Summary
Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.
Abstract
Muitas vezes celular comportamento e respostas celulares são analisadas a nível de população onde as respostas de muitas células são agrupadas como um resultado médio, mascarando o comportamento de ricos única célula dentro de uma população de complexo. Tecnologias de deteção e quantificação de proteínas de célula única têm feito um impacto notável nos últimos anos. Aqui nós descrevemos uma plataforma de análise de prático e flexível única célula baseada em microarrays endereçável da gota. Este estudo descreve como o número de cópias absoluta de proteínas do alvo pode ser medido com resolução de célula única. O tumor supressor p53 é o gene mais comumente mutado em câncer humano, com mais de 50% dos casos de câncer total, exibindo um padrão de expressão de p53 não-saudável. O protocolo descreve as etapas para criar 10 gotas de nL, dentro do qual as células de câncer humano único são isoladas e o número de cópia da proteína p53 é medido com resolução única molécula determinar com precisão a variabilidade na expressão. O método pode ser aplicado a qualquer tipo de célula incluindo material primário para determinar o número de cópia absoluta de qualquer proteínas alvo de interesse.
Introduction
O objetivo desse método é determinar a variação em abundância de uma proteína do alvo em uma população celular com resolução de célula única. Análise única célula fornece uma série de benefícios que não estão disponíveis com métodos bioquímicos tradicionais ensemble. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 em primeiro lugar, trabalhando no nível da célula única pode capturar a heterogeneidade rica de uma população de células que seria perdida caso contrário calculando a média do que ocorre com técnicas bioquímicas ensemble tradicional. A maioria dos métodos bioquímicos de cavalo de trabalho funciona com a maior parte, exigindo, como muitas vezes, milhões de células para produzir um resultado. Claro, as consequências da avaliação das populações de célula inteira depende de uma série de fatores, por exemplo, a heterogeneidade na expressão da proteína, onde algumas características importantes da distribuição de abundância de proteína podem ser perdidas. Do ponto de vista prática, a sensibilidade necessária de técnicas única célula torná-los capazes de trabalhar com quantidades de material biológico que é insuficiente para nem as técnicas em massa mais sensíveis funcionar. Um exemplo chave é o estudo dos tipos de células raras como circulantes de células de tumor (CTC) onde menos de 10 CTC pode estar presentes no sangue único 7,5 mL desenhar mesmo para pacientes com uma perspectiva de prognóstico pobre. 6 aqui apresentamos a metodologia necessária para realizar as medições de proteína de célula única usando um volume reduzido, ensaio baseado em anticorpos empregando gotículas de óleo-tampado impresso em um microarray do anticorpo.
Plataformas de gotículas microfluídicos são alto throughput, capaz de gerar milhares de gotas por segundo e capaz de isolar e até mesmo cultivo, células únicas em gotículas individuais para executar uma ampla gama de ensaios bioquímicos. Técnicas baseadas em gotículas são adequadas para a análise da única célula,7,8,9 com notáveis exemplos recentes incluindo DropSeq10 e inDrop11, que tem sido grandemente ajudado pelo poder de técnicas de amplificação. A quantidade limitada de material e não métodos de amplificação para proteínas tornam única célula proteomics especialmente desafiador.
As gotas podem ser analisadas por um número de métodos e microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizada. Técnicas de molécula como a microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total permite moléculas fluorescentes ser visualizado com incomparável relação sinal-ruído. 12 devido ao decaimento exponencial do campo evanescente, apenas fluorophores alta próximo à superfície (ordem de 100nm) são excitadas fazendo TIRF uma boa estratégia na detecção de pequenas quantidades de uma molécula-alvo em uma mistura complexa. A força de corte óptica inerente de TIRF também ajuda a evitar as etapas de lavagem e ensaio de limites de tempo e complexidade. No entanto, TIRF requer superfícies planas e exemplos de microscopia TIRF aplicado em gotículas no fluxo envolvem a formação de uma superfície plana, de que a imagem. 13 para este fim, técnicas de proteomic única célula frequentemente projetar chips microfluídicos em torno de agentes de superfície-imobilizado captura em um formato de microarray. 4 , 14
As gotas, eles mesmos, podem ser formadas em matrizes em superfícies planas, chamados gotículas microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotículas em matrizes permite-lhes ser convenientemente indexados, facilmente monitorados ao longo do tempo, individualmente abordados e, se necessário, obtida. Microarrays da gota pode alcançar uma elevada densidade de microreatores com milhares de elementos por chip que são free-standing ou suportadas por estruturas de microplacas. 18 , 19 , 20 eles podem ser formados pela deposição sequencial por robôs de manipulação de líquidos, observadores de jato de tinta, entre em contato com microarrayers21,22,23,24,25, 26 , ou eles podem montar auto em superfícies como superhydrophillic pontos estampados em uma superfície de superhydrophobic. 27 , 28 , 29
Com estas considerações em mente, endereçável Droplet Microarrays (ADMs) foram projetados para combinar a versatilidade, capacidade de endereçamento espacial e volumes reduzidos de microarrays da gota com a sensibilidade de microscopia TIRF única molécula para quantitativamente medir a abundância de proteínas. 5 ADMs permitem análise única célula formando um microarray de gotículas contendo células únicas sobre um microarray do anticorpo, que é então coberto com óleo para evitar a evaporação. Os volumes das gotas são discretos para evitar perda de amostra, que caso contrário seria alcançada em-microplaqueta válvulas em microfluídica de fluxo contínuo. 30 a quantidade absoluta de proteína do alvo de uma única célula é extremamente pequena; no entanto, o reduzido volume de gotas permite a concentração local relativamente alta a fim de que eles são detectados usando um sanduíche ensaio de anticorpo - anticorpo é imobilizada em uma região distinta, ou local, sobre uma superfície que capta a proteína, que por sua vez vincula para um anticorpo de detecção fluorescente etiquetado presente no volume da gota. Como uma rótulo abordagem livre (ou seja, proteínas alvos não precisa ser rotulado diretamente), ADMs são geralmente aplicável ao analisar células a partir de fontes primárias, tais como o sangue processado, bem preciso aspirados e biópsias de tumor dissociadas, bem como células de cultura e os lisados.
Medindo a variação em abundância de proteínas através de uma população celular é importante na determinação da heterogeneidade na resposta, por exemplo, para uma droga e vai ajudar no fornecimento de insight funções celulares e vias, avaliando subpopulações e seus comportamento, bem como identificar eventos raros que caso contrário poderia ser mascarados por métodos em massa. Este protocolo descreve como produzir e usar gota endereçável microarrays para determinar quantitativamente a abundância do fator de transcrição p53 em células cancerosas humanas e pode ser usado para investigar o papel de p53 em resposta a quimioterápicos. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos de captura e deteção e pode ser modificada para incluir mais ou diferentes destinos. As instruções são fornecidas para construir um aparato simples, incorporando um bocal concêntrico de consumíveis de laboratório geral de matriz manualmente 10 gotas de nL tampadas com óleo. O processo completo experimental é descrito por meio de que cada gota é então carregada com uma única célula, que é então lysed e a expressão da proteína, determinada com resolução única molécula usando microscopia TIRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação
-
Fazer fichas e Microarrays do anticorpo de impressão
- Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip.
Nota: Vários produtos químicos superficiais foram testados para sua adequação com gotículas endereçáveis. 5 superfície químicas podem precisar de ser otimizado para agentes de captura alternativos. Isoladores ADM estão disponíveis comercialmente, ou podem ser produzidas por acrílico de corte do laser (CAD para isolador usado neste trabalho é fornecido como um download de arquivo; consulte o Arquivo de código suplementar). - Ligue o microarrayer e definir a umidade de 75%.
Nota: umidade relativa reduz a evaporação da solução de impressão do pino de microarray e reduz a variação intra e inter spot. - Limpe o pino de microarray pino de limpeza solução por 5 min por ultrasonication. Enxaguar o pino com água ultra-pura usando uma garrafa de lavar e secar usando nitrogênio.
Nota: Suspenda o pino quanto apenas mergulhe a ponta do pino. Uma lâmina de microscópio com um conjunto adequadamente perfurado de furos ajudará se um titular de pin não pode ser obtido. - Fazer 5 mL de tampão de impressão composta de 3 × buffer de solução salina-citrato de sódio (SSC), betaína de 1,5 M, suplementada com 0.01% sulfato dodecyl de sódio (SDS). Armazenar a 4 ° C indefinidamente.
- Para preparar uma solução de impressão, descongelar o anticorpo anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit; Consulte a tabela de materiais) alíquotas armazenadas a-80 ° C. Mistura 1:1 com buffer de impressão para uma concentração final de 0,5 mg/mL. Carregar 5-10 µ l de solução de impressão em um 384-placa usando uma micropipeta e coloque o microarrayer.
- Fichas de carga montado na etapa 1.1.1 para o microarrayer. Programe o microarrayer para imprimir pontos em coordenadas definidas pelo centro de cada poço do isolador.
Nota: Microarrayers empregam uma variedade de, predominantemente, software proprietário e para que o leitor é encorajado a consultar a literatura pertinente. O microarray necessário para o isolador ADM destaque no arquivo CAD que acompanha na etapa 1.1.1 é composta por elementos retangulares; as distâncias relevantes são fornecidas. - Armazenar as fichas em recipientes hermeticamente fechados e embrulhe com papel alumínio. Armazenar a 4 ° C até 6 semanas.
Nota: A folha é para não danificar qualquer foto. Armazenamento a 4 ° C limita a taxa de degradação de biomoléculas e quaisquer reacções deletérias que podem agir para reduzir a atividade de microarray. Um recipiente hermético permite chips para equilibrar a temperatura ambiente antes do uso sem condensação formando na superfície do chip. Impressão de contato microarray explora a tensão superficial e a adesão entre a solução de impressão e o substrato de impressão para produzir spots. Pré-impressão ou mancha é normalmente exigido para remover o excesso solução do pino de microarray para produzir manchas de tamanhos uniforme. Não jogue fora a lamela de pre-impressão sacrifício desde que pode ser usada para avaliar a qualidade do lote.
- Anexe um isolador de silicone adesiva acrílica para uma lamela acrescida para apoiar um microarray do anticorpo. Isto é referido como o chip.
-
Preparar as seringas, tubos e concêntrico bocal para dosear o endereçáveis gotículas
- Desmontar a 100 µ l (para a gota aquosa) e 1 mL (para o óleo tampando) Hamilton seringas de vidro e enxagúe as peças com água destilada H2O.
- Alimentar um comprimento de 100 mm de 150 µm ID/360 µm OD fundido tubo de sílica através de um comprimento de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 "tubo OD PFA até que sobressaia por 2 mm. Isto irá formar o bocal concêntrico.
- Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato para o fim de uma ponta de pipeta de 10 µ l e insira a peça de 40 mm de 1,0 mm ID/1/16 "tubo OD PFA. Se necessário, reposicione o tubo de sílica fundida para manter uma protrusão de 2mm no bico antes dos conjuntos de adesivo.
- Insira a outra extremidade da capilar de sílica fundida na extremidade de um comprimento de 200 mm de 0,014" ID/0,062" OD tubo de PTFE e ligar isto a um 100 µ l Hamilton seringa cheia com 4% de albumina de soro bovino (BSA) em tampão fosfato salino (PBS) (PBSA).
Nota: Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica pode vincular a superfícies e podem ser perdidos ou desnaturados. BSA é usado para 'Bloquear' superfícies para minimizar inespecificas vinculando sacrificialmente para essas superfícies. - Inserir um comprimento de 400 mm do tubo de FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm em uma ponta da pipeta 200 µ l até formar um selo. Aplique uma camada fina de cola de cianoacrilato para a outra ponta da pipeta 200 µ l e empurrar isso para a primeira dica para fixar o tubo no lugar. Conecte a extremidade aberta do tubo de FEP OD 1,0 mm ID/2.0 mm para um 1 mL seringa Hamilton preenchida com óleo mineral.
- Insira a ponta de pipeta 10 µ l do bocal concêntrico Assembleia 200 µ l pipeta ponta. Coloque as seringas em bombas de seringa separada como eles terão de ser operados de forma independente.
- Encha a seringa de 100 µ l com uma solução de bloqueio de PBSA 4%. Reconecte e irrigue o tubo 'aquoso' com a solução de bloqueio. Repita duas vezes para um total de 3 flushes.
- Encha a seringa de 100 µ l com 0,125 µ g mL-1 anticorpo da deteção (anticorpo anti-p53 (DO-1) rotulado com Alexa 488) em 4% PBSA e volte a colocar a tubulação. Substituir a solução de bloqueio na tubulação por 25 aplicadora solução de anticorpo de deteção µ l.
- Irrigue o tubo de 'petróleo' com óleo mineral até toda a tubulação e o bocal enche de óleo. Encher a seringa de 1 mL com óleo mineral e re-anexar o tubo. Fixe o conjunto de tubulação e o bocal de um manipulador XYZ.
-
Preparar microinjector e micromanipulador
Nota: Passos abaixo fazem referência específica aos componentes dos aparelhos de micromanipulador especificados na tabela de materiais e microinjector, mas são geralmente aplicáveis a qualquer desses aparelhos.- Monte o microinjector, anexando o tubo de pressão e o titular capilar.
- Lentamente, gire o dial de pistão até o óleo mineral preenche completamente a linha.
- Monte o titular capilar para a montagem de cabeça de tradução.
- Corrigi o capilar no suporte do capilar com a cabeça de aperto.
- Pipetar uma solução de 4% PBSA em um dos poços do isolador.
- Definição da palavra usando o micromanipulador e mergulhe a ponta do capilar para a solução.
- Encha lentamente o capilar com 4% PBSA e deixar de bloquear por 10 min.
- Ejete a conta e incline o módulo de tradução para que o assembly é claro do chip.
2. formar gotículas endereçáveis e carga com células únicas
- Forma de gotículas endereçáveis
- Fixe o chip no palco microscópio.
Nota: O microscópio é uma fluorescência invertido microscópio automatizado capaz de única molécula TIRF equipado com uma fase XY codificada e um elétron multiplicando a câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD) EM-. - Grave as coordenadas de palco do microscópio de cada ponto na matriz usando o software de controle automatizado de microscópio.
- Defina o manipulador XYZ no palco microscópio. Coloque o bico em um ângulo de 50-60°. Certifique-se de que o bocal tem comprimento suficiente e autorização para alcançar o chip. Conjunto o 'aquosa' e 'petróleo' seringa bombas para dispensar 10 nL em 100 µ l/min e 5 µ l em 100 µ l/min, respectivamente.
Nota: Durante a preparação, a solução aquosa à frente do bocal pode secar. - Dispense a solução aquosa até que uma gota de líquido é visível à frente do bocal. Pincele com uma limpeza livre de poeira para removê-lo.
Nota: Dependendo do número de condições sob investigação, reserve um número de poços para servir como reservatórios para as células. Para um única célula linha/tipo basta um único reservatório. - Usando o software de controle automatizado de microscópio, defina as coordenadas de palco de microscópio para um local de anticorpo na matriz e foco na superfície da lamela.
- Cuidado para não perturbar o local, usando o manipulador XYZ, alinhe a ponta capilar de vidro do bocal para o lado do anticorpo ponto concêntrico e dispensar 10 nL de solução aquosa. Sem mover os estágios, dispense 5 µ l de óleo para tampar a solução aquosa. Lentamente, levantar o bocal claro de gota e mover para o próximo bem.
- Repita a etapa 2.1.6 para todos os pontos de anticorpo na matriz.
- Após 30 min, todos os pontos na matriz usando o software de controle automatizado de microscópio para determinar o plano de fundo de moléculas simples vinculado a cada anticorpo local antes de carregar as células da imagem.
- Fixe o chip no palco microscópio.
- Endereçáveis gotas com células de carga
- Remover os frascos de cultura de células de incubadora e separar as células usando a solução de tripsina/EDTA.
Nota: Neste estudo, a BE humana cólon carcinoma celular linha foi usada e cultivadas usando modificado águias médio (DMEM de Dulbecco) suplementado com 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) numa incubadora de CO2 . - Se necessário, mancha fluorescente de células.
- Ressuspender as células em uma solução de anticorpo de detecção 0.125 μg/mL (anticorpo anti-p53 (DO-1) rotulado com Alexa 488) em 10% FBS na mídia L-15. Para garantir uma suspensão de célula única, filtre a solução da célula através de um filtro de célula de arremesso de 40 µm.
- Contar as células usando um hemocytometer e diluir ou concentrar a solução de célula para uma concentração de 25-400 × 103 células/mL. Isso garante que sedimentos de células com espaçamento suficiente para manipular confortavelmente a conta.
- Carrega células únicas em gotículas endereçáveis do reservatório de célula usando o micromanipulador e a conta.
Nota: As células não-aderentes podem ser carregadas em massa para a micropipeta e dispensado um por um em gotas endereçáveis. Apesar do tratamento de superfície de bloqueio, linhas de células aderentes tendem a não especìfica furar a parede interna vidro conta e perder-se. - Usando um objectivo × 10 para observar, use o microinjector para aspirar a uma única célula para a conta do reservatório de célula.
- Armazenar as coordenadas do palco micromanipulador se usando uma fase manipulador eletrônico ou manualmente, observe a posição de z.
- Retrai a micropipeta, traduzindo-o para cima para limpar a altura de 1 mm do chip. Fazer isso manualmente com um joystick ou automaticamente usando o recurso de 'Eject' do palco manipulador eletrônico.
- Conjunto que o palco coordenadas para que de uma gotícula endereçável o uso automatizado de software de controle de microscópio. 'Injete' a micropipeta por devolvê-lo para a posição de z armazenada (ou notável). Fazer isso manualmente com um joystick ou automaticamente se usando uma fase manipulador eletrônico.
Nota: A conta irá perfurar o óleo tampando e situar-se dentro a parte aquosa da gota endereçável. - Dispense a célula no endereçável droplet usando o microinjector. O volume de uma gota de endereçável 10 nL aumentará em menos de 1%.
- Repita o 2.2.5-2.2.9 para as restantes gotas endereçáveis deixando alguns livres para o controle experimental onde endereçáveis gotas não contém uma célula.
Nota: Uma alternativa mais simples para carregar células únicas em gotículas endereçáveis usando uma conta e micromanipulador é substituir a solução na etapa 1.2.8 com uma solução de anticorpo de detecção em 4% contendo as células PBSA numa concentração da ordem de 10 5 células/mL, equivalente a 1 célula/10 nL. Ocupação única célula será Poissonian e a concentração da célula precisa ser otimizado.
- Remover os frascos de cultura de células de incubadora e separar as células usando a solução de tripsina/EDTA.
- Lisar células e matriz de imagem
- Células de imagem em gotículas usando microscopia brightfield, incluindo quaisquer imagens de fluorescência.
Nota: Imagem leva cerca de 3 min para ~ 100 gotas usando um microscópio automatizado de imagem. Executar a imagem com um at 60 = 1.49 objectivo de imersão de óleo. Sem filtros são requeridos para brightfield imagem Considerando que conjuntos de filtro padrão são usados para a imagem latente de fluorescência. - Imagem de todos os pontos na matriz usando microscopia de TIRF única molécula.
Nota: As configurações são usadas como no passo 2.3.1 com um especializados TIRF filtrar o conjunto. Essas imagens serão posteriormente analisadas na seção 3 para determinar o plano de fundo de moléculas simples ligado a cada ponto de anticorpo antes da lise. Imagem de molécula usando microscopia de fluorescência (TIRF) de reflexão interna total leva cerca de 5 min de ~ 100 pontos de imagem. - Concentre-se em uma célula em uma gota endereçável. Alcançar a completa lise óptica centrando-se um único 6 ns do laser de pulso (comprimento de onda de 1064 nm, pulso energias 14,1 ± 0,3 µ j por impulso) perto do local da célula.
Nota: O pulso de laser configura uma bolha de cavitação em expansão que tesouras da célula e libera constituintes celulares dentro do volume da gota. 4 , 31 os processos mecânicos devido a Lise induzida por laser não perturbe a interface óleo-água em energias de pulso baixo. Lise óptica normalmente demora aproximadamente 20-30 min para lyse 100 células. Conforme discutido na seção de discussão, há um número de métodos alternativos para lisar células únicas se lise óptico instalação não é possível. - Repita para todas as gotículas endereçáveis que contém a célula, deixando 5 grátis para o controle experimental onde endereçáveis gotículas contêm um un-lisados celulares.
- Observe o tempo em que cada célula é lysed.
Nota: Estes tempos serão usados para corrigir as curvas de vinculação individual para cada ponto na etapa 3.1.9. Muitas vezes é suficiente para observar os momentos em que as células primeiras e últimas lysed e estimam o resto assumindo uma vez adequadamente consistente entre os eventos de Lise. - Adquira imagens de molécula usando microscopia TIRF de todos os pontos de cada 10 min para o primeiro 30 min depois a cada 20 min para um mais 60 min. Se apenas interessado na quantidade de proteína vinculada no estado de equilíbrio, imagem todos os pontos depois de incubarem o chip para 90 min à temperatura ambiente.
Nota: O tempo para atingir o equilíbrio dependerá do volume da gota e as afinidades dos anticorpos usados no ensaio. Microscopia TIRF é executada usando uma fonte de excitação do laser no = 488 nm e 1.5 mW de potência medida na abertura traseira usando um medidor de potência óptica. Única molécula imagens são adquiridas, definindo as configurações de aquisição da câmera do EM-CCD para 900 ms tempo de aquisição, digitalização de 16 bits, a taxa de leitura de 1 MHz e EM um ganho de fator de 10. O isolador pode ser reutilizado, removendo cuidadosamente a lamela.
- Células de imagem em gotículas usando microscopia brightfield, incluindo quaisquer imagens de fluorescência.
3. análise de dados
-
Única molécula contando (regime de não-congestionado/digital)
- Usando Fiji (ou Matlab), para qualquer local de anticorpo não-congestionado, carrega a imagem adquirida antes de lise (fundo, BKD).
Nota: As operações nas etapas a seguir direta são executadas usando software de análise de imagem de Fiji. Um guia de usuário pode ser encontrado no seguinte link https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html. - Em Fiji, selecione a imagem BKD. Sob o menu "Imagem", selecione "Duplicado" para BKD duplicado. Selecione a imagem duplicada e sob o "processo > filtros", selecione "Gaussian Blur" e especificar um raio de 50 pixels.
- Achate a imagem BKD para que haja uma distribuição uniforme de intensidade efetiva da fonte de luz de excitação, dividindo a imagem BKD pela imagem borrada BKD, produzindo BKD_FLAT.
- Sob o "Processo", selecione "imagem calculadora...", especificando a operação "Fosso", as imagens necessárias e selecionando as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
- Subtrair de cada pixel na imagem por 1 ("processo > matemática", selecione "Subtrair..." e especifique um valor de 1). A intensidade média do pixel deve ser 0.
Nota: Campo achatamento e imagens de fundo achatado, podem ser controladas facilmente desde que a soma de todos os pixels deve ser 0 e qualquer deslocamento restante pode ser compensado mais direta. - Selecione uma área de pixel pixel de 50 × 50 em qualquer um dos 4 cantos da imagem BKD_FLAT. Medir o desvio de padrão de intensidade do pixel (σ), selecionando "Analisar" e "Medida".
Nota: As estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados. Isto determina o fundo do local onde há pouco provável que seja uma alta densidade de moléculas simples. A área a ser medida pode ser seleccionada manualmente usando as ferramentas de seleção de menu padrão ou executando a macro código "makeRectangle (x, y, largura, altura)"; Isso cria uma seleção retangular, onde x e y argumentos são as coordenadas (em pixels) do canto superior esquerdo. - Definir o limite de imagem para 3σ e criar uma imagem binária SM_MASK.
- Em "Imagem > ajustar", selecione "Limiar..." e defina o nível de limiar inferior de 3σ.
Nota: Pixels cujo valor está abaixo do limiar são definidas como zero e pixels exceder o limite são definidos como 1. O limite irá determinar a confiança com que thresholded pixéis pertencem a uma única molécula.
- Em "Imagem > ajustar", selecione "Limiar..." e defina o nível de limiar inferior de 3σ.
- Na imagem segmentada SM_MASK, pixel conjunto valores de intensidade para zero de quaisquer objetos que não têm um tamanho de pixel de 4-92 e uma circularidade de 0,5 - 1, selecionando "Analisar" seguido de "Analisar partículas" e especificando o tamanho e a forma circular.
Nota: O tamanho do pixel pode precisar de ser otimizado para outro conjunto de fluorophores e microscópio altos. Devido ao tipo de ruído da câmera única pixels podem ser acima desse limite e não ser descartadas apesar de não serem moléculas simples. O critério de tamanho de pixel corretamente irá descartar esses pixels. Moléculas simples são geralmente circulares em forma. Um valor de circularidade de 1 indica um círculo perfeito, enquanto um valor aproximando 0 indica uma forma cada vez mais alongada. Os objetos restantes são moléculas simples e podem ser contados. Uma máscara pode ser definida para demarcar a área da mancha para discriminar no local e fora local conta por quadro. Isso é mais fácil para quadros adquiridos posteriormente quando há um sinal suficiente no local, que pode então ser aplicado aos quadros anteriores. - Para o mesmo lugar de anticorpo não-congestionada, carregar e repita etapas 3.1.1 - 3.1.7 para todos os quadros de imagem capturaram como uma série de tempo-resolvido adquiriu post Lise. Use os tempos de Lise anotados no passo 2.3.5. para corrigir as curvas de ligação.
- Usando Fiji (ou Matlab), para qualquer local de anticorpo não-congestionado, carrega a imagem adquirida antes de lise (fundo, BKD).
-
Única molécula contando (regime de congestionado/analógico)
- Para calcular a intensidade média de uma única molécula, antes de prosseguir, repita as etapas 3.1.1 - 3.1.8.
- Multiplica as imagens BKD_FLAT e SM_MASK para produzir uma imagem no qual valores de pixel não-zero estão associados a moléculas simples.
- Para realizar isto, sob o menu "Processo", selecione "Calculadora de imagem...", especifique a operação "Multiplicar" e as imagens necessárias e marque as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
- Soma todos os valores de intensidade de pixel, selecionando "Analisar" e, em seguida, "Medida"; as estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados. Divida pelo número de moléculas simples contados conforme passo 3.1.8 para calcular a intensidade média por molécula.
- Para qualquer ponto de anticorpo congestionado, carregar a pós-lise imagem adquirida e alise com uma imagem de fundo desfocado conforme as etapas 3.1.2 e 3.1.3.
- Subtrair de cada pixel na imagem achatada por 1 ("processo > matemática", selecione "Subtrair..." e especifique um valor de 1)
- Selecione uma área de pixel pixel de 50 × 50 em qualquer um dos 4 cantos da imagem e medir o desvio de padrão de intensidade do pixel (σ). Consulte a etapa 3.1.5 para obter detalhes.
- Criar uma máscara de imagem binária, definindo o limite da imagem para 3σ e definir valores de intensidade do pixel a zero de qualquer objetos com um tamanho inferior a 4 pixel2. Para realizar isto, sob o menu de "Analisar", selecione "Analisar partículas" e especifique o tamanho e a forma circular.
- Multiplique a imagem local achatada anticorpo congestionada pela máscara de imagem binária.
- Para realizar isto, sob o menu "Processo", selecione "Calculadora de imagem...", especifique a operação "Multiplicar" e as imagens necessárias e marque as caixas "Criar nova janela" e "resultado de 32-bit (flutuar)."
- Soma das intensidades pixel restantes selecionando "Analisar" seguido por "Medida"; as estatísticas de resumo da seleção serão apresentadas em uma janela de resultados.
- Divida a soma das intensidades de pixel pela intensidade média única molécula para calcular o número de moléculas único limite para o sitio congestionado.
-
Curva de calibração para quantificação absoluta
- Repita os pontos 1 e 2 para formar 10 gotas endereçável de nL com o anticorpo da deteção em solução a 4% PBSA cravada com uma proteína recombinante de concentração conhecida.
- Realizar uma série de concentração de 102- 107 proteínas recombinantes por gotículas, variando a concentração conhecida de proteína recombinante adicionada à solução. É recomendável trabalhar em termos de número de proteínas por gotículas tornar calibração única célula de dados simples.
- Use a série de concentração dados na etapa 3.3.2 para calibrar qualquer molécula conta por local de abundância de proteína por gotículas e pela abundância de proteína de extensão por uma única célula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O número de cópia absoluta proteína basal de p53 foi determinado com resolução única célula em uma linhagem de células de câncer de cólon humano, células BE. Demonstramos como expressão de p53 pode variar ao longo de várias ordens de grandeza e mostrar uma correlação positiva fraca entre número de cópia tamanho e proteína celular dentro da população de célula BE descanso.
Endereçável Droplet Microarrays formam-se quando gotículas aquosas são dispensadas nas localizações de ponto de anticorpo e tampadas com óleo. Aqui, as gotas de apoiar um ensaio da proteína p53 sensível. As lamelas são dispostas com manchas de anticorpos de captura usando um contato microarrayer e um pin. O anti-p53 captura anticorpo é retirado de um kit de teste de ELISA comercial. As condições de impressão eram tais que captura pontos eram aproximadamente 100 µm de diâmetro, com uma capacidade máxima de captura de 6,2 ± 0,5 x 105 proteínas por ponto. 32
O uso de um isolador ligada a lamela permite uma maior densidade de gotas a ser formada desde que limita a propagação do óleo para pontos de captura de anticorpos nas proximidades. Em cada poço do isolador gotículas são formadas pelo fornecimento de uma solução aquosa, que é então coberta com óleo para evitar a evaporação (figura 1A). Uma quantidade mínima de óleo pode ser dispensada para coroar a gota; no entanto, é útil dispensar uma quantidade que preenche cada isolador bem exatamente tal que a superfície do óleo é plana para a imagem latente. Isoladores são comercialmente originária ou feitas por folhas acrílicas do corte do laser. Isoladores de silicone são poços pré-cortada disponíveis em uma matriz de 4 x 6 (n = 24) mas pode ser modificado para uma matriz de 4 x 11 (n = 44) usando um perfurador de couro biópsia ou multi-furo. O laser cut isolador na figura 1B mostra uma matriz de 100 poços hexagonais com um diâmetro máximo de 2,89 mm, uma separação do centro-à-centro de 3,9 mm e uma altura de 0,5 mm. As gotas podem ser armazenadas e permanecem estáveis por longos períodos de tempo (observado até 3 meses).
As gotas são criadas manualmente, usando um aparelho construídos em casa, o que traduz um bocal de tubos concêntricos (Figura 1), que é conectado a duas bombas de seringa (figura 1A). O bico do tubo concêntrico é composto por uma capilar de sílica fundida que dispensa a fase aquosa, alimentada através de um curto comprimento de tubulação de PEEK, que dispensa a fase de óleo. Usando um microscópio, o bocal está alinhado para um local de anticorpos e as bombas primeiro dispensaria a solução aquosa, imediatamente seguida pelo óleo (Figura 1E, as etapas 1-4). Uma vez que todas as gotas na ADM são formadas, um microinjector e micromanipulador (consulte a tabela de materiais) são usados para carregar cada gota com uma única célula (Figura 1). A micropipeta capturasse uma célula de um reservatório de células, dispensado em um dos poços no chip, ser traduzida para uma gota bem e então penetra a tampa de óleo para entregar o celular para a gota aquosa (Figura 1, as etapas de 5-8).
Todos os pontos dentro das gotas são fotografados antes da lise e serão usados para determinar o grau de ligação não-específica para as manchas (Figura 2A). Células únicas totalmente lysed (incluindo núcleo) usando métodos ópticos. 31 óptica lise baseia-se na força de cisalhamento de uma bolha de cavitação induzida por pulso de laser em expansão para romper as células. Cuidados devem ser feitos que a interface óleo-água não ser perturbado por estes processos limitando as energias de pulso e depositar células longe da interface óleo/água. Uma vez que as células lysed, a matriz é fotografada por microscopia TIRF usando um microscópio automatizado; quadros são adquiridos a cada 10 min para 30 min e depois a cada 20 min para um mais 60 min. As condições, tais como a afinidade do anticorpo, difusão de proteína e volume de gotículas, são tais que a vinculação de equilíbrio é alcançado dentro da aquisição de 90 min. Um pulldown unicelulares típico é mostrado na Figura 2A.
O processo de análise de imagem para determinar que a molécula conta é representado esquematicamente na Figura 2B. Imagens dos pontos são também consideradas não-congestionadas, onde a concentração de proteína alvo é tal que moléculas simples são bem separadas e distingue-se facilmente ou congestionadas, onde a concentração de proteína alvo é maior e única molécula imagens sobreposição e são já não individualmente distinguível. Uma vez que o perfil de excitação TIRF é desigual, é crucial que todos adquiriram imagens ser plana-campo corrigido. Gaussian blur é aplicado a um quadro não-congestionada, que atua como um filtro de suavização para remover detalhes e ruído e produzir uma imagem com o perfil médio do perfil TIRF excitação. Esta imagem processada pode ser usada para 'achatar' a imagem original. Para imagens não-congestionado, onde, mesmo no estado de equilíbrio, existem poucas moléculas simples, um quadro pode ser processado para corrigir-se. Esta abordagem não é aplicável a um lugar congestionado, onde moléculas simples densamente ocupam o ponto e requer uma imagem de fundo para serem adquiridos para nivelamento. Quadros achatados são então thresholded para pixels com intensidades de pelo menos 3 vezes o desvio padrão de fundo além de seu valor médio. Moléculas simples então são detectadas automaticamente, identificando pixels em cluster de 4-9 com circularidade maior que 0,5, usando os recursos de análise de partículas de Fiji. Partir dos resultados, pode ser calculada a média intensidade de uma única molécula. Ele é usado para determinar o número de moléculas simples em um lugar congestionado, dividindo a intensidade total local de anticorpos pela intensidade média conhecida de uma única molécula. Estas etapas podem ser automatizadas usando o editor de scripts de Fiji.
Uma série de concentração é realizada para determinar a contagem única molécula no estado de equilíbrio nas gotas com concentrações conhecidas de proteína p53 recombinante (Figura 3A). As condições são tais que as manchas de anticorpo captura capturar uma fração da proteína alvo total, cerca de 1% na região de linearidade (para 105-108 proteínas por gotículas R2 = 0,99). O nível de ligação não-específica nas gotas é 187 ± 60 moléculas. Os resultados dos pulldowns a única célula podem ser convertidos para alcançar uma distribuição do número de cópia absoluta da proteína por célula. Figura 3B mostra a distribuição da expressão da proteína p53 absoluto em únicas pilhas BE usando ADMs. Expressão da proteína p53 nas células BE, que pode ser considerado geneticamente idênticos ou muito semelhantes, é um processo estocástico. A distribuição é como Gamma - assimétrica e unimodal com uma longa cauda. Consequentemente, a média (1,82 × 106 proteínas) pode superestimar a abundância de proteína modal (bin 0 - 5,0 × 105 proteínas), e o desvio-padrão (1,88 × 106 proteínas) totalmente não captura as características da distribuição. Esta distribuição é um exemplo da importância das medições de célula única para capturar a heterogeneidade da expressão da proteína da população celular, que caso contrário seria perdida quando em média com medições em massa. Parâmetros adicionais para cada célula podem ser medidos. Aqui, estima-se o volume da célula, medindo cada diâmetro da célula antes da lise em gota e supondo que a célula é aproximadamente esférica. A Figura 3 mostra uma comparação do número de cópia absoluta da proteína p53 em células únicas BE em função do tamanho da célula. Há uma tendência para células maiores de ter um maior número de cópia total p53. Curiosamente, é possível a partir da distribuição que não há coordenação entre a expressão de p53 e tamanho da célula, já que parece haver um número de cópia de p53 mínimo por célula; no entanto, os mecanismos pelos quais isso surge requer mais investigação.
Figura 1: endereçável Droplet microarray do aparelho e Chip. (um) gotículas são dispensadas manualmente, usando um manipulador de 3 eixos para traduzir um bocal de tubos concêntricos. O droplet aquoso é dispensado em locais específicos em um microarray do anticorpo seguido por tampando o óleo. (b) o isolador permite uma maior densidade de gotas endereçáveis no substrato, limitando a propagação do óleo. Isoladores podem ser produzidas por laser corte 0.5 mm acrílico folhas. Para auxiliar a visualização de gotas, azuis corante corante alimentar é depositado usando o aparelho em um). Escala barra 10mm, inserir escala bar 1 mm. (c) o bico do tubo concêntrico permite gotículas endereçáveis ser formado, montado como na etapa 1.2 do protocolo. (d) um microinjector e micromanipulador são usadas para isolar as células em gotículas endereçáveis individuais, preparadas como na etapa 1.3 do protocolo. (e) as principais etapas no processo de criação e carregando gotículas endereçáveis é mostrado. Um lugar de anticorpo está localizado usando um estágio da tradução codificado (1) onde a ponta do tubo capilar está alinhada (2) e os componentes aquosos (3) em seguida, óleo (4) são dispensados. Células única podem ser carregadas usando uma conta de vidro (5-8), que pode tratar a gota aquosa (7) repetidamente e depositar uma célula (8). Escala de barras 100 µm. A seta vermelha em (5) e (8) destaca a única célula isolada e o baixo-relevo de (8) mostra a única célula isolada em alta ampliação (escala bar 10 µm). Porções desta figura foi modificado da referência12, reproduzido com a permissão da The Royal Society of Chemistry. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas de análise de imagem. Cada ponto na matriz periodicamente é fotografado por microscopia TIRF até atingir equilíbrio (tEq) (90 min para ensaio de p53). O tempo de equilíbrio depende de t em solução, bem como as afinidades de par dos anticorpos para a proteína alvo. a) molécula TIRF microscopia imagens de exemplo de plano de fundo, bem como uma única célula de exemplo pulldown (escala bares 20 μm). Inserir imagem mostra uma parte ampliada da imagem de fundo com algumas moléculas única destacadas por setas vermelhas (escala bar 5 μm). b) estrutura de tópicos de análise de imagem detalhada na etapa 3 do protocolo. Resumidamente, existem dois regimes de amplos onde as manchas podem ser consideradas moléculas não-congestionada, única são escassos e congestionadas, onde a densidade de moléculas simples é tal que existe uma sobreposição significativa e pode já não ser individualmente identificáveis. Um passo crucial na análise da imagem é campo achatamento para remover o efeito do perfil não-uniforme de intensidade do laser da excitação. No regime de contagem digital, moléculas simples são identificadas diretamente, com base em seus parâmetros de intensidade e forma. O análogo contando o regime, o número de moléculas simples é calculado medindo a intensidade total local no equilíbrio e dividindo pela intensidade média de uma única molécula, que é conhecida a partir do regime de contagem digital. Etapas podem ser automatizadas direta no ImageJ para analisar os dados. A sequência de painel de fundo de imagens mostra acúmulo de proteína alvo na captura anticorpo local; Inicialmente, não são pontos congestionados (t1) Considerando que, como a proteína do alvo se acumula no local anticorpo, as moléculas simples podem tornar-se cada vez mais congestionado (tn) até o equilíbrio é atingido (teq). Note que se uma mancha permanece não-congestionada ou torna-se congestionada depende de uma série de factores, nomeadamente a abundância de proteína do alvo do volume de análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: único dados célula. Quantificação absoluta é conseguida usando uma curva de calibração. contagens (uma) única molécula são feitas usando concentrações conhecidas de proteínas recombinantes. Esta é uma curva de calibração e é usada para converter a molécula contabilizada em cada ponto número de proteínas do alvo do volume de análise e, portanto, único número de cópia de célula. A linha tracejada vermelha horizontal indica o nível de ligação não-específica de 187 ± 60 moléculas. As barras de erro são um desvio padrão da média de 3 experimental é executado. A linha tracejada representa 100% de detecção de proteína. (b), uma distribuição do p53 basal da célula única expressão de proteínas nas células de câncer BE é mostrado mostrando uma distribuição gama-como-de-cauda-comprida, onde a expressão da proteína p53 em algumas células é significativamente maior do que o valor modal. (c) Scatter plot do número de cópia de proteína p53 por célula em função do volume de celular mostrando como a expressão da proteína varia em função do tamanho da célula. Porções desta figura foram modificadas de 12 e reproduzidas com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endereçáveis da gota de Microarrays são um método sensível e extensível para determinar quantitativamente o número absoluto de cópia da proteína dentro de uma única célula.
Limitar o nível de ligação não-específica (NSB) é fundamental no âmbito do protocolo para alcançar tão baixo limite de detecção como possível. Proteínas e outras espécies bioquímicas não especìfica podem ligar para um número de interfaces presentes dentro das gotas — a superfície de lamela, o anticorpo local e interface óleo/água. As proteínas podem ser perdidas por particionamento para a interface ou o óleo em si. Mostramos que 4% de BSA presente no droplet aquoso é capaz de limitar NSB de proteínas usando os anticorpos especificados no protocolo. Alvos de proteína alternativa e os anticorpos usados para detectá-los podem exigir abordagens alternativas de bloqueio, tais detergentes não-iônicos ou surfactantes compatíveis. Fluorados óleos também podem ser testados para sua adequação em servir como o óleo de enchimento. Em tais casos, devem ser feitas considerações adicionais, tais como a concentração crítica micelle e a densidade do óleo tampando.
Não lavado impressão buffer, que permanece em cada local local após põr aids no alinhamento. Quando inicialmente depositar as gotas, deve ter cuidado para não riscar ou danificar o local de anticorpos pela ponta do bico de tubos concêntricos. Ao desenvolver o método ainda mais, uma tintura fluorescente pode ser dopada para o buffer de impressão de anticorpo que torna-se imobilizada além do anticorpo de captura. Isto permitiria para lavagem e bloqueio de etapas a serem executadas antes de põr da gota; no entanto, tal medida não necessariamente seria necessária se usando métodos automatizados de gotículas que põr tais como métodos de impressão jato de tinta.
A superfície das lamelas comercialmente de origem sobre a qual formam-se gotículas é revestida com um polímero hidrofílico e as gotas aquosas produzido sobre eles, com um volume de 10 nL tem um diâmetro de ± 751 42 mm. Há um limite para quanto a gota depositada deve molhar a superfície ou se espalha devido ao peso do óleo tampando desde abaixo uma espessura mínima há aumentado dispersão óptica do laser TIRF excitação. A dispersão aumenta o nível médio de fundo e pode abafar sinal ao detectar moléculas simples. O lugar de anticorpo também deve ser localizado longe da borda da gota, desde que a luz de laser de excitação pode parcialmente ou totalmente strike uma área fora da gota aquosa. A condição de ângulo crítico já não resultará para golpear a interface vidro-óleo em oposição a interface de vidro-água de luz.
Para determinar quantitativamente a abundância de proteína, o número de moléculas simples, ligado a um ponto que deve ser determinado através de análise de imagem. Para determinar o total, quantidade de proteína em solução da contagem única molécula uma curva de calibração é necessária e permite que a técnica para ser absolutamente quantitativa.
Para minimizar o fotobranqueamento, manchas não são fotografadas continuamente e o poder da fonte do laser TIRF excitação é minimizado. O protocolo apresentado tem sido usado com sucesso para fotoestável fluorophores tais como o Alexa Fluor corantes. Fluorophores alternativo pode ser usado mas fotobranqueamento deve ser avaliado e o protocolo de imagem adaptado se necessário. O número total de moléculas simples por quadro pode ser plotado contra o tempo para reproduzir a curva de ligação, embora isso não seja necessário que se cinética de ligação não é procurados e da imagem latente um único quadro em equilíbrio será suficiente.
Embora não haja uma exigência de dois anticorpos de alta afinidade, isso resulta em um ensaio altamente sensível e altamente específico, crucial para medições no nível da célula única. Os anticorpos p53 utilizados neste protocolo são bem otimizados na detecção de p53 livre de células únicas. A proteína alvo é determinada pela escolha dos anticorpos e pode ser modificada em um número de maneiras: 1, ambos os anticorpos de captura e deteção podem ser substituídos para vincular destinos alternativos; 2, o anticorpo da deteção pode ser substituído para sondar interações da proteína-proteína ou modificações borne-translational à proteína ligada ao anticorpo captura, por exemplo, determinar o status de fosforilação de p53 capturados; 3, multiplexados ensaios podem ser atingidos através de múltiplas manchas de anticorpos de captura nas proximidades de impressão — impressão um 3 × 3 matriz local é possível dentro de gotículas de 10nL. Claro, para qualquer alteração da proteína alvo um número de telas de anticorpo, controles e otimizações devem ser efectuadas.
Registaram-se vários métodos para a lise de células únicas. 33 óptica lise é uma abordagem livre de produtos químicos para rapidamente lyse pilhas individuais sem alterar o conteúdo das células e manutenção da integridade das proteínas e seus complexos. Lise química usando detergentes coloca um problema para a integridade de gotas quando usando óleo mineral e pode interferir com as interações entre as moléculas. 34 no entanto, para os ensaios onde lise química é compatível é abordagem atraente já que não é dependente de equipamentos, tais como lasers ou eletrodos de micropatterned. 35
As gotas de mostram desempenho comparável com métodos alternativos de célula única. Na atual geração de gotículas usando os anticorpos p53 sugerido, o nível de NSB é 187 ± 60 moléculas por ponto. As contagens de molécula apresentam forte linearidade (R2 = 0,99) na região, abrangendo 105 –108 p53 recombinante proteínas por gotículas. Isto sugere que, enquanto níveis mais baixos de proteína podem ser detectados nas células, existe um limite de quantificação de 10 proteínas p53 de5 ; Isso corresponde a uma única molécula de contagem sobre as manchas de 901 ± 83. Isto é predominantemente limitado pelo volume das gotas e adsorção à interface. O desempenho do ensaio do p53 é tal que quando executada em um 10 nL volume único 1,1 ± 0,2% da proteína total do alvo é capturada de solução; Isto aumenta a 85 ± 9% quando reduzindo o volume de análise para 0,2 nL. 36 , reduzindo o volume de gotas para abaixo 1nL e reduzindo a adsorção, há potencial usando os especificado anticorpos p53 em melhorar o limite de detecção para < 50 proteínas por célula. Portanto, gotículas endereçáveis têm o potencial para ser usado para medir proteínas muito baixa abundância de células únicas.
O endereçamento das gotas oferecidas pela tampa do óleo facilmente penetrável permite que o volume de análise de célula para ser desafiado sequencialmente. O uso de uma micropipeta permite a injeção de um número desejado de células em cada gota em um plugue de 10-20 pL, que não aumenta significativamente o volume. Para o chip, mostrado na figura 1B com 100 poços formar gotículas e carregá-los com células únicas normalmente leva 75-90 min. células de carga também pode ser alcançado, abordando o droplet usando o bocal em vez da micropipeta de tubos concêntricos ou usando um solução contendo células quando inicialmente formando as gotículas. Este último seria útil em limitar o número de etapas no protocolo, mas, em ambos os casos, a ocupação por gotículas seguiriam uma distribuição Poissonian. Isso limitaria a proporção de dados única célula por chip; no entanto, as gotas com zero ou várias células serviria como controles. Uma limitação adicional usando o bocal concêntrico de gotículas de endereço é que o volume da gota aumentaria em incrementos de 10nL. Com as modificações sugeridas acima disto poderiam ser melhoradas. Em-microplaqueta gota microfluídica é capazes de produzir gotículas em alta frequência e têm potencial em automaticamente sendo combinados com ADMs para produzir e manipular as gotas e sequencialmente depositá-los em uma matriz de planar. Isto certamente iria superar as limitações da produção de ADMs permitindo também leitura única molécula de gotículas.
A capacidade de lidar com cada gota individual tem uma gama de utilizações possíveis. Nós demonstramos a capacidade de carga sequencialmente células únicas. Também permite remoção da lise desacoplado post material celular e análise post com uma pipeta para análise usando outros métodos. Exemplos de análise subsequente incluiria PCR quantitativo em tempo real ou espectrometria de massa.
Um dos atuais gargalos para laboratórios que desejam tirar uma abordagem quantitativa para análise de proteínas de célula única é a alta barreira técnica e a necessidade de equipamento especializado. Com ADMs, miniaturizados, análises de alta sensibilidade podem ser alcançadas sem a necessidade de instalações de sala limpa fabricar aparelhos de laboratório-em-um-microplaqueta microfluidic. Experiências não são limitadas pelo design do chip e seu volume e posição podem ser alteradas sem a necessidade de fabricar novos mestres. Certamente, há espaço para melhoria em simplificando a técnica e diminuindo a barreira à entrada para a análise da única célula para apenas um microarrayer, para imprimir tanto anticorpo e microarrays da gota e um leitor de microplacas de fluorescência, a imagem.
Um número de aplicações clínicas da análise única célula é emergentes, particularmente no tratamento de câncer. Heterogeneidade de tumor é um grande desafio à quimioterapia eficaz. No desenvolvimento do tumor, mutações se manifestam com frequência crescente e heterogeneidade pode resultar em morfológica, genética e variabilidade do proteoma. Análise única célula é capaz de resolver a heterogeneidade celular dentro de um tumor e fornecer uma plataforma para ajudar a melhor compreender e prever a resistência e guia de terapia de droga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
ASR projetado experimentos, desenvolveu protocolos e analisados dados. SC e PS realizaram experimentos de tamanho de célula. ASR e OC escreveram o manuscrito. Os autores desejam reconhecer com gratidão o apoio do Prof David R. Klug para fornecer acesso a equipamentos. Os autores desejam agradecer a faculdade Imperial de Hackspace avançada para acesso às instalações de prototipagem e fabricação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM high glucose | Sigma | D6429 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| cell culture flasks | Corning | SIAL0639 | |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, UK | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Coverslips (Nexterion) | Schott, Europe | 1098523 | Size (mm): 65.0 x 25.0; Thickness (mm) 0.17 |
| p53 capture antibody | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detection antibody, Alexa Fluor 488 labelled | Santa Cruz | sc-126 | stock concentration 200μg/mL |
| Saline-sodium citrate buffer | Gibco | 15557-044 | |
| Betaine | Sigma | 61962 | |
| Sodium dodecyl sulphate | Sigma | L3771 | |
| 384 well plate (low volume) | Sigma | CLS4511 | |
| Nitrogen gas cylinder | BOC | Industrial grade, oxygen-free | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Droplets | |||
| Micromanipulator | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Manual Microinjector | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipette | Origio, Denmark | MBB-FP-L-0 | |
| Syringe pumps | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μL syringe | Hamilton | 81020 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| 1 mL syringe | Hamilton | 81327 | Gas tight, PTFE Luer lock |
| Silicone isolator | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 well silicone isolator with adhesive |
| Laser cutter | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | for laser cutting of custom isolators |
| 1mm thick acrylic sheet | Weatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | for laser cutting of custom isolators |
| Adhesive sheet | 3M | used to adhere custom isolators to microarrayed coverslips | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μm ID/360 μm OD fused silica tubing | IDEX | FS-115 | |
| 1.0 mm ID/1/16” OD PFA tubing | IDEX | 1503 | |
| 0.014” ID/0.062” OD PTFE tubing | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1.0 mm ID/2.0 mm OD FEP tubing | IDEX | 1673 | |
| Bovine Serum Albumen (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Ultra-pure water | Millipore, Germany | MilliQ | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy & Optics | |||
| TIRF microscope with encoded XY stage | Nikon, Japan | Nikon Ti-E | |
| EM-CCD | Andor Technologies, Ireland | IXON DU-897E | |
| Laser excitation source | Vortran, USA | Stradus 488-50 | |
| Optical lysis laser source | Continuum, USA | Surelite SLI-10 | |
| Microscope filter cube for TIRF | Chroma, USA | z488bp | |
| Microscope filter cube for Optical Lysis | Laser 2000, UK | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Fiji | Open Source | Image analysis software | |
| Matlab | Mathworks | version 7.14 or higher | Image analysis software |
References
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
- Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
- Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
- Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
- Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
- Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
- Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104 (2014).
- He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
- Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017 (2009).
- Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
- Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603 (2014).
- Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
- Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
- Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
- Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
- Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046 (2014).
- Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
- Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
- Yusof, A., et al.
- Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551 (2015).
- Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
- Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
- Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
- Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
- Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
- Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
- Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
- Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235 (2014).
