet ved hjælp af microinjector. Omfanget af en 10 nL adresserbare droplet vil stige med mindre end 1%.
- Gentag 2.2.5-2.2.9 for de resterende adresserbare dråber forlader nogle gratis for den eksperimentelle kontrol hvor adresserbare droplets ikke indeholder en celle.
Bemærk: En enklere alternativ til Ilægning af enkelt celler i adresserbare dråber ved hjælp af en microcapillary og micromanipulator er at erstatte løsningen taktfast 1.2.8 med en opløsning af detektor-antistof i 4% PBSA indeholdende celler i en koncentration på rækkefølgen 10 5 celler/mL, svarende til 1 celle/10 nL. Enkelt celle belægning vil være Poissonian og celle koncentration skal optimeres.
- Fjerne celle kultur kolberne fra rugemaskinen, og frigør celler ved hjælp af trypsin/EDTA-oploesning.
- Lyse celler og billede array
- Billede celler i droplets bruger brightfield mikroskopi, herunder eventuelle fluorescens billeddannelse.
Bemærk: Imaging tager ca. 3 min. til billede ~ 100 dråber ved hjælp af en automatiseret mikroskop. Udføre imaging med en 60 NA = 1,49 oliebestan mål. Ingen filtre, der er nødvendige for brightfield imaging standard filter sæt anvendes til fluorescens billeddannelse. - Billede alle steder i matrixen ved hjælp af enkelt molekyle JOHANNAS mikroskopi.
Bemærk: Indstillingerne bruges som i trin 2.3.1 med en specialiseret JOHANNAS filter sæt. Disse billeder vil efterfølgende analyseres i afsnit 3 at fastslå baggrunden for enkelt molekyler er bundet til hver antistof stedet før lysering. Enkelt molekyle imaging ved hjælp af total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi tager ca 5 min til billede ~ 100 steder. - Fokusere på en celle i en adresserbare slipværktøj. Opnå komplet optisk lysis ved at fokusere en enkelt 6 ns laser puls (bølgelængde 1064 nm, pulse energier 14.1 ± 0,3 µJ pr. puls) tæt på placeringen af cellen.
Bemærk: Laser puls opstiller en ekspanderende kavitation boble at sakse cellen og frigiver cellebestanddele i droplet volumen. 4 , 31 de mekaniske processer på grund af laser-induceret lysis Forstyr ikke grænsefladen olie-vand på lav puls energier. Optisk lysis tager typisk ca. 20-30 min. til lyse 100 celler. Som omtalt i afsnittet diskussion, er der en række alternative metoder til at lyse enkelt celler hvis optisk lysis opsætning ikke er muligt. - Gentag for alle celle-holdige adresserbare dråber forlader 5 gratis for den eksperimentelle kontrol hvor adresserbare dråber indeholder en un-lysed celle.
- Bemærk det tidspunkt, hvor hver celle er mængden.
Bemærk: Disse tider vil blive brugt til at korrigere enkelte bindende kurver for hver plet i trin 3.1.9. Ofte er det tilstrækkeligt at bemærke gange hvornår de første og sidste celler er mængden og vurdere resten antager en tilstrækkeligt konsekvent tid mellem lysis begivenheder. - Erhverve enkelt molekyle billeder ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi af alle steder hver 10 min i de første 30 min. derefter hvert 20 min for en yderligere 60 min. Hvis der kun er interesseret i mængden af protein bundet ved ligevægt, billede alle steder efter inkubation chip i 90 min ved stuetemperatur.
NOTE: Tid til at nå ligevægt vil afhænge droplet volumen og tilhørsforhold af de antistoffer, der anvendes i analysen. JOHANNAS mikroskopi udføres ved hjælp af en laser magnetisering kilde på = 488 nm og 1,5 mW effekt målt på tilbage blænde ved hjælp af en optisk wattmeteret. Enkelt molekyle billeder er erhvervet ved at angive indstillingerne for erhvervelse på EM-CCD kamera til 900 ms erhvervelse tid, 16-bit digitalisering på 1 MHz udlæsning hastighed og en EM forstærkende af 10. Isolator kan genanvendes ved omhyggeligt at fjerne coverslip.
- Billede celler i droplets bruger brightfield mikroskopi, herunder eventuelle fluorescens billeddannelse.
3. dataanalyse
-
Enkelt molekyle tælle (ikke-overbelastet/digitale regime)
- Ved hjælp af Fiji (eller Matlab), for enhver ikke-overbelastet antistof spot, indlæse billedet erhvervet før lysis (baggrund, BKD).
Bemærk: Operationer i de følgende trin er ligefrem udføres ved hjælp af Fiji billede analyse software. En brugervejledning kan findes på følgende link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - I Fiji, Vælg BKD billede. Vælg "Duplikat" til dublerede BKD under menuen "Billede". Vælg duplikerede billedet og vælg "Gaussian Blur" under "Processen > filtre", og Angiv en radius på 50 pixel.
- Flade BKD billedet, således at der er en effektiv ensartet intensitet fordeling af excitation lyskilde ved at dividere BKD billedet sløret BKD billedet, producerer BKD_FLAT.
- Under "Processen" Vælg "billede Lommeregner...", angive handlingen "Kløft", billederne kræves, og at vælge afkrydsningsfelterne "Opret nyt vindue" og "32-bit (float) resultat."
- Subtrahere hver pixel i billedet af 1 ("processen > Matematik", Vælg "Trække..." og angiver værdien 1). Gennemsnitlige pixel skal være 0.
Bemærk: Feltet udfladning og fladtrykte baggrundsbilleder kan kontrolleres let da summen af alle pixels bør være 0 og eventuelle resterende forskydning kan kompenseres mere ligefremt. - Vælg en 50 pixel × 50 pixel område i nogen af de 4 hjørner af BKD_FLAT billedet. Måle pixel intensitet standardafvigelse (σ) ved at vælge "Analyser" og "Foranstaltning".
Bemærk: Den sammenfattende statistikker for udvælgelsen vil blive præsenteret i en resultatvinduet. Dette bestemmer off stedet baggrunden hvor der er usandsynligt, at en høj tæthed af enkelt molekyler. Området skal måles manuelt kan vælges ved hjælp af markeringsværktøjerne standard menu eller ved at køre makroen kode "makeRectangle (x, y, bredde, højde)"; Dette skaber en rektangulær markering, hvor x og y argumenter er koordinater (i pixel) fra øverste venstre hjørne. - Indstil billede tærsklen til 3σ og oprette et binært billede SM_MASK.
- Vælg "Tærskel..." under "Billede > Juster", og fastsætte de lavere tærskel for 3σ.
Bemærk: Pixels, hvis værdi ligger under tærsklen, der er indstillet til nul og pixel overstiger tærsklen, der er angivet til 1. Tærsklen vil bestemme den tillid, hvormed thresholded pixels tilhører et enkelt molekyle.
- Vælg "Tærskel..." under "Billede > Juster", og fastsætte de lavere tærskel for 3σ.
- I den segmenterede billede SM_MASK, Angiv pixelværdier intensitet til nul for alle objekter, der ikke har en størrelse på 4-9 pixel2 ret og en 0,5 - 1 ved at vælge "Analysere" efterfulgt af "Analysere partikler" og angive den størrelse og cirkularitet.
Bemærk: Pixelstørrelse kan være nødvendigt at være optimeret til andre fluorophores og mikroskop sæt ups. På grund af typen kamera støj enkelt pixel kan være over denne tærskel og kasseres ikke, selvom det ikke er enkelt molekyler. Pixel størrelse kriterium vil korrekt kassere sådan pixel. Enkelt molekyler er generelt cirkulær i form. Cirkularitet værdien 1 angiver en perfekt cirkel, hvorimod værdien nærmer sig 0 angiver en stadig mere aflange form. De resterende objekter er enkelt molekyler og kan medregnes. En maske kan indstilles til at afgrænse området i stedet for at diskriminere på stedet og off-stedet tæller pr. ramme. Det er lettere for rammer erhvervet på senere tidspunkter hvor der er et tilstrækkeligt signal på stedet, som kan anvendes til tidligere rammer. - For den samme ikke overbelastet antistof spot, indlæse og gentage trin 3.1.1 - 3.1.7 for alle billedrammer fanget som en tidsopløst serie erhvervet post lysering. Bruge lysis gange har noteret i trin 2.3.5. at korrigere enhver bindende kurver.
- Ved hjælp af Fiji (eller Matlab), for enhver ikke-overbelastet antistof spot, indlæse billedet erhvervet før lysis (baggrund, BKD).
-
Enkelt molekyle tælle (overbelastet/analog regime)
- For at beregne den gennemsnitlige intensitet af et enkelt molekyle, før du fortsætter, skal du gentage trin 3.1.1 - 3.1.8.
- Multiplicer billederne, BKD_FLAT og SM_MASK til at producere et billede, hvorved nul pixelværdier er forbundet med enkelt molekyler.
- For at udføre dette, under menuen "Proces", Vælg "Billede Lommeregner...", angive handlingen "Multiplicer" og billederne kræves, og vælg kasser "Opret nyt vindue" og "32-bit (float) resultat."
- Opsummere alle pixelværdier intensitet ved at vælge "Analyser" og derefter "Foranstaltning"; den sammenfattende statistikker for udvælgelsen vil blive præsenteret i en resultatvinduet. Dividere med antallet af optalte enkelt molekyler pr trin 3.1.8 til at beregne den gennemsnitlige intensitet pr. enkelt molekyle.
- For enhver overbelastede antistof spot, indlæse billedet opnået efter lysering og tromle med en sløret baggrundsbillede pr. trin 3.1.2 og 3.1.3.
- Subtrahere hver pixel i den samkopieret billede af 1 ("processen > Matematik", Vælg "Trække..." og angive en værdi på 1)
- Vælg en 50 pixel × 50 pixel område i nogen af de 4 hjørner af billedet og måle pixel intensitet standardafvigelse (σ). Se trin 3.1.5 for detaljer.
- Oprette en maske, binært billede ved at indstille billedet tærsklen til 3σ og angive pixelværdier intensitet til nul af objekter med en størrelse mindre end 4 pixel2. For at udføre dette, under menuen "Analyze", Vælg "Analysere partikler" og angive den størrelse og cirkularitet.
- Multiplicere fladtrykte overbelastede antistof spot billedet med binært billede maske.
- For at udføre dette, under menuen "Proces", Vælg "Billede Lommeregner...", angive handlingen "Multiplicer" og billederne kræves, og vælg kasser "Opret nyt vindue" og "32-bit (float) resultat."
- Summen af de resterende pixel intensiteter ved at vælge "Analysere" efterfulgt af "Foranstaltning"; den sammenfattende statistikker for udvælgelsen vil blive præsenteret i en resultatvinduet.
- Dele summen af pixel intensiteter af den gennemsnitlige enkelte molekyle intensitet til at beregne antallet af enkelt molekyler er bundet til den overbelastede spot.
-
Kalibreringskurven for absolut kvantificering
- Gentag punkt 1 og 2 til at danne 10 nL adresserbare dråber med detektor-antistof i 4% PBSA løsning tilsat en kendt koncentration rekombinante proteiner.
- Udføre en koncentration række 102- 107 rekombinante proteiner per droplet ved at variere den kendt koncentration af rekombinante protein tilføjet til løsningen. Det anbefales at arbejde med hensyn til antallet af proteiner per droplet til at kalibrere enkelt celledata ligetil.
- Bruge den koncentration serie data i trin 3.3.2 at kalibrere nogen enkelt molekyle tæller pr. spot til protein overflod pr. droplet og ved udvidelse protein overflod pr. enkelt celle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det absolutte basal protein kopi antal p53 blev fastsat med enkelt celle opløsning i en menneskelig colon cancer cellelinie, BE celler. Vi demonstrere hvordan p53 udtryk kan variere over flere størrelsesordener og vise en svagt positiv korrelation mellem celle størrelse og protein kopi nummer inden for befolkningens hvilende BE celle.
Adresserbare Droplet Microarrays dannes når vandig dråber er udleveret på antistof spot steder og udjævnet med olie. Her, støtter dråber en følsom p53 protein assay. Coverslips er klædt med capture antistof steder ved hjælp af en kontakt microarrayer og en pinkode. Anti-p53 capture antistof er taget fra en kommerciel ELISA testkit. Udskrivning betingelserne var sådan at opsamling steder var ca 100 µm i diameter med en maksimal capture kapacitet på 6,2 ± 0,5 x 105 proteiner pr. spot. 32
Brug af en isolator bundet til coverslip tillader en højere tæthed af droplets til at dannes, da det begrænser spredningen af olie til nærliggende antistof capture steder. I hvert hul i isolator dannes dråber ved at fjerne en vandig opløsning, som er så udjævnet med olie til at forhindre fordampning (figur 1A). En minimal mængde af olie kan udleveres for at cap droplet; men det er nyttigt at se bort fra et beløb som fylder hver isolator ja præcis sådan, at olie overfladen er flad for billeddannelse. Isolatorer er enten kommercielt indkøbt eller fremstillet af laser opskæring akryl plader. Silikone isolatorer er disponible pre-cut brønde i en 4 x 6 array (n = 24) men kan ændres til en 4 x 11 array (n = 44) ved hjælp af en biopsi eller multi hul læder punch. Laserskåret isolator i figur 1B viser en bred vifte af 100 sekskantede brønde hver med en maksimal diameter på 2.89 mm, en center til center afstand på 3,9 mm og en højde på 0,5 mm. Dråberne kan opbevares og forblive stabil i længere perioder (observeret op til 3 måneder).
Dråber oprettes manuelt ved hjælp af et hjem-bygget apparat, som oversætter en koncentrisk slange dyse (figur 1 c), som er tilsluttet to sprøjte pumper (figur 1A). Koncentriske rør dysen består af en smeltet silica kapillær, som dispenserer den vandige fase, fodres gennem en kort længde på PEEK slanger, som dispenserer olie fase. Ved hjælp af et mikroskop, dysen er justeret til en antistof stedet og pumperne vil først give afkald på den vandige opløsning, umiddelbart efterfulgt af olie (figur 1E, trin 1-4). Når alle dråber i ADM er dannet, bruges en microinjector og micromanipulator (se tabel materialer) til at indlæse hver dråbe med en enkelt celle (fig. 1 d). Mikropipette ville fange en celle fra et reservoir af celler, udleveres i en af brøndene på chippen, oversættes til et slipværktøj godt og derefter trænge ind olie cap for at levere cellen i den vandige slipværktøj (figur 1 d, trin 5-8).
Alle steder inden for dråberne er afbildet før lysis og vil blive brugt til at bestemme graden af ikke-specifik binding til steder (figur 2A). Enkelt celler er fuldt mængden (herunder kerne) bruger optisk metoder. 31 optisk lysis afhængig at klipning kraft af en ekspanderende laser puls-induceret kavitation boble til cellerne sprænges. Pleje skal foretages, at grænsefladen olie-vand ikke blive forstyrret af disse processer ved at begrænse puls energi og deponering celler fra olie/vand-grænseflade. Når celler er mængden, er arrayet afbildet af JOHANNAS mikroskopi ved hjælp af en automatiseret mikroskop; rammer er erhvervet hver 10 min for 30 min og derefter hvert 20 min for en yderligere 60 min. Betingelserne, som antistof affinitet, protein diffusion og slipværktøj volumen, er sådan, at bindende ligevægt nås inden 90 min erhvervelse. En typisk enkelt celle pulldown er vist i figur 2A.
Processen med billedanalyse til at bestemme den enkelt molekyle tæller er skematisk afbildet i figur 2B. Billeder af steder enten betragtes som værende ikke-overbelastet, hvor målet proteinkoncentration er sådan, at enkelt molekyler er godt adskilt og nemt skelnes eller overbelastet, hvor målet proteinkoncentration er højere og enkelt molekyle billeder overlapning og er ikke længere individuelt kan skelnes. Da JOHANNAS excitation profil er ujævn, er det afgørende, at alle erhvervet billeder være flade-felt korrigeret. En Gaussian blur anvendes på en ikke-overbelastet ramme, der fungerer som en udjævning filter til at fjerne detaljer og støj og producere et billede med den gennemsnitlige profil af JOHANNAS excitation profil. Denne forarbejdede billedet kan bruges til at 'flade' det oprindelige billede. For ikke-overfyldt billeder, hvor, selv ved ligevægt, der er par enkelte molekyler, kan en ramme behandles for at korrigere sig selv. Denne fremgangsmåde gælder ikke for en overbelastet spot, hvor enkelt molekyler tæt besætte stedet og kræver et baggrundsbillede skal erhverves for samkopiering. Fladtrykt rammer er så thresholded for pixel med intensiteter mindst 3 gange standardafvigelsen baggrund plus dens middelværdi. Enkelt molekyler er derefter automatisk opdaget ved at identificere 4-9 grupperet pixels med cirkularitet større end 0,5 ved hjælp af funktionerne partikel analyse af Fiji. Fra resultaterne, kan den gennemsnitlige intensitet af et enkelt molekyle beregnes. Det bruges til at bestemme antallet af enkelt molekyler på en overbelastet plet ved at dividere antistof spot samlede intensiteten af den kendte gennemsnitlige intensitet af et enkelt molekyle. Disse trin kan automatiseres ved hjælp af Fijis Scripteditor.
En koncentration serie udføres for at bestemme den enkelte molekyle tæller ved ligevægt i dråber med kendte koncentrationer af rekombinant p53 protein (figur 3A). Betingelserne er sådan at opsamling antistof steder fange en brøkdel af det samlede mål protein, ca. 1% i regionen i linearitet (for 105-108 proteiner per droplet R2 = 0,99). Ikke-specifik binding i dråber er 187 ± 60 molekyler. Resultaterne af enkelt celle pulldowns kan derefter konverteres for at opnå absolut protein kopi antallet pr. celle-distributioner. Figur 3B viser fordelingen af absolut p53 protein udtryk i enkelt BE celler ved hjælp af Søren Peter. P53 protein udtryk i BE-celler, som kan antages for at være genetisk identiske eller meget lignende, er en stokastiske proces. Fordelingen er Gamma-lignende - asymmetrisk og unimodale med en lang hale. Derfor betyder (1.82 × 106 proteiner) kan overvurdere den modale protein overflod (bin 0 - 5,0 × 105 proteiner), og standardafvigelse (1.88 × 106 proteiner) helt fange ikke funktioner af distributionen. Denne fordeling er et eksempel på betydningen af enkelt celle målinger til at fange heterogenitet af protein udtryk i cellen befolkning, som ellers ville være tabt når gennemsnit med bulk målinger. Yderligere parametre for hver celle kan måles. Her, vurderes cellevolumen ved at måle hver celle diameter før lysis i slipværktøjet og forudsat cellen er omtrent sfæriske. Figur 3 c viser en sammenligning af p53 absolutte protein kopi nummer i enkelt BE celler som en funktion af Cellestørrelse. Der er en tendens til større celler har en højere samlet p53 kopi tal. Interessant, er det muligt fra den fordeling, at der er koordinering mellem p53 udtryk og Cellestørrelse, da der synes at være et minimum p53 kopi nummer pr. celle; men de mekanismer, hvorved dette opstår kræver yderligere undersøgelser.
Figur 1: adresserbare Droplet Microarray apparater og Chip. (en) dråber udleveres manuelt ved hjælp af en 3-akse manipulator til at oversætte en koncentrisk slange dyse. Den vandige droplet er udleveret på bestemte steder i et antistof microarray efterfulgt af udjævningen olie. (b) isolator giver mulighed for en højere tæthed af adresserbare dråber på underlaget ved at begrænse spredningen af olien. Isolatorer kan fremstilles af laser opskæring 0,5 mm akryl plader. For at støtte visualisering af dråber, blå frugtfarve farvestof er deponeret ved hjælp af apparatet i en). Skalere bar 10 mm, inset skala bar 1 mm. (c) koncentriske rør dysen tillader adresserbare droplets til at blive dannet, samles som i trin 1.2 i protokollen. (d) en microinjector og micromanipulator bruges til at isolere cellerne i individuelle adresserbare dråber, fremstillet efter anvisningerne i trin 1.3 i protokollen. (e) de vigtigste trin i processen med at oprette og indlæse adresserbare dråber er vist. Et antistof sted er beliggende ved hjælp af en kodet oversættelse stage (1) hvor spidsen af kapillar slangen er justeret (2) og de vandige (3) derefter olie (4) komponenter udleveres. Enkelt celler kan indlæses ved hjælp af et glas microcapillary (5-8), som gentagne gange kan løse den vandige slipværktøj (7) og deponere en celle (8). Skalere barer 100 µm. Den røde pil i (5) og (8) fremhæver den isolerede enkelt celle og indsatser (8) viser den isolerede enkelt celle på høj forstørrelse (skala bar 10 µm). Dele af denne figur er blevet ændret fra reference12, gengivet med tilladelse fra The Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: billede analyse trin. Hvert spot i matrixen er periodisk afbildet af JOHANNAS mikroskopi, indtil ligevægt (tEq) er nået (90 min for p53 assay). Ligevægt tid afhænger t i løsning samt antistoffer par tilhørsforhold til den målrettede protein. a) eksempel enkelt molekyle JOHANNAS mikroskopi billeder af baggrunden samt en eksempel enkelt celle pulldown (skala barer 20 μm). Indsatte billede viser en forstørret del af baggrundsbillede med nogle enkelt molekyler fremhævet med røde pile (skala bar 5 μm). b) skitse af billedanalyse detaljeret i trin 3 i protokollen. Kort, der er to brede ordninger hvor steder kan betragtes som ikke-overbelastet, enkelt molekyler er sparsom, og overbelastede, hvor tætheden af enkelt molekyler er sådan, at der er væsentlig overlapning og kan ikke længere identificeres enkeltvis. Et afgørende skridt i billedanalyse er feltet samkopiering for at fjerne effekten af profilen ikke ensartet intensitet af excitation laser. I det digitale tælle regime, der enkelt molekyler identificeres direkte, baseret på deres parametre, intensitet og form. I det analoge tælle regime, beregnes antallet af enkelt molekyler ved at måle den samlede spot intensitet på ligevægt og dividere med den gennemsnitlige intensitet af et enkelt molekyle, som er kendt fra det digitale tælle regime. Trin kan automatiseres fritagelserne i ImageJ at analysere dataene. Nederste panel sekvens af billeder viser ophobning af target protein på antistof capture spot; i første omgang, steder er ikke overbelastet (t1) som target protein ophobes på antistof spot, enkelt molekyler kan blive stadig mere overbelastet (tn), indtil ligevægt nås (teq). Bemærk at om en plet forbliver ikke-overbelastet eller bliver overbelastet afhænger af en række faktorer, navnlig overfloden af target proteinet i analyse volumen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: enkelt celledata. Absolut kvantificering er opnået ved hjælp af en kalibreringskurve. (en) enkelt molekyle tæller er lavet ved hjælp af kendte koncentrationer af rekombinante proteiner. Dette er en kalibreringskurve og bruges til at konvertere enkelt molekyle tælles på hver plet til antallet af mål proteiner i analyse volumen og dermed enkelt celle kopi nummer. Den vandrette røde stiplede linje angiver niveauet af ikke-specifik binding af 187 ± 60 molekyler. Fejllinjer er én standardafvigelse af middelværdi af 3 forsøg kører. Den stiplede linje repræsenterer 100% detektion af protein. (b) en fordeling af enkelt celle basal p53 protein udtryk i BE kræftceller er vist viser en langhalet gamma-lignende distribution hvor p53 protein udtryk i nogle af cellerne er betydeligt højere end værdien modal. (c) Scatter plot af p53 protein kopi antallet pr. celle som funktion af cellevolumen viser hvordan protein udtryk varierer som funktion af Cellestørrelse. Dele af denne figur er blevet ændret fra 12 og gengivet med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adresserbare Droplet Microarrays er en følsom og extensible metode til kvantitativ bestemmelse af absolut kopi antallet af protein i en enkelt celle.
Begrænsning af niveauet af ikke-specifik binding er (NSB) kritiske i protokollen til at opnå så lav en grænse på opdagelse som muligt. Proteiner og andre biokemiske arter kan ikke-specifikt bindes til en række grænseflader til stede inden for dråberne — coverslip overflade, antistof spot og olie/vand-grænseflade. Proteiner kan gå tabt ved partitionering i grænsefladen eller olien selv. Vi har vist, at 4% BSA i den vandige droplet er i stand til at begrænse NSB af proteiner ved hjælp af de antistoffer, der er anført i forsøgsprotokollen. Alternative protein mål og antistoffer bruges til at opdage dem kan kræve alternative blokere tilgange, sådan nonioniske detergenter eller kompatibel overfladeaktive stoffer. Fluorholdige olier kan også blive testet for deres egnethed i tjener som takstlofter olien. I sådanne tilfælde foretages yderligere overvejelser som kritiske micelle koncentration og tætheden af takstlofter olien.
De uvaskede udskrivning buffer, som forbliver på hvert spot sted efter opstilling aids i tilpasningen. Ved i første omgang deponeringen dråber, skal pleje tages til at ridse eller beskadige antistof plet ved spidsen af koncentriske rør dysen. I at udvikle metoden yderligere, kan et fluorescerende farvestof være dopede i antistof udskrivning bufferen, som bliver immobiliseret ud over capture antistof. Dette vil give mulighed for vask og blokning trin skal udføres før droplet opstilling; men et sådant skridt ville ikke nødvendigvis være påkrævet hvis ved hjælp af automatiserede metoder af droplet opstilling, såsom inkjet udskrivningsmetoder.
Overfladen af de kommercielt producerede coverslips, som dannes dråber er belagt med en hydrofil polymer og vandig dråber produceret på dem med et volumen på 10 nL har en diameter på 751 ± 42 mm. Der er en grænse for, hvor meget de deponerede droplet bør våd overflade eller opslag på grund af vægten af den takstlofter olie da under en minimums tykkelse der er forøget optisk scatter fra JOHANNAS excitation laser. Scatter øger det gennemsnitlige niveau i baggrunden og kan overdøve signal, når opdage enkelt molekyler. Antistof stedet skal også være placeret fra droplet kanten da excitation laserlys kan delvist eller fuldt strike et område uden for den vandige slipværktøj. Den kritiske vinkel betingelse vil ikke længere være opfyldt for lys slående grænsefladen glas-olie i stedet for glas-vand-grænseflade.
Bestem kvantitativt overflod af protein antallet af enkelt molekyler er bundet til en spot skal bestemmes gennem billedanalyse. Til at bestemme samlet mængde protein i løsning fra enkelt molekyle tæller en kalibreringskurve er påkrævet og muliggør teknikken at være absolut kvantitative.
For at minimere photobleaching, steder er ikke afbildet kontinuerligt og JOHANNAS excitation laser kilde magt er minimeret. Protokollen, som blev forelagt har været anvendt med succes til photostable fluorophores, såsom Alexa Fluor farvestoffer. Alternative fluorophores kan bruges, men photobleaching skal vurderes og billedbehandling protokollen tilpasses om nødvendigt. Det samlede antal enkelt molekyler pr. ramme kan afbildes mod tiden for at reproducere den bindende kurve, selvom dette ikke er bestemt nødvendigt, hvis bindende kinetik ikke er søgt og imaging en enkelt ramme ved ligevægt vil være tilstrækkeligt.
Selv om der er et krav om to høj affinitet antistoffer, resulterer dette i en yderst følsom og meget specifikke assay, afgørende for målinger på enkelt celle-niveau. P53 antistoffer bruges i denne protokol er godt optimeret til at opdage gratis p53 fra enkelt celler. Target proteinet bestemmes af valget af antistoffer og kan ændres på en række måder: 1, erstattes begge opsamling og registrering af antistoffer binder alternative mål; 2, detektor-antistof kan udskiftes for at sonde protein-protein interaktioner eller posttranslationelle modifikationer til protein bundet til fange antistof, fx bestemmer statussen fosforylering af erobrede p53; 3, multiplex assays kan opnås ved at udskrive flere fange antistof steder tæt på-udskriver en 3 × 3 spot array er muligt inden for 10nL dråber. Selvfølgelig, for enhver ændring af target protein en række antistof skærme, skal kontrol og optimeringer gennemføres.
Flere metoder til at lysing enkelt celler er blevet rapporteret. 33 optisk lysis er et kemikalie-fri tilgang til hurtigt lyse individuelle celler uden at ændre indholdet af celler og bevare integriteten af proteiner og deres komplekser. Kemiske lysis ved brug af detergenter udgør et problem for integriteten af dråberne når mineralolie og kan forstyrre interaktioner mellem molekyler. 34 for assays hvor kemiske lysis er kompatibel det dog attraktive tilgang da det ikke er afhængige af udstyr såsom lasere eller micropatterned elektroder. 35
Dråberne vise sammenlignelige resultater med alternative enkelt celle metoder. I den nuværende generation af dråber ved hjælp af de foreslåede p53 antistoffer, er niveauet af NSB 187 ± 60 molekyler pr. spot. Enkelt molekyle tæller udviser stærk linearitet (R2 = 0,99) i den region, der strækker sig over 105 –108 rekombinant p53 proteiner per droplet. Dette tyder på, at mens lavere niveauer af protein kan blive opdaget i celler, der er en grænse for kvantitering af 105 p53 proteiner; Dette svarer til en enkelt molekyle optælling på steder af 901 ± 83. Dette er overvejende begrænset af mængden af dråber og adsorptionen til grænsefladen. Udførelsen af p53 assay er sådan, at når de udføres i en 10 nL volumen kun 1,1 ± 0,2% af det samlede mål protein er erobret fra løsning; Dette øges til 85 ± 9% når at reducere analyse volumen til 0,2 nL. 36 ved at reducere mængden af dråberne til under 1nL og adsorption, der er potentielle ved hjælp af de angivne antistoffer til p53 forbedre påvisningsgrænsen til < 50 proteiner pr. celle. Derfor har adresserbare dråber potentiale til at blive brugt til at måle meget lav overflod proteiner fra enkelt celler.
Adresserbarhed dråber som let gennemtrængelige olie cap tillader analyse cellevolumen til anfægtes sekventielt. Brug af en mikropipette muliggør indsprøjtning af et ønsket antal celler i hver dråbe i et stik af 10-20 pL, som ikke øger betydeligt volumen. For den chip, der er vist i figur 1B med 100 brønde, danner dråber og indlæse dem med enkelt celler typisk tager 75-90 min. lastning celler kan også opnås ved at behandle denne droplet ved hjælp af koncentriske rør dysen i stedet for mikropipette eller ved hjælp af en løsning der indeholder celler, når først danner dråber. Sidstnævnte ville være nyttige ved at begrænse antallet af trin i protokollen, men i begge tilfælde, belægning per droplet ville følge en Poissonian fordeling. Dette ville begrænse andelen af enkelt celledata pr. chip; dog ville dråber med nul eller flere celler tjene som kontrol. En yderligere begrænsning på brug af koncentriske dysen til adresse dråber er droplet volumen øges i 10nL intervaller. Med de foreslåede ændringer over dette kunne forbedres. Chip droplet mikrofluidik kan producere dråber på høj frekvens og har potentiale i at blive automatisk kombineret med Søren Peter at producere og manipulere dråber og sekventielt deponere dem i en planar array. Dette ville helt sikkert overvinde begrænsninger i produktionen af Søren Peter samtidig også giver mulighed for enkelt molekyle udlæsning af dråber.
Evnen til at behandle hver enkelt dråbe har en vifte af mulige anvendelser. Vi har demonstreret evnen til at indlæse fortløbende enkelt celler. Det tillader også fjernelse af ubundne cellulære materielle post lysis og post analyse af pipette til analyse ved hjælp af andre metoder. Eksempler på efterfølgende analyse ville omfatte kvantitative real-time PCR eller massespektrometri.
En af de nuværende flaskehalse for laboratorier, der ønsker at tage en kvantitativ tilgang til enkelt celle proteinanalyse er den høje tekniske barriere og behovet for specialiseret udstyr. Med Søren Peter, miniaturiserede, kan høj følsomhedsanalyser opnås uden brug af renrums faciliteter til at fabrikere mikrofluid lab-on-a-chip enheder. Eksperimenter er ikke begrænset af design af chip og deres omfang og placering kan ændres uden behov for opdigte nye mastere. Der er bestemt plads til forbedring i forenkle teknikken og sænkning af adgangsbarriere for enkelt celle analyse til bare en microarrayer, udskrive både antistof og slipværktøj microarrays og et fluorescens mikrotiterplade læseren, at billedet.
En række kliniske anvendelser af enkelt celle analyse spirende, navnlig i behandlingen af kræft. Tumor heterogenitet er en stor udfordring for effektiv kemoterapi. Mutationer i tumor udvikling, opstår med stigende hyppighed og heterogenitet kan resultere i morfologiske, genetiske, og proteom variabilitet. Enkelt celle analyse er købedygtig løse cellulære heterogenitet i en tumor og skabe en platform for at hjælpe med bedre at forstå og forudsige drug modstand og guide terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
ASR designet eksperimenter, udviklede protokoller og analyseret data. SC og PS udførte celle størrelse eksperimenter. ASR og OC skrev manuskriptet. Forfatterne ønsker at taknemmeligt anerkender støtte fra Prof. David R. Klug for at give adgang til udstyr. Forfatterne vil gerne takke den Imperial College avanceret Hackspace for adgang til fabrikation og prototyping faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
